Summary
“
Abstract
如染色体组装，分离和胞质的细胞过程，本质上是动态的。时间推移活细胞成像，采用荧光标记的记者蛋白质或微分干涉对比（DIC）显微镜，允许这是从固定样本的分析1,2推断，否则这些动态事件的时间进展检查。此外，研究的细胞过程的发展规定，必须进行时间推移，在开发过程中的一个完整的有机体的实验。 Caenorhabiditis线虫胚胎是透明的光，具有快速，不变与发展计划的一个称为细胞谱系3，从而提供了一个理想的实验模型，为研究细胞生物学4,5 和发展6-9 的问题 。C。 线虫是不容修正，以正向遗传学（基于随机突变10,11）和反向遗传学针对特定的基因（基于RNAi介导的干扰和有针对性的诱变 12-15）的基因操纵。此外，转基因动物可以很容易的创建，以表达荧光标记蛋白质或记者 16,17 。这些特点结合起来，使其易于识别的基本细胞和发育过程的遗传途径调节 体内 18-21 。在这个协议中，我们目前 C.实时成像方法线虫胚胎上使用的复合啶显微镜DIC的光学或绿色荧光。我们展示了现成的显微镜，通常用于固定样本成像，还可以缓解时间推移，使用开放源码软件自动成像过程中的应用分析。
Protocol
蠕虫病毒的制备
- L4幼虫蠕虫传输到适当板18 - 24小时前成像22。这将确保你有鸡蛋供应充足，为早期胚胎轴承成人。
- 准备凡士林和琼脂糖管。我们准备在一个烧杯中的微波熔化的凡士林，并配发到每管4-5毫升等分几个15ML猎鹰管。同样融化2-3％（W / V）琼脂糖缓冲区（M9或鸡蛋缓冲液），等分4-5毫升到猎鹰管。要小心不要煮沸过剩，以最大限度地减少蒸发。成像当日，融化在65-70℃加热块1管凡士林和1琼脂糖管在微波炉中融化，再小心，尽量减少沸腾了。商店在加热块管，以保持在熔融状态下凡士林和琼脂糖。
- 设为琼脂糖垫。位置2指南幻灯片之间的新的显微镜幻灯片，这是由单一的普通实验室磁带坚持每个指南幻灯片的顶部和底部的一层覆盖的幻灯片。使用巴斯德吸管折断放在新的幻灯片2-3滴熔化琼脂糖结束。盖与第二幻灯片垂直于原始幻灯片，所以，它涵盖并有助于分散琼脂糖创建一个薄的方形垫。 第二届幻灯片休息以上的磁带上的指导幻灯片。琼脂糖的浓度可能会增加至5％，加厚垫。
- 使用解剖范围，铂丝“挑”，转让2成虫9 -12μL下降18毫米× 18毫米的盖玻片上的M9或蛋清缓冲区。
- 用针（我们使用27G1 / 2针）或手术刀释放胚胎切割蠕虫开放。试图切断蠕虫的中间。
- 降低到18 × 18毫米，含胚胎盖玻片琼脂糖垫（琼脂面朝下）。修剪琼脂用刀片盖玻片边缘延伸。
- 使用画笔或细木棍，适用于熔化的凡士林盖玻片四边密封盖玻片。
替代琼脂坐骑都挂滴23，如果胚胎受到的压力（即如果蛋壳不形成正确） 。影像也可以在子宫内 ，按照受精或的早期事件，如减数分裂。蠕虫应与左旋咪唑24麻醉。为了增加胚胎数量，从一个特殊的发展阶段几个蠕虫可能被解剖，在同一时间，轻轻地用细尖吸管或睫毛刷在一起定位的胚胎或经口吹打。
4D Nomarski DIC（微分干涉对比）电影
- 开启奥林巴斯BX61显微镜。由于相机其他设备发出的电磁波非常敏感，它是打开最后，汞灯泡（如果必要的绿色荧光蛋白或荧光）的第一。一旦一切都开始微经理。 DIC或荧光成像选择适当的配置文件。主要的区别是，DIC文件不包括荧光快门的控制。每个文件还可以选择适当的过滤立方体和摄像机的增益设置。
- 胚胎使用10倍的目标显微镜。为了得到成像领域内的多个胚胎，幼胚组寻找附近的蠕虫病毒机构。避免胚胎内最好的图像蠕虫。
- 使用软件切换到一个更高的放大倍率（40倍到100倍）和分辨率（NA为0.9至1.4）的目标成像。
- 调整Nomarski DIC的光学（以下网站包含有用的解释DIC的光学和术语; http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/dic/dichome.html
http://microscopy.berkeley.edu/Resources/instruction/DIC.html）- 在我们的奥林巴斯BX61的重要组成部分是：
- 偏光片 - 滑块下方的冷凝器
- 冷凝器Wollaston棱镜 - 炮塔上的冷凝器，略低于阶段。
- 目的Wollaston棱镜 - 滑块下面的过滤器的多维数据集
- 第二偏光器（仪） -过滤器多维数据集在DIC的位置
- 开关滤波器立方体DIC的位置在光线的路径（软件应该做的启动）分析仪（第二偏光镜） 。
- 确保这两个偏振片是正确对齐（交叉）。当两个沃拉斯顿棱镜光路的视野应该是黑暗的。如果有必要，旋转下面的冷凝器，偏光片，直到这是正确的。
- 插入的目标（上）Wollaston棱镜光路。
- 冷凝器的旋转炮塔，选择Wollaston棱镜您使用的是相匹配的目标。
- 低于这个炮塔调整的滑块，以配合镜头的NA。
- 聚焦最佳克勒照明冷凝器。
- 调整上沃拉斯顿PRISM，以获得最佳的对比度滑块旋转旋钮。
- 软件启动控制的其他设置包括摄像机的增益（设置为0），并切换为8位，16位TIFF文件保存文件。
- 在我们的奥林巴斯BX61的重要组成部分是：
- 调光的水平，以良好的形象。 （通常使用4.7伏）（通过软件控制）。我们宁愿照亮样本，所以，最亮的像素略低于饱和水平。
良好的DIC的光学，结果在一个三维的外观，在胚胎的卵黄颗粒清楚脱颖而出形象。另外这可谓仿佛照亮样品，似乎从某个角度照射，使样品的一面（或样品中的功能）亮起明亮，对面的阴影，并出现较深。 - 选择利息率（ROI）的地区，包括您想要的图像的胚胎，点击设定投资回报率，以减少窗口的按钮。
- 打开的多维采集窗口。选择的Z堆栈（片）和时间点。
- 使用显微镜对焦旋钮找到胚胎的底部（去年一些重点蛋黄颗粒焦平面）。点击选择底部。重复，以确定和设置胚胎顶部。我们通常使用1微米的步长和结束〜20焦平面。我们一般在每个时间点收集多个焦平面，因为胚胎和细胞都比较厚。此外，特别是当细胞开始划分在不同的方向，他们可以取代其他细胞在胚胎周围原焦平面或移动。如果您的显微镜没有对焦马达，您可以手动调整焦距按照您感兴趣的细胞或过程。
- 输入所需的时间点和时间间隔的数目。我们通常使用15秒的时间间隔，并设置了500个时间点的最大。我们开始有更多的时间比我们需要停止收购时所需。如果你是多个焦平面成像，确保有足够的时间获取所有时间点之间的时间间隔焦平面。
- 选择或创建一个位置来保存数据。确保该软件设置为只显示最后拍摄的影像。给文件命名，单击“获取”。监视器前几个时间点的自动图像采集，以确保其正常运行。
- 单击“停止”当你想停止采集，切换到10倍的目标，并准备下一张幻灯片。
- 当做成像光路中删除DIC的组件。必要时关闭目标的清洁油。打开关闭相机开始的一切。
GFP的电影
- 启动显微镜，上述发现胚胎。使用配置文件，其中包括荧光快门的软件控制。
- 确保不上DIC棱镜（滑块）在光路。
- 开关滤波器立方体FITC / GFP（启动时自动设置）
- 摄像机的增益为255，图像文件更改为16位TIFF（在这个配置文件启动时自动设置）。
- 关闭白光。
- 点击预览图像实时成像。快速地工作，以尽量减少光线照射。另外，使用捕捉图像收集单一的形象。
- 调整汞灯泡的功率/中性密度滤光片，曝光长度，获得了良好的形象。在一般情况下，你应该使用最小的光到达样品，以获取您想要的数据，以减少光损伤的细胞和漂白的荧光信号。
- 设置的时间间隔，时间点的数量和焦平面。我们经常使用5-10秒的时间间隔和1-3焦平面。
- 选择投资回报率和图像采集设置参数如前面描述的步骤13-19。
分析电影
- 数据将被保存到文件夹与您输入的名称，并包含一系列4D栈每个图像的TIFF文件，文本文件和一个XML文件包含元数据，如暴露水平和时间间隔。
- ImageJ通过两种方法可以打开TIFF图像。第一（方法一）是最简单的，也将读取每个文件的元数据。第二（方法二）能够使用虚拟内存来打开文件，比分配到ImageJ的内存量，但它不包括元数据。
- 利用微管理器插件
- 微观管理是建立在使用ImageJ（将不同，您可能以前安装的任何其他版本，它安装一个新版本的ImageJ），并包括一个插件来打开数据。另外，您可以复制到plugins文件夹的Micro-Manager-1.3/plugins文件夹中的内容为另一个版本ImageJ。
- 转到“插件”菜单，选择微经理，然后开微管理器文件。
- 选择该文件夹包含您要查看的数据，然后单击“确定”。
- 玩通过的Z和T尺寸。
- 使用位点plugiN打开BioFormats进口商的电影。
- 传输XML和TXT文件，包含TIFF文件的文件夹，重命名这两个文件的数据集的名称相匹配。
- 在ImageJ插件下拉菜单，选择位点，然后无论是数据的浏览器或生物格式进口商。
- 查找与您的TIFF栈文件夹。点击第一个TIFF文件，然后打开。
- 与Hyperstack栈。根据数据集组织，类似的名称交换尺寸：选择一组文件，并打开所有系列。在内存管理：选择：使用虚拟堆栈（特别是对于大型数据集）。点击ok
- 该插件将确定数据集的尺寸（＃时间点和焦平面），并显示<>括号之间的范围。单击确定或改变的时间点和/或焦平面打开数量。
- 确认每个系列对应的维度。
- 玩通过的Z和T尺寸。
- 利用微管理器插件
代表性的成果
从图1。Nomarski DIC的电影剧照说明年初三期间正常的细胞活动线虫胚胎发育：原核迁移（0-5:45），非对称第一师（6:45-14:45）和异步第二师（14:45-27:00） 。数据收集与60X 1.35 NA透镜。 20间隔1微米的焦平面收集每15秒与40微秒曝光。图像旋转，使后的权利和腹侧下降。比例尺代表10微米。
图2说明的GFP标记的染色体乘客复杂亚基（AIR - 2）在染色体上的早期后期（A至C），然后在后期出现的主轴midzone上，直到目前，从中期的动态变化从一个荧光电影剧照胞质完成（C至F）。数据收集与60X 1.35 NA透镜。一个单一的焦平面收集每隔10秒与50微秒曝光。图像旋转，因此，后是正确的。比例尺代表10微米。
电影1 Nomarski电影野生型的胚胎 。
电影相应的图1。后路是右下角和腹侧向左下方。显示一个单一的原始数据集焦平面。图片收集每15秒和回放设置在每秒14帧。 点击这里观看视频
野生型的胚胎表达GFP的荧光电影电影2：AIR - 2。
对应图2的电影。后路是向右上方。收集作为一个单一的焦平面的电影。图片收集每10秒和回放设置在每秒14帧。 点击这里观看视频
Discussion
居住时间推移成像的一个主要考虑的是保持细胞和有机体的完整性和可行性。 DIC的显微镜提供该样本是不能暴露在紫外线灯光照明光源过热的好处。非常适合DIC的显微镜检测细胞迁移和细胞形态的变化，如胞质，并确定一些亚细胞结构，如纺锤体和核膜。记者蛋白的荧光成像补充额外的亚细胞识别并允许特定蛋白质的可视化DIC的显微镜。为了减少光毒性和损害胚胎在荧光成像危害，我们通常会增加数码相机增益，以抵消减少紫外线灯的照明强度和持续时间。淡淡荧光的转基因记者，去卷积算法重新分配焦光或去模糊算法，以减少背景可以提高拍摄的图像质量。虽然有时是必要的，如共聚焦或多光子系统的先进的显微镜，我们发现，许多荧光记者可以使用此啶显微镜设置，产生高质量的图像进行成像。
微观管理（http://www.micro-manager.org），除了是免费的，直接TIFF格式保存的文件，而不是专有的文件格式，许多商业软件包。这大大简化了我们的数据分析，通过消除需要读ImageJ，Photoshop等图像编辑软件中的图像文件的文件转换步骤。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
内部机构的资金和在密歇根大学的生物科学学者计划支持这项工作。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Olympus BX61 microscope with Hamamatsu Orca-ER camera. 10x Plan Fluorite (NA 0.3) and 60x PlanAchromat (NA 1.35) objective lenses | Olympus Corporation | ||
| Micro-Manager 1.3.46 | Micro-Manager | http://www.micro-manager.org | |
| Image J 1.43 | http://rsbweb.nih.gov/ij | ||
| loci_tools.jar | http://www.loci.wisc.edu | ||
| Agarose - molecular biology/gel electrophoresis grade | |||
| Fisher Superfrost/Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Laboratory tape | Fisher Scientific | 15-901 | |
| 18 mm x 18 mm #1.5 coverslips | |||
| M9 (242 mM KH2PO4, 40 mM Na2HPO4, 9 mM g NaCl, 19 mM NH4Cl MgSO4) | |||
| (http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm). | |||
| Egg Buffer (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 25 mM HEPES, pH 7.3)25. | |||
| Vaseline | |||
| Brush/Stick | |||
| Razor blades | |||
| Heat block | |||
| Dissecting microscope | |||
| Worms22 | |||
| Platinum wire pick22 | |||
| 27G1/2 Precision Glide Needle or a scalpel with a small blade | BD Biosciences |
References
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