Summary
De
Abstract
Cellulaire processen, zoals chromosoom montage, segregatie en cytokinese, zijn inherent dynamisch. Time-lapse imaging van levende cellen, met behulp van fluorescent gelabelde reporter eiwitten of differentieel interferentie contrast (DIC) microscopie, maakt voor het onderzoek van de temporele progressie van deze dynamische gebeurtenissen die anders is afgeleid uit de analyse van vaste monsters 1,2. Bovendien is de studie van de ontwikkeling voorschriften van cellulaire processen noodzakelijk het uitvoeren van time-lapse experimenten op een intact organisme tijdens de ontwikkeling. De Caenorhabiditis elegans embryo is licht transparant en heeft een snelle, invariant ontwikkelings-programma met een bekende cellijn 3, en zo een ideaal experiment model voor het bestuderen van vragen in de celbiologie 4,5 en ontwikkeling 6-9. C. elegans is amendeerbaar aan genetische manipulatie door forward genetics (op basis van willekeurige mutagenese 10,11) en de reverse genetics om specifieke genen target (op basis van RNAi-gemedieerde interferentie en gerichte mutagenese 12-15). Daarnaast kunnen transgene dieren gemakkelijk worden gemaakt om fluorescent gelabelde eiwitten of verslaggevers 16,17 uit te drukken. Deze eigenschappen samen maken het gemakkelijk om de genetische paden reguleren fundamentele cellulaire en ontwikkelingsprocessen in vivo 18-21 te identificeren. In dit protocol stellen we methode's voor live beeldvorming van C. elegans embryo's met behulp van DIC optiek of GFP fluorescentie op samengestelde epifluorescerende microscoop. Tonen we aan het gemak waarmee direct beschikbaar microscopen, meestal gebruikt voor de vaste monster beeldvorming, ook kan worden toegepast voor time-lapse analyse met behulp van open-source software om de beeldvorming proces te automatiseren.
Protocol
Worm Voorbereiding
- Overdracht L4 larven wormen passende platen 18-24 uur voorafgaand aan de beeldvorming 22. Dit zal ervoor zorgen dat u ei-dragende volwassenen voor een ruim aanbod van vroege embryo's.
- Bereid buizen van vaseline en Agarose. We bereiden een aantal van 15 ml Falcon buizen door smelten Vaseline in een beker in de magnetron en de verstrekking in 4-5 ml aliquot per tube. Op dezelfde manier smelten 2-3% (w / v) Agarose in Buffer (M9 of Egg Buffer) en aliquot 4-5 ml in valk buizen. Wees voorzichtig aan de kook om het overtollige om verdamping te minimaliseren. Op de dag van imaging, een tube vaseline smelten in een 65-70 ° C hitte blok en smelt een tube van agarose in de magnetron, weer voorzichtig te minimaliseren overkoken. Bewaar de buisjes in de hitte blok naar de vaseline en de Agarose te houden in gesmolten toestand.
- Maak Agarose pad. Plaats een nieuw microscopie dia tussen twee dia's gids, die zijn dia's vallen onder een laag van het gemeenschappelijk laboratorium tape gehandeld op grond van de boven-en onderkant van elke gids dia. Gebruik een Pasteur pipet met het einde afgebroken tot 2-3 druppels gesmolten Agarose plaats op de nieuwe dia. Dek af met een 2 e schuif loodrecht op de oorspronkelijke dia, zodat zij bestrijkt en helpt om de Agarose verspreiden naar een dunne vierkante pad te creëren. De 2 e dia moet rusten boven de tape op de gids dia's. De Agarose concentratie kan worden verhoogd tot 5% voor dikkere pads.
- Met behulp van een dissectie bereik en een platina draad "pick", transfer twee volwassen wormen tot een 9-12μL daling van M9 of Egg Buffer op een 18 mm x 18 mm dekglaasje aan.
- Snijd wormen openen met een naald (we gebruiken 27G1 / 2 naalden) of scalpel om embryo's vrij te geven. Probeer te snijden in het midden van de worm.
- Lagere Agarose pad (met de agar kant naar beneden) op de 18x18 mm dekglaasje met de embryo's. Trim agar zich uitstrekt van de rand van het dekglas met een scheermesje.
- Seal Coverslip met behulp van een penseel of dunne houten stok aan de gesmolten vaseline van toepassing zijn op alle vier de randen van het dekglaasje.
Alternatief voor agar mounts zijn opknoping druppels 23 of embryo's zijn gevoelig voor druk (dwz als de eischaal niet goed vorm). Beeldvorming kan ook worden uitgevoerd in utero aan bevruchting of begin evenementen zoals de meiose te volgen. Wormen moet worden verdoofd met Levamisol 24. Om het aantal embryo's te verhogen van een bepaald stadium van ontwikkeling, kan een aantal wormen worden ontleed in een keer en de embryo's bij elkaar gepositioneerd voorzichtig met een fijn-tip pipet of een wimper borstel of via de mond pipetteren.
4D Nomarski DIC (differentieel interferentie contrast) Movies
- Zet de Olympus BX61 microscoop. Omdat de camera is gevoelig voor EM golven uitgezonden door andere apparaten is ingeschakeld op de laatste, het kwik lamp (indien nodig voor GFP of fluorescentie) eerst. Start Micro-Manager een keer alles op. Kies de juiste configuratie bestand voor DIC-of fluorescerende beeldvorming. Het grote verschil is dat het DIC bestand niet is opgenomen controle van TL-sluiter. Elk bestand selecteert ook de juiste filter kubus en de camera gain-instelling.
- Zoek embryo's op de microscoop met 10x objectief. Kijk eens in de buurt van worm lichamen voor groepen van jonge embryo's om meerdere embryo's te krijgen binnen het beeldveld. Voorkomen dat embryo's in de worm voor de beste foto's.
- Gebruik van de software te schakelen naar een hogere vergroting (40x tot 100x) en de resolutie (NA 0,9 tot 1,4) doelstelling voor beeldvorming.
- Pas Nomarski DIC Optics (De volgende websites bevatten nuttige uitleg van DIC optica en de terminologie; http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/dic/dichome.html
http://microscopy.berkeley.edu/Resources/instruction/DIC.html)- Op onze Olympus BX61 de belangrijkste componenten zijn:
- Polarisator - schuif onder de condensor
- Condensor Wollaston Prism - torentje op de condensor, net onder het podium.
- Doelstelling Wollaston Prism - schuifregelaar onder het filter blokjes
- 2 e Polarisatiefilter (Analyzer) - filter kubus in het DIC positie
- Schakelaar Filter Cube om DIC aan de Analyzer (2 e polarisator) positie in het licht pad (software moet dit doen bij het opstarten).
- Zorg ervoor dat de twee polarisatoren goed zijn uitgelijnd (gekruist). Wanneer beide Wollaston prisma's zijn uit het licht weg van het gezichtsveld te donker zijn. Indien nodig, draait u de polarisator onder de condensor tot deze correct is.
- Plaats de doelstelling (bovenste) Wollaston Prism in het licht pad.
- Draai de revolver op de condensor aan de Wollaston prisma, dat het doel u gebruikt te selecteren.
- Pas schuif onder deze koepel te NA wedstrijd van lens.
- Focus de condensor voor een optimale Koehler verlichting.
- Stel de bovenste Wollaston Prism tot een optimaal contrast te krijgen door het draaien van de knop op de slider.
- Andere instellingen aangestuurd door software opstarten onder meer camera te krijgen (ingesteld op 0) en overschakelen naar het opslaan van bestanden als 8-bits niet 16-bits TIFF-bestanden.
- Op onze Olympus BX61 de belangrijkste componenten zijn:
- Aan te passen lichtniveau om mooie foto te geven. (Meestal gebruik van 4,7 Volt) (geregeld via software). Wij geven de voorkeur aan het monster, zodat de helderste pixels zijn net onder verzadigingsniveaus verlichten.
Goede DIC optiek resulteert in een beeld met een 3-dimensionale kijken waar de dooier korrels in het embryo duidelijk opvallen. Als alternatief kan worden omschreven als het licht het verlichten van het monster blijkt te schijnen vanuit een hoek, zodat de ene kant van het monster (of functies in de steekproef) is helder verlicht en de andere kant is in de schaduw en lijkt donkerder. - Selecteer Region Of Interest (ROI) van de embryo's die u wilt om de afbeelding, klikt u instellen ROI-knop om het venster te verminderen.
- Open de multi-dimensionale overname venster. Selecteer Z-stacks (plakjes) en Time Points.
- Gebruik microscoop scherpstelknop naar de bodem van het embryo (laatste focal plane met een aantal dooier korrels in focus) te vinden. Klik op Select bodem. Herhaal dit om te identificeren en stel de top van het embryo. We meestal gebruik van een micron stapgrootte en eindigen met ~ 20 focale vliegtuigen. We verzamelen over het algemeen meerdere beeldvlakken op elk tijdstip, omdat de embryo's en cellen zijn relatief dik. Daarnaast vooral wanneer cellen beginnen te verdelen in verschillende richtingen kunnen ze verdringen andere cellen rond in het embryo verplaatsen in of uit de oorspronkelijke focal plane. Als uw microscoop geen focus motor kunt u handmatig de focus naar de cel of proces u geïnteresseerd bent te volgen.
- Input aantal tijd punten en tijdsinterval dat nodig is. We gebruiken meestal 15 seconden interval en stel een maximum van 500 punten de tijd. We beginnen met meer punten dan de tijd die we nodig hebben en stoppen met de overname indien gewenst. Als u meerdere beeldvorming centraal vliegtuigen, zorg ervoor dat er genoeg tijd om alle focale vliegtuigen in het interval tussen tijd moet verwerven.
- Selecteer of maak een locatie om de gegevens op te slaan. Zorg ervoor dat de software is ingesteld op laatste foto alleen weer te geven. Geef het bestand een naam en klik op Ophalen. Bewaken van de geautomatiseerde beeldacquisitie voor de eerste paar keer punten om te verzekeren dat het goed werkt.
- Klik op Stoppen wanneer u de overname te stoppen, overschakelen naar 10x objectief en voor te bereiden volgende dia.
- Als je klaar bent imaging verwijderen DIC onderdelen van het lichtpad. Schone olie uit doel indien nodig. Zet alles uit te beginnen met de camera.
GFP Movies
- Start microscoop en vind embryo's zoals hierboven. Gebruik configuratiebestand dat de software de controle van tl-sluiter omvat.
- Zorg ervoor dat de bovenste DIC prisma (slider) niet in het licht pad.
- Schakelaar Filter Cube om FITC / GFP (automatisch bij het opstarten)
- Verandering Camera te krijgen tot 255 en het beeld-bestand naar 16-bits Tiff (automatisch ingesteld bij het opstarten met deze configuratie bestand).
- Uit te schakelen wit licht.
- Klik live Imaging om een voorbeeld beeld. Werken snel aan het licht blootstelling te beperken. U kunt ook gebruik Snap afbeelding om enkel beeld te verzamelen.
- Pas Mercury lamp power / grijsfilters, blootstelling lengte om een goed beeld te krijgen. In het algemeen dient u minimaal licht die het monster op de gegevens die u wilt zonbeschadigde reduceren tot de cel en fotobleken van de fluorescentie signalen ontvangt.
- Stel tijdsinterval, aantal tijdstippen en het aantal van focale vliegtuigen. We maken vaak gebruik van 5-10 seconden intervallen en 1-3 focal plane.
- Selecteer ROI en stel de parameters voor het imago van acquisitie, zoals eerder in stap 13 tot 19 beschreven.
Het analyseren van films
- De gegevens zullen worden opgeslagen in de map met de naam die u ingevoerd en bevatten een reeks van tiff-bestanden voor elke afbeelding van de 4D-stack, een tekst-bestand en een XML-bestand met metadata, zoals blootstelling aan niveaus en tijdsintervallen.
- Het TIFF-beelden kunnen worden geopend door ImageJ via twee methodes. De eerste (methode a) is de eenvoudigste en leest ook de metadata van elk bestand. De tweede (methode b) is in staat om virtueel geheugen te gebruiken om bestanden die groter zijn dan de hoeveelheid geheugen toegewezen aan ImageJ openen, maar het omvat niet de metadata.
- Met behulp van micro-Manager Plugin
- Micro-Manager is gebouwd op en maakt gebruik van ImageJ (het installeert een nieuwe versie van ImageJ die zal verschillen van alle andere versie die u eerder hebt geïnstalleerd) en bevat een plugin om gegevens te openen. Als alternatief kunt u kopieert de inhoud van de Micro-Manager-1.3/plugins map naar de plugins map voor een andere versie van ImageJ.
- Ga naar Plugins menu, selecteer Micro-Manager en klik vervolgens op Openen Micro-Manager File.
- Selecteer de map met de gegevens die u wilt bekijken en klik op OK.
- Speel door de Z-en T-afmetingen.
- Met behulp van LOCI plugin om films te openen met BioFormats importeur.
- Breng de xml-en txt-bestanden uit de map met de TIFF-bestanden, en de naam van de twee bestanden naar de naam van de gegevensset wedstrijd.
- Binnen ImageJ, ga naar de Plugins pull-down menu, selecteer LOCI en vervolgens Data Browser of Bio-Formats Importer.
- Zoek de map met uw tiff stacks. Klik op de eerste TIFF-bestand, dan open.
- Bekijk stack met HyperStack. Onder Dataset organisatie: Selecteer Groep bestanden met dezelfde namen, Swap afmetingen en Open alle series. Onder Geheugen management: Selecteer: Gebruik virtuele stack (vooral voor grote data sets). Klik op ok
- De plugin zal bepalen de afmetingen van de gestelde data (# van tijd punten en focale vliegtuigen) en geef het bereik tussen een set van <> haakjes. Klik op OK of verandert het aantal tijdstippen en / of focale vliegtuigen te openen.
- Bevestigen welke dimensie komt overeen met iedere serie.
- Speel door de Z-en T-afmetingen.
- Met behulp van micro-Manager Plugin
Representatieve resultaten
Figuur 1. Stills uit een Nomarski DIC film illustreert een normale cellulaire gebeurtenissen tijdens de vroege C. elegans embryo-ontwikkeling: pronuclear migratie (0-5:45), asymmetrische eerste divisie (6:45-14:45) en asynchrone tweede divisie (14:45-27:00). De gegevens werden verzameld met een 60x 1,35 NA lens. 20 focale vliegtuigen op 1 micron intervallen werden verzameld om de 15 seconden met 40 microseconden blootstelling. Beelden werden zo gedraaid dat posterior is naar rechts en ventrale is naar beneden. Schaal Bar vertegenwoordigen 10 micron.
Figuur 2. Stills van een tl-film ter illustratie van de dynamische bewegingen van een GFP-gelabelde subunit van het chromosoom passagier complex (AIR-2) aanwezig op chromosomen van metafase vroeg anafase (A tot C) voordat ze worden weergegeven op de spindel Midzone in anafase tot cytokinese voltooit (C tot en met F). De gegevens werden verzameld met een 60x 1,35 NA lens. Een enkele focal plane werd verzameld om de 10 seconden met 50 μsec blootstelling. Beelden werden zo gedraaid dat posterior is aan de rechterkant. Schaal Bar vertegenwoordigen 10 micron.
Film 1 Nomarski Movie van wild-type Embryo.
Film overeenkomt met een figuur. Posterior is naar de rechter en ventrale is naar de onderste links. Toont een brandvlak van set originele gegevens. Beeld werd verzameld om de 15 seconden en af te spelen is vastgesteld op 14 frames per seconde. Klik hier om video te bekijken
Movie 2 Movie Fluorescerende van wild-type GFP embryo uitdrukken:: AIR-2.
Film die overeenkomt met figuur 2. Posterior is om de rechterbovenhoek. Film werd verzameld als een focal plane. Beeld werd verzameld om de 10 seconden en af te spelen is vastgesteld op 14 frames per seconde. Klik hier om video te bekijken
Discussion
Een belangrijke overweging voor live time-lapse imaging is het behouden van de integriteit en levensvatbaarheid van de cel en het organisme. DIC microscopie biedt het voordeel dat het monster niet wordt blootgesteld aan ultraviolet licht en overmatige verhitting van de lichtbron. DIC microscopie is goed geschikt voor celmigratie en celvorm veranderingen, zoals cytokinese te detecteren en tot op zekere subcellulaire structuren, zoals de mitotische spindel en de nucleaire membraan te identificeren. Fluorescentie beeldvorming van reporter eiwitten een aanvulling op DIC microscopie door het identificeren van bijkomende subcellulaire compartimenten en het toestaan visualisatie van specifieke eiwitten. Aan het verzachten van de gevaren van fototoxiciteit en schade aan het embryo tijdens de fluorescentie beeldvorming, we meestal verhoging van de digitale versterking van de camera aan op de lagere UV-licht intensiteit en de duur van de verlichting te compenseren. Voor zwakke tl-transgene verslaggevers, om deconvolutie algoritmen opnieuw toewijzen out-of-focus licht of deblurring algoritmen te verminderen achtergrond kan de kwaliteit van de opgenomen beelden te verbeteren. Terwijl de geavanceerde microscopen, zoals confocale of multifoton systemen zijn soms nodig, hebben we geconstateerd dat veel fluorescerende verslaggevers kunnen worden afgebeeld met behulp van dit epifluorescerende microscoop setup, waardoor beelden van hoge kwaliteit.
Micro-Manager (http://www.micro-manager.org), in aanvulling op vrij, slaat bestanden direct naar tiff-formaat in plaats van proprietary bestandsformaten van de vele commerciële software pakketten. Dit vereenvoudigt aanzienlijk de analyses van onze gegevens door het elimineren van het bestand conversie stap die nodig is om de beeldbestanden in ImageJ, Photoshop en andere beeldbewerkingsprogramma's te lezen.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Interne institutionele fondsen en de biologische wetenschappen Scholars Program aan de Universiteit van Michigan deze werkzaamheden ondersteund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Olympus BX61 microscope with Hamamatsu Orca-ER camera. 10x Plan Fluorite (NA 0.3) and 60x PlanAchromat (NA 1.35) objective lenses | Olympus Corporation | ||
| Micro-Manager 1.3.46 | Micro-Manager | http://www.micro-manager.org | |
| Image J 1.43 | http://rsbweb.nih.gov/ij | ||
| loci_tools.jar | http://www.loci.wisc.edu | ||
| Agarose - molecular biology/gel electrophoresis grade | |||
| Fisher Superfrost/Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Laboratory tape | Fisher Scientific | 15-901 | |
| 18 mm x 18 mm #1.5 coverslips | |||
| M9 (242 mM KH2PO4, 40 mM Na2HPO4, 9 mM g NaCl, 19 mM NH4Cl MgSO4) | |||
| (http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm). | |||
| Egg Buffer (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 25 mM HEPES, pH 7.3)25. | |||
| Vaseline | |||
| Brush/Stick | |||
| Razor blades | |||
| Heat block | |||
| Dissecting microscope | |||
| Worms22 | |||
| Platinum wire pick22 | |||
| 27G1/2 Precision Glide Needle or a scalpel with a small blade | BD Biosciences |
References
- Gerlich, D., Koch, B., Dupeux, F., Peters, J. M., Ellenberg, J. Live-cell imaging reveals a stable cohesin-chromatin interaction after but not before DNA replication. Curr Biol. 16, 1571-1578 (2006).
- Nabeshima, K. Dynamics of centromeres during metaphase-anaphase transition in fission yeast: Dis1 is implicated in force balance in metaphase bipolar spindle. Mol Biol Cell. 9, 3211-3225 (1998).
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Dev Biol. 100, 64-119 (1983).
- Oegema, K., Hyman, A. A. Cell division. WormBook. , 1-40 (2006).
- Heuvel, S. vanden Cell-cycle regulation. WormBook. , 1-16 (2005).
- Chisholm, A. D., Hardin, J. Epidermal morphogenesis. WormBook. , 1-22 (2005).
- Gonczy, P., Rose, L. S. Asymmetric cell division and axis formation in the embryo. WormBook. , 1-20 (2005).
- Nance, J., Lee, J. Y., Goldstein, B. Gastrulation in C. elegans. WormBook. , 1-13 (2005).
- Priess, J. R. Notch signaling in the C. elegans embryo. WormBook. , 1-16 (2005).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
- O'Connell, K. F., Leys, C. M., White, J. G. A genetic screen for temperature-sensitive cell-division mutants of Caenorhabditis elegans. Genetics. 149, 1303-1321 (1998).
- Fire, A. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans [see comments]. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Jansen, G., Hazendonk, E., Thijssen, K. L., Plasterk, R. H. Reverse genetics by chemical mutagenesis in Caenorhabditis elegans. Nat Genet. 17, 119-121 (1997).
- Liu, L. X. High-throughput isolation of Caenorhabditis elegans deletion mutants. Genome Res. 9, 859-867 (1999).
- Bazopoulou, D., Tavernarakis, N. The NemaGENETAG initiative: large scale transposon insertion gene-tagging in Caenorhabditis elegans. Genetica. 137, 39-46 (2009).
- Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics. 157, 1217-1226 (2001).
- Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Mol Cell Biol. 5, 3484-3496 (1985).
- Piano, F., Schetter, A. J., Mangone, M., Stein, L., Kemphues, K. J. RNAi analysis of genes expressed in the ovary of Caenorhabditis elegans. Curr Biol. 10, 1619-1622 (2000).
- Gonczy, P. Functional genomic analysis of cell division in C. elegans using RNAi of genes on chromosome III. Nature. 408, 331-336 (2000).
- Sonnichsen, B. Full-genome RNAi profiling of early embryogenesis in Caenorhabditis elegans. Nature. 434, 462-469 (2005).
- Mohler, W. A., Isaacson, A. B. Imaging embryonic development in Caenorhabditis elegans. Cold Spring Harb Protoc. , (2010).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Bembenek, J. N. Cortical granule exocytosis in C. elegans is regulated by cell cycle components including separase. Development. 134, 3837-3848 (2007).
- Poteryaev, D., Squirrell, J. M., Campbell, J. M., White, J. G., Spang, A. Involvement of the actin cytoskeleton and homotypic membrane fusion in ER dynamics in Caenorhabditis elegans. Mol Biol Cell. 16, 2139-2153 (2005).
- Bianchi, L., Driscoll, M. Culture of embryonic C. elegans cells for electrophysiological and pharmacological analyses. WormBook. , 1-15 (2006).
