Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Imagerie C. elegans Les embryons en utilisant un microscope à épifluorescence et de logiciels Open Source

doi: 10.3791/2625 Published: March 24, 2011

Summary

L'

Abstract

Processus cellulaires, telles que l'assemblage de chromosomes, la ségrégation et la cytokinèse, sont intrinsèquement dynamique. Time-lapse imagerie des cellules vivantes, en utilisant fluorescentes protéines marquées journaliste ou contraste d'interférence différentiel (DIC) microscope, permet à l'examen de la progression temporelle de ces événements dynamiques qui est par ailleurs déduire de l'analyse des échantillons 1,2 fixe. Par ailleurs, l'étude de la réglementation du développement des processus cellulaires nécessite la réalisation de temps-faute des expériences sur un organisme intact pendant le développement. L'embryon Caenorhabiditis elegans est transparent à la lumière et a un rapide, le programme invariant de développement avec une cellule connue lignée 3, offrant ainsi un modèle idéal pour étudier l'expérience des questions de biologie cellulaire et développement 4,5 6-9. C. elegans est modifiable à la manipulation génétique par l'avant génétique (basée sur la mutagenèse aléatoire 10,11) et la génétique inverse pour cibler des gènes spécifiques (basées sur l'ARNi à médiation interférences et ciblées mutagenèse 12-15). En outre, les animaux transgéniques peuvent être facilement créées pour exprimer des protéines par fluorescence étiqueté ou journalistes 16,17. Ces traits se combinent pour rendre plus facile d'identifier les voies génétiques de régulation de processus cellulaires fondamentaux et de développement in vivo 18-21. Dans ce protocole, nous présentons des méthodes pour l'imagerie en direct de C. embryons elegans utilisant l'optique DIC ou fluorescence de la GFP sur un microscope composé épifluorescence. Nous démontrons la facilité avec laquelle les microscopes facilement disponibles, généralement utilisé pour l'imagerie de l'échantillon fixe, peut également être appliquée pour les time-lapse analyse en utilisant des logiciels libres pour automatiser le processus d'imagerie.

Protocol

Préparation Worm

  1. Transfert vers L4 larvaires à des plaques appropriées 18-24h avant d'imagerie 22. Cela permettra d'assurer que vous avez œuvées adultes pour un approvisionnement suffisant d'embryons précoces.
  2. Préparer des tubes de vaseline et d'agarose. Nous préparons plusieurs tubes Falcon 15 ml par fusion dans un bécher de vaseline dans le micro-ondes et de distribution en aliquot 4-5 ml par tube. De même fondre 2-3% (p / v) agarose dans un tampon (Buffer M9 ou oeufs) et aliquot 4-5 ml dans des tubes Falcon. Attention à ne pas faire bouillir à l'excès afin de minimiser l'évaporation. Le jour de l'imagerie, faire fondre 1 tube de vaseline dans un bloc de 65-70 ° C chaleur et faire fondre 1 tube d'agarose dans le micro-ondes, encore une fois être prudent afin de minimiser bouillante sur. Stocker les tubes dans le bloc de chaleur pour maintenir la vaseline et l'agarose à l'état fondu.
  3. Faire Agarose pad. Position une lame de microscopie nouvelle entre deux glissières de guidage, qui sont des diapositives couvert par une seule couche de ruban laboratoire commun adhéré au haut et au bas de chaque diapositive guide. Utiliser une pipette Pasteur à bout rompu de placer 2-3 gouttes de fondue d'agarose sur la nouvelle diapositive. Couvrir avec une perpendiculaire 2 e diapositive à la diapositive originale, de sorte qu'il couvre et contribue à répandre l'agarose à créer un coussin mince carré. La diapositive 2 ème doit reposer au-dessus du ruban adhésif sur les diapositives guide. La concentration d'agarose peut être porté à 5% pour les plus épais coussinets.
  4. En utilisant un microscope à dissection et un fil de platine "pick", vers le transfert adulte 2 à une baisse de 9-12μL de tampon M9 ou d'oeufs sur une lamelle de 18 mm x 18 mm.
  5. Couper Worms Open avec une aiguille (nous utilisons 27G1 / 2 aiguilles) ou d'un scalpel pour libérer embryons. Essayez de couper au milieu du ver.
  6. Basse Agarose pad (avec le côté agar bas) sur la lamelle mm 18x18 contenant les embryons. Agar Garniture s'étendant depuis le bord de la lamelle avec une lame de rasoir.
  7. Recouvrir les phoques en utilisant un pinceau ou mince bâton de bois pour appliquer la vaseline fondue à toutes les quatre bords de la lamelle.

Alternative aux montages agar sont des gouttes pendantes 23 si les embryons sont sensibles à la pression (c'est à dire si la coquille d'oeuf ne se forme pas correctement). L'imagerie peut également être effectuée in utero à suivre la fécondation ou événements précoces tels que la méiose. Worms devrait être anesthésiés avec lévamisole 24. Afin d'augmenter le nombre d'embryons à partir d'un stade particulier de développement, plusieurs vers peuvent être disséqués en une seule fois et les embryons placés ensemble doucement avec une pointe fine pipette ou une brosse à cils ou par pipetage à la bouche.

4D Nomarski DIC (Contraste interférentiel différentiel) Films

  1. Allumez le microscope Olympus BX61. Parce que la caméra est sensible aux ondes EM émis par d'autres appareils, il est allumé dernière, l'ampoule au mercure (si nécessaire pour la GFP ou de fluorescence) en premier. Micro Start-Manager une fois que tout est en marche. Choisissez le fichier de configuration approprié pour l'imagerie DIC ou fluorescent. La différence majeure est que le fichier DIC ne comprend pas le contrôle de l'obturateur fluorescentes. Chaque fichier sélectionne également le cube filtre approprié et la mise en gain de la caméra.
  2. Trouver des embryons sur le microscope en utilisant l'objectif 10x. Rechercher près des organes ver pour des groupes de jeunes embryons afin d'obtenir plusieurs embryons dans le domaine de l'imagerie. Évitez les embryons à l'intérieur du ver pour obtenir les meilleurs images.
  3. Utilisation du commutateur logiciel à un plus fort grossissement (40x à 100x) et la résolution (NA 0,9 à 1,4) pour l'imagerie objective.
  4. Ajustez Nomarski Optique DIC (Les sites Web suivants contiennent des explications utiles de l'optique DIC et la terminologie; http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/dic/dichome.html
    http://microscopy.berkeley.edu/Resources/instruction/DIC.html)
    1. Sur notre Olympus BX61 les éléments importants sont:
      1. Polarisant - le curseur en bas du condenseur
      2. Condenseur de Wollaston Prism - tourelle sur le condenseur, juste en dessous de la scène.
      3. Objectif Wollaston Prism - curseur ci-dessous les cubes de filtre
      4. 2 ème Polarisant (Analyzer) - cube de filtre dans la position DIC
    2. Commutateur Cube filtre pour DIC à la position de l'analyseur (2 polariseur sd) dans le trajet de la lumière (le logiciel doit faire au démarrage).
    3. Assurez-vous que les deux polariseurs sont correctement alignés (croisé). Lorsque les deux prismes de Wollaston sont hors du trajet de la lumière du champ de vision doit être sombre. Si nécessaire, faites tourner le polariseur dessous du condenseur jusqu'à ce que ce sont correctes.
    4. Insérez l'objectif (supérieur) prisme de Wollaston dans le chemin de la lumière.
    5. Rotation de la tourelle sur le condenseur pour sélectionner le prisme de Wollaston qui correspond à l'objectif que vous utilisez.
    6. Ajustez le curseur en bas de cette tourelle pour correspondre NA de la lentille.
    7. Focus du condenseur pour Koehler éclairage optimal.
    8. Ajustez la partie supérieure de Wollaston PriSM pour obtenir un contraste optimal en tournant le bouton du curseur.
    9. Autres paramètres contrôlés par le démarrage du logiciel incluent gain de la caméra (à 0) et passer à l'enregistrement des fichiers de 8 bits pas des fichiers TIFF 16-bit.
  5. Ajuster le niveau de lumière pour donner belle image. (Généralement l'utilisation 4,7 volts) (via le logiciel). Nous préférons pour éclairer l'échantillon de sorte que les pixels les plus clairs sont juste en dessous des niveaux de saturation.
    Bonne DIC résultats optiques dans une image avec un regard en 3 dimensions où les granulés jaunes dans l'embryon se détachent nettement. Autrement cela peut être décrite comme si la lumière éclairant l'échantillon semble briller d'un angle de sorte qu'un côté de l'échantillon (ou des caractéristiques de l'échantillon) est bien éclairée et la face opposée est dans l'ombre et apparaît plus sombre.
  6. Sélectionnez une région d'intérêt (ROI) pour y inclure les embryons que vous voulez à l'image, cliquez sur le bouton SET ROI pour réduire la fenêtre.
  7. Ouvrez la fenêtre d'acquisition multi-dimensionnelle. Sélectionnez Z-piles (tranches) et points de temps.
  8. Utilisez le bouton concentrer microscope pour trouver le fond de l'embryon (dernière plan focal avec quelques granules jaunes au point). Cliquez sur Sélectionner en bas. Répéter à identifier et à définir le haut de l'embryon. Nous utilisons habituellement une taille de pas micron et se retrouver avec environ 20 plans focaux. En général, nous recueillons de multiples plans focaux à chaque point de temps, car les embryons et les cellules sont relativement épais. De plus particulièrement lorsque les cellules commencent à se diviser dans des orientations différentes, ils peuvent déplacer d'autres cellules dans l'embryon en les déplaçant dans ou hors du plan focal d'origine. Si votre microscope n'a pas de moteur de mise, vous pouvez régler manuellement la mise au point de suivre la cellule ou le processus qui vous intéresse.
  9. Certain nombre de points d'entrée du temps et l'intervalle de temps nécessaire. Nous utilisons habituellement 15 secondes d'intervalle et a fixé un maximum de 500 points de temps. Nous commençons par les points de temps plus que nous aurons besoin et d'arrêter l'acquisition si désiré. Si vous êtes d'imagerie multiples plans focaux, s'assurer qu'il ya suffisamment de temps pour acquérir la totalité des plans focaux dans l'intervalle entre les points de temps.
  10. Sélectionner ou créer un emplacement pour enregistrer les données. Assurez-vous que le logiciel est paramétré pour afficher la dernière image seulement. Donnez un nom au fichier et cliquez sur Acquérir. Surveiller l'acquisition automatique d'images pour les premiers points peu de temps pour s'assurer qu'il fonctionne correctement.
  11. Cliquez sur Stop lorsque vous souhaitez arrêter l'acquisition, l'objectif de passer à 10x et de préparer la diapositive suivante.
  12. Quand c'est fait enlever des composants d'imagerie DIC à partir du chemin de lumière. Nettoyez l'objectif d'huile si nécessaire. Tournez le tout hors tension à partir de la caméra.

Films GFP

  1. Démarrer microscope et trouver des embryons comme ci-dessus. Utiliser le fichier de configuration qui inclut le contrôle du logiciel de l'obturateur fluorescentes.
  2. Assurez-vous que le prisme supérieure DIC (slider) n'est pas dans le chemin de lumière.
  3. Commutateur Cube Filtre à FITC / GFP (automatiquement au démarrage)
  4. Changer gain de la caméra à 255 et le fichier image à 16 bits Tiff (automatiquement au démarrage avec ce fichier de configuration).
  5. Eteignez la lumière blanche.
  6. Cliquez sur Live imagerie à l'image de prévisualisation. Travaillez rapidement pour minimiser l'exposition lumineuse. Sinon, utiliser l'image Aligner à recueillir seule image.
  7. Ajuster la puissance ampoule au mercure / filtres de densité neutre, durée d'exposition pour obtenir une bonne image. En général, vous devez utiliser la lumière arrivant sur l'échantillon minimale pour acquérir les données que vous voulez réduire le photovieillissement de la cellule et photoblanchiment des signaux de fluorescence.
  8. Mettre en place intervalle de temps, le nombre de points dans le temps et le nombre de plans focaux. Nous utilisons souvent de 50 à 10 secondes d'intervalle et 1-3 plan focal.
  9. Sélectionnez le ROI et de définir les paramètres d'acquisition d'images tel que décrit plus tôt dans les étapes 13-19.

Films Analyse

  1. Les données seront sauvegardées dans le dossier avec le nom que vous avez entré et contiennent une série de fichiers TIFF pour chaque image de la pile de 4D, un fichier texte et un fichier XML contenant les métadonnées telles que les niveaux d'exposition et des intervalles de temps.
  2. Les images TIFF peuvent être ouverts par ImageJ par deux méthodes. La première (méthode a) est le plus simple et sera également lire les métadonnées de chaque fichier. La seconde (méthode b) est capable d'utiliser la mémoire virtuelle à ouvrir les fichiers qui sont plus grandes que la quantité de mémoire allouée à ImageJ, mais il n'inclut pas les métadonnées.
    1. Utilisant des micro-Plugin Manager
      1. Micro-Manager est construit sur et utilise ImageJ (il installe une nouvelle version d'ImageJ qui sera différent de toute autre version que vous pouvez avoir préalablement installé) et inclut un plugin pour ouvrir les données. Sinon, vous pouvez copier le contenu du dossier dans le dossier Micro-Manager-1.3/plugins plugins pour une autre version d'ImageJ.
      2. Aller au menu Plugins, sélectionnez Micro-Manager, puis Open File Micro-Manager.
      3. Sélectionnez le dossier contenant les données que vous souhaitez afficher et cliquez sur OK.
      4. Jouez à travers les dimensions Z et T.
    2. Utiliser LOCI plugiN pour ouvrir des films avec l'importateur BioFormats.
      1. Transfert des données XML et les fichiers txt du dossier contenant les fichiers TIFF, et renommer les deux fichiers pour correspondre au nom de l'ensemble des données.
      2. Dans ImageJ, aller à la Plugins menu déroulant, sélectionnez LOCI puis Data Browser soit ou Bio-formats importateur.
      3. Trouver le dossier avec vos piles TIFF. Cliquez sur le premier fichier TIFF, puis ouvrez.
      4. Voir la pile avec HyperStack. Sous l'organisation Dataset: Sélectionnez les fichiers de groupe avec des dimensions similaires Swap noms, et ouvert toute la série. Sous la gestion de la mémoire: Sélectionnez: Utiliser pile virtuelle (surtout pour les grands ensembles de données). Cliquez sur OK
      5. Le plugin va déterminer les dimensions de l'ensemble des données (nombre de points de temps et de plans focaux) et afficher la gamme entre un ensemble de <> entre parenthèses. Cliquez sur OK ou modifier le nombre de points de temps et / ou plans focaux pour l'ouvrir.
      6. Confirmer quelle dimension correspond à chaque série.
      7. Jouez à travers les dimensions Z et T.

Les résultats représentatifs

Figure 1
Stills Figure 1. Partir d'un film illustrant DIC Nomarski normale événements cellulaires au cours début C. développement de l'embryon elegans: migration pronucléaire (0-5:45), asymétrique première division (06 heures 45-14h45) et asynchrones de deuxième division (14:45-27:00). Les données ont été recueillies avec une lentille de 60x 1,35 NA. 20 plans focaux à intervalles de 1 micron ont été recueillies toutes les 15 secondes d'exposition avec 40 ms. Les images ont été tourné de telle sorte que postérieur est à la raison et ventrale vers le bas. Barre d'échelle représentent 10 microns.

Figure 2
Figure 2. Stills partir d'un film illustrant les fluorescents mouvements dynamiques d'un sous-GFP-étiquetée du complexe passagers chromosome (AIR-2) présents sur les chromosomes de métaphase anaphase au début (A à C) avant d'apparaître sur la zone médiane de la broche de l'anaphase jusqu'à ce cytokinèse complète (C à F). Les données ont été recueillies avec une lentille de 60x 1,35 NA. Un seul plan focal a été recueilli toutes les 10 secondes d'exposition avec 50 microsecondes. Les images ont été tourné de telle sorte que postérieur est à la droite. Barre d'échelle représentent 10 microns.

Film 1 Film Nomarski de type sauvage d'embryon.
Film correspondant à la figure 1. Postérieure est au fond à droite et ventrale est de la partie inférieure gauche. Affiche un seul plan focal de données originales. L'image a été recueilli toutes les 15 secondes et le jeu est de retour fixé à 14 images par seconde. Cliquez ici pour voir la vidéo

Film 2 Film fluorescent de type sauvage embryons exprimant la GFP:: AIR-2.
Film correspondant à la figure 2. Postérieur est à la droite supérieure. Film a été recueillie dans un seul plan focal. L'image a été recueilli toutes les 10 secondes et le jeu est de retour fixé à 14 images par seconde. Cliquez ici pour voir la vidéo

Discussion

Une considération importante pour vivre imagerie time-lapse est de préserver l'intégrité et la viabilité de la cellule et l'organisme. Microscopie DIC offre l'avantage que l'échantillon n'est pas exposée à la lumière ultraviolette et chauffage excessif de la source d'éclairage. Microscopie DIC est bien adapté pour détecter la migration cellulaire et les changements de forme cellulaire telles que la cytocinèse et d'identifier certaines structures subcellulaires, tels que le fuseau mitotique et la membrane nucléaire. L'imagerie de fluorescence des protéines reporters complète de microscopie DIC en identifiant d'autres compartiments subcellulaires et permettant la visualisation des protéines spécifiques. Pour atténuer les risques de phototoxicité et de dommages à l'embryon lors de l'imagerie de fluorescence, nous avons l'habitude d'augmenter le gain de la caméra numérique pour compenser la réduction de l'intensité des UV la lumière et la durée d'éclairement. Pour faibles fluorescentes journalistes transgéniques, les algorithmes de déconvolution pour réaffecter hors-focus algorithmes lumière ou déconvolution de réduire de fond peut améliorer la qualité des images capturées. Alors que les microscopes de pointe comme les systèmes confocale ou multiphotonique sont parfois nécessaires, nous avons constaté que de nombreux journalistes fluorescente peut être imagée en utilisant cette configuration microscope à épifluorescence, produisant des images de haute qualité.

Micro-Manager (http://www.micro-manager.org), en plus d'être gratuit, enregistre les fichiers directement au format TIFF au lieu de formats de fichiers propriétaires de nombreux logiciels commerciaux. Cela simplifie considérablement l'analyse de nos données en éliminant l'étape de conversion de fichiers nécessaires pour lire les fichiers image dans ImageJ, Photoshop et autres logiciels de retouche d'image.

Disclosures

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Acknowledgments

Interne des fonds institutionnels et les sciences biologiques Scholars Program à l'Université du Michigan ont soutenu ce travail.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Olympus BX61 microscope with Hamamatsu Orca-ER camera. 10x Plan Fluorite (NA 0.3) and 60x PlanAchromat (NA 1.35) objective lenses Olympus Corporation
Micro-Manager 1.3.46 Micro-Manager http://www.micro-manager.org
Image J 1.43 http://rsbweb.nih.gov/ij
loci_tools.jar http://www.loci.wisc.edu
Agarose - molecular biology/gel electrophoresis grade
Fisher Superfrost/Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Laboratory tape Fisher Scientific 15-901
18 mm x 18 mm #1.5 coverslips
M9 (242 mM KH2PO4, 40 mM Na2HPO4, 9 mM g NaCl, 19 mM NH4Cl MgSO4)
(http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm).
Egg Buffer (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 25 mM HEPES, pH 7.3)25.
Vaseline
Brush/Stick
Razor blades
Heat block
Dissecting microscope
Worms22
Platinum wire pick22
27G1/2 Precision Glide Needle or a scalpel with a small blade BD Biosciences

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gerlich, D., Koch, B., Dupeux, F., Peters, J. M., Ellenberg, J. Live-cell imaging reveals a stable cohesin-chromatin interaction after but not before DNA replication. Curr Biol. 16, 1571-1578 (2006).
  2. Nabeshima, K. Dynamics of centromeres during metaphase-anaphase transition in fission yeast: Dis1 is implicated in force balance in metaphase bipolar spindle. Mol Biol Cell. 9, 3211-3225 (1998).
  3. Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Dev Biol. 100, 64-119 (1983).
  4. Oegema, K., Hyman, A. A. Cell division. WormBook. 1-40 (2006).
  5. Heuvel, S. vanden Cell-cycle regulation. WormBook. 1-16 (2005).
  6. Chisholm, A. D., Hardin, J. Epidermal morphogenesis. WormBook. 1-22 (2005).
  7. Gonczy, P., Rose, L. S. Asymmetric cell division and axis formation in the embryo. WormBook. 1-20 (2005).
  8. Nance, J., Lee, J. Y., Goldstein, B. Gastrulation in C. elegans. WormBook. 1-13 (2005).
  9. Priess, J. R. Notch signaling in the C. elegans embryo. WormBook. 1-16 (2005).
  10. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  11. O'Connell, K. F., Leys, C. M., White, J. G. A genetic screen for temperature-sensitive cell-division mutants of Caenorhabditis elegans. Genetics. 149, 1303-1321 (1998).
  12. Fire, A. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans [see comments]. Nature. 391, 806-811 (1998).
  13. Jansen, G., Hazendonk, E., Thijssen, K. L., Plasterk, R. H. Reverse genetics by chemical mutagenesis in Caenorhabditis elegans. Nat Genet. 17, 119-121 (1997).
  14. Liu, L. X. High-throughput isolation of Caenorhabditis elegans deletion mutants. Genome Res. 9, 859-867 (1999).
  15. Bazopoulou, D., Tavernarakis, N. The NemaGENETAG initiative: large scale transposon insertion gene-tagging in Caenorhabditis elegans. Genetica. 137, 39-46 (2009).
  16. Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics. 157, 1217-1226 (2001).
  17. Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Mol Cell Biol. 5, 3484-3496 (1985).
  18. Piano, F., Schetter, A. J., Mangone, M., Stein, L., Kemphues, K. J. RNAi analysis of genes expressed in the ovary of Caenorhabditis elegans. Curr Biol. 10, 1619-1622 (2000).
  19. Gonczy, P. Functional genomic analysis of cell division in C. elegans using RNAi of genes on chromosome III. Nature. 408, 331-336 (2000).
  20. Sonnichsen, B. Full-genome RNAi profiling of early embryogenesis in Caenorhabditis elegans. Nature. 434, 462-469 (2005).
  21. Mohler, W. A., Isaacson, A. B. Imaging embryonic development in Caenorhabditis elegans. Cold Spring Harb Protoc. (2010).
  22. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. 1-11 (2006).
  23. Bembenek, J. N. Cortical granule exocytosis in C. elegans is regulated by cell cycle components including separase. Development. 134, 3837-3848 (2007).
  24. Poteryaev, D., Squirrell, J. M., Campbell, J. M., White, J. G., Spang, A. Involvement of the actin cytoskeleton and homotypic membrane fusion in ER dynamics in Caenorhabditis elegans. Mol Biol Cell. 16, 2139-2153 (2005).
  25. Bianchi, L., Driscoll, M. Culture of embryonic C. elegans cells for electrophysiological and pharmacological analyses. WormBook. 1-15 (2006).
Imagerie<em> C. elegans</em> Les embryons en utilisant un microscope à épifluorescence et de logiciels Open Source
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Verbrugghe, K. J. C., Chan, R. C. Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software. J. Vis. Exp. (49), e2625, doi:10.3791/2625 (2011).More

Verbrugghe, K. J. C., Chan, R. C. Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software. J. Vis. Exp. (49), e2625, doi:10.3791/2625 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter