Summary
Die
Abstract
Zelluläre Prozesse, wie Chromosom Montage, Segregation und Zytokinese, sind von Natur aus dynamisch. Zeitraffer-Imaging lebender Zellen mit Fluoreszenz-markierten Reporter-Proteine oder Differential-Interferenz-Kontrast (DIC) Mikroskopie ermöglicht die Untersuchung des zeitlichen Verlaufs dieser dynamischen Ereignissen, die sonst von der Analyse von festen Proben 1,2 abgeleitet wird. Darüber hinaus erfordert das Studium der Entwicklungs-Vorschriften von zellulären Prozessen Durchführung von Zeitraffer-Experimente an einem intakten Organismus während der Entwicklung. Die Caenorhabiditis elegans Embryo ist lichtdurchlässig und hat eine schnelle, invariant Entwicklungsprogramm mit einem bekannten Zelllinie 3, wodurch eine ideale Experiment Modell zum Studium der Fragen in der Zellbiologie 4,5 und Entwicklung 6-9. C. elegans ist änderbare zur genetischen Manipulation von vorne Genetik (basierend auf Zufallsmutagenese 10,11) und reversen Genetik an spezifische Gene Ziel (basierend auf RNAi-vermittelten Störungen und gezielte Mutagenese 12-15). Darüber hinaus können transgene Tiere leicht geschaffen werden, um Fluoreszenz-markierten Proteine oder Reporter 16,17 auszudrücken. Diese Eigenschaften verbinden, um es einfach um die genetischen Regulierung der grundlegenden zellulären und Entwicklungsprozesse in vivo 18-21 identifizieren. In diesem Protokoll präsentieren wir Methoden für die Live-Darstellung von C elegans Embryonen mit DIC-Optik oder GFP-Fluoreszenz auf eine Verbindung epifluoreszenten Mikroskop. Wir zeigen, mit welcher Leichtigkeit leicht verfügbar Mikroskope, typischerweise für festen Probe Bildgebung verwendet, auch für Zeitraffer-Analyse unter Verwendung von Open-Source-Software, um die Imaging-Prozess automatisieren können angewendet werden.
Protocol
Worm Vorbereitung
- Transfer-L4 Larvenstadien Würmer, geeignete Platten 18-24h vor der Aufnahme 22. Dies wird sicherstellen, dass Sie Ei-tragenden Erwachsenen für eine reichliche Versorgung von frühen Embryonen.
- Bereiten Tuben Vaseline und Agarose. Wir bereiten mehrere 15mL Falcon-Röhrchen durch Schmelzen Vaseline in einem Becherglas in die Mikrowelle und Abgabe in 4-5 mL Aliquot pro Röhre. Ebenso schmelzen 2-3% (w / v) Agarose in Puffer (M9 oder Egg Buffer) und aliquote 4-5 ml in Falcon-Röhrchen. Achten Sie darauf, um überschüssige kochen, um die Verdunstung zu minimieren. Am Tag der Bildgebung, schmelzen 1 Tube Vaseline in einem 65-70 ° C Heizblock und schmelzen 1 Tube Agarose in der Mikrowelle, wieder vorsichtig zu minimieren Überkochen. Bewahren Sie die Rohre in der Hitze Block auf die Vaseline und die Agarose in geschmolzenem Zustand zu halten.
- Machen Agarose-Pad. Position eine neue Mikroskopie slide zwischen 2 Führungsschlitten, die Dias durch eine einzige Schicht von gemeinsamen Labor beklebte nach oben und unten auf jeder Führungsschlitten abgedeckt sind. Verwenden Sie eine Pasteurpipette mit Ende off zu 2-3 Tropfen geschmolzenen Agarose auf der neuen Folie Stelle gebrochen. Abdeckung mit einer 2 nd Bild senkrecht zur Dia-Original, so dass es und deckt hilft, die Agarose Ausbreitung einer dünnen quadratischen Pad schaffen. Die 2 nd Folie sollte über dem Klebeband auf dem Führungsschlitten ruhen. Die Agarose-Konzentration auf 5% für dickere Pads erhöht werden.
- Mit einem Binokular und ein Platindraht "pick", Transfer 2 Erwachsene Würmer auf einen 9-12μL Tropfen M9 oder Egg Buffer auf einem 18 mm x 18 mm Deckglas.
- Cut Würmer öffnen mit einer Nadel (wir verwenden 27G1 / 2 Nadeln) oder Skalpell, um Embryonen freizugeben. Versuchen Sie, in der Mitte der Wurm abgeschnitten.
- Lower Agarose-Pad (mit dem Agar Seite nach unten) auf die 18x18 mm Deckglas mit den Embryonen. Trim-Agar, die sich von der Kante des Deckglases mit einer Rasierklinge.
- Seal Deckglas mit einem Pinsel oder dünnen Holzstäbchen in die geschmolzene Vaseline, um alle vier Kanten des Deckglases gelten.
Alternative zu Agar Reittiere sind hängende Tropfen 23, wenn Embryonen anfällig für Druck sind (dh wenn die Eierschale nicht richtig bilden). Imaging kann auch in utero durchgeführt werden, um die Befruchtung oder frühen Ereignisse wie die Meiose zu folgen. Worms sollte betäubt mit Levamisol 24. Um die Zahl der Embryonen, die von einem bestimmten Stadium der Entwicklung zu erhöhen, können mehrere Würmer auf einmal und die Embryonen zusammen vorsichtig mit einer feinen Spitze-Pipette oder eine Wimper Pinsel positioniert oder durch Pipettieren mit dem Mund seziert werden.
4D Nomarski DIC (Differential Interference Contrast) Movies
- Schalten Sie die Olympus BX61 Mikroskop. Da die Kamera ist empfindlich gegen elektromagnetische Wellen von anderen Geräten ausgesendet wird am letzten, die Quecksilberkugel (ggf. für GFP oder Fluoreszenz) zum ersten Mal eingeschaltet. Starten Micro-Manager einmal alles auf. Wählen Sie die entsprechende Konfigurationsdatei für DIC oder Fluoreszenz-Bildgebung. Der wesentliche Unterschied ist, dass die DIC-Datei enthält nicht die Kontrolle über fluoreszierende Verschlusszeit. Jede Datei wählt auch den entsprechenden Filter-Würfel und Kamera Gain-Einstellung.
- Suche Embryonen unter dem Mikroskop mit 10-fach Objektiv. Suche in der Nähe Wurm Stellen für Gruppen von jungen Embryonen, um mehrere Embryonen innerhalb der Imaging-Bereich zu bekommen. Vermeiden Embryonen innerhalb der Wurm für die besten Bilder.
- Mit dem Software-Schalter, um eine höhere Vergrößerung (40x bis 100x) und Auflösung (NA 0,9 bis 1,4) Ziel für die Bildgebung.
- Passen Nomarski DIC Optics (Die folgenden Websites enthalten hilfreiche Erklärung DIC-Optik und die Terminologie; http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/dic/dichome.html
http://microscopy.berkeley.edu/Resources/instruction/DIC.html)- Auf unserer Olympus BX61 die wichtigsten Komponenten sind:
- Polarizer - Schieberegler unterhalb des Kondensators
- Kondensator Wollaston-Prisma - Turm auf dem Kondensator, knapp unterhalb der Bühne.
- Ziel Wollaston-Prisma - Schieberegler unterhalb des Filterwürfel
- 2. Polarisator (Analyzer) - Filter Würfel in der DIC Position
- Schalten Filter Cube zu DIC dem Analyzer (2 nd Polarisator) in den Strahlengang (Software sollte diese beim Start tun) Position.
- Stellen Sie sicher, dass die beiden Polarisatoren richtig ausgerichtet sind (gekreuzt). Wenn beide Wollastonprismen außerhalb des Lichtweges das Sichtfeld sollte dunkel sein. Wenn nötig, drehen Sie den Polarisator unter dem Kondensor, bis diese korrekt ist.
- Legen Sie das Ziel (oberen) Wollaston-Prisma in den Strahlengang.
- Drehen Sie den Revolver auf den Kondensator der Wollaston-Prisma, dass das Ziel Sie mit Spielen wählen.
- Passen Schieberegler unterhalb dieser Revolver NA des Objektivs übereinstimmen.
- Fokus des Kondensators für eine optimale Koehler Beleuchtung.
- Stellen Sie die obere Wollaston Prism, um eine optimale Kontrast durch Drehen des Knopfes auf dem Schieber zu bekommen.
- Andere Einstellungen durch Software-Startup gesteuert werden, sind Kamera zu gewinnen (Wert 0) und wechseln Sie in das Speichern von Dateien als 8-Bit nicht 16-Bit-TIFF-Dateien.
- Auf unserer Olympus BX61 die wichtigsten Komponenten sind:
- Passen Sie Licht Ebene schönes Bild zu geben. (In der Regel verwenden 4,7 Volt) (gesteuert durch Software). Wir bevorzugen es, die Probe so, dass die hellsten Pixel direkt unter Sättigung sind zu beleuchten.
Gute DIC-Optik ergibt sich ein Bild mit einer 3-dimensionalen schauen, wo der Dotter in den Embryo deutlich abhebt. Alternativ kann dies beschrieben als ob das Licht Beleuchtung der Probe scheint aus einem Winkel leuchten, so dass die eine Seite der Probe (oder Funktionen in der Probe) ist hell und leuchtet die gegenüberliegende Seite in den Schatten und erscheint dunkler werden. - Wählen Sie Region Of Interest (ROI), um die Embryonen möchten Bild enthalten, klicken Sie auf Set ROI-Taste, um Fenster zu verkleinern.
- Öffnen Sie die mehrdimensionale Erfassung Fenster. Wählen Sie Z-Stapel (Scheiben) und Zeitpunkten.
- Verwenden Mikroskop Fokusknopf an der Unterseite des Embryos (letzte Brennebene mit einigen Dotterschollen im Fokus) zu finden. Klicken Sie auf Wählen Sie unten. Wiederholen, um zu ermitteln, und der Oberseite des Embryos. Wir verwenden normalerweise 1 Mikron Schrittweite und am Ende mit ~ 20 Fokusebenen. Wir sammeln in der Regel mehrere Fokusebenen zu jedem Zeitpunkt, da die Embryonen und Zellen relativ dick sind. Neben allem, wenn Zellen in unterschiedlichen Orientierungen teilen beginnen sie andere Zellen um verdrängen in den Embryo bewegt sie in die oder aus der ursprünglichen Fokalebene. Wenn Ihr Mikroskop keinen Fokus-Motor können Sie manuell den Fokus auf die Zelle oder Prozess, den Sie interessiert sind, folgen.
- Eingabe Anzahl von Zeitpunkten und Zeitintervall benötigt. Wir verwenden normalerweise 15 Sekunden-Intervall und legen Sie einen max von 500 Zeitpunkten. Wir beginnen mit mehr Zeitpunkten, als wir brauchen werde und stoppen den Erwerb, wenn gewünscht. Wenn Sie Imaging mehrere Fokusebenen sind, stellen Sie sicher, es ist genug Zeit, um all die Fokusebenen in dem Intervall zwischen den Zeitpunkten zu erwerben.
- Wählen oder erstellen Sie einen Speicherort für die Daten zu speichern. Stellen Sie sicher, dass die Software so eingestellt ist, letzte Bild nur angezeigt werden. Geben Sie der Datei einen Namen ein und klicken Sie übernimmt. Überwachen Sie die automatisierte Bildaufnahme für die ersten paar Mal Punkte, damit es richtig funktioniert.
- Klicken Sie auf Stop, wenn Sie auf den Erwerb beenden möchten, um 10-fach Objektiv wechseln und bereiten nächsten Folie.
- Wenn Sie fertig sind bildgebende entfernen DIC-Komponenten aus dem Strahlengang. Sauberes Öl aus objektiven, wenn nötig. Schalten Sie alles ab, beginnend mit der Kamera.
GFP Movies
- Starten Mikroskop und finden Embryonen wie oben beschrieben. Verwenden Konfigurationsdatei, die Software-Steuerung von Fluoreszenz-Shutter schließt.
- Stellen Sie sicher, dass der obere DIC-Prisma (Schieberegler) nicht in den Strahlengang.
- Schalten Filter Cube zu FITC / GFP (automatisch beim Start gesetzt)
- Ändern Kamera zu gewinnen, um 255 und Image-Datei auf 16-Bit-Tiff (automatisch beim Start mit dieser Konfigurationsdatei gesetzt).
- Schalten Sie weißes Licht.
- Klicken Sie auf Live Imaging, um Vorschau-Bild. Arbeiten Sie schnell ans Licht zu minimieren. Alternativ können Sie Snap-Image to einzelnes Bild zu sammeln.
- Passen Sie Mercury Lampe power / Neutralfilter, Belichtung Länge um ein gutes Bild zu bekommen. In der Regel sollten Sie mindestens Licht erreicht die Probe auf die gewünschten Daten zu Lichtschäden an der Zelle und Ausbleichen der Fluoreszenz-Signale zu reduzieren erwerben.
- Set up Zeitintervall, Anzahl der Zeitpunkte und die Anzahl der Fokusebenen. Wir verwenden oft 5-10 Sekunden Intervallen und 1-3 Brennebene.
- Wählen Sie ROI und Parameter für die Bildaufnahme, wie oben beschrieben in den Schritten 13-19.
Analysieren Movies
- Die Daten werden gespeichert, um mit den von Ihnen eingegebenen Namen Ordner und enthalten eine Reihe von TIFF-Dateien für jedes Bild der 4D-Stack, eine Textdatei und eine XML-Datei mit Metadaten wie Exposition und Zeitintervallen werden.
- Die TIFF-Bilder können von ImageJ über zwei Methoden geöffnet werden. Die erste (Methode a) ist die einfachste und lesen Sie auch die Metadaten der einzelnen Dateien. Die zweite (Methode b) ist in der Lage, den virtuellen Speicher verwenden, um Dateien, die größer als die Menge an Speicher zugewiesen ImageJ sind offen, aber es enthält nicht die Metadaten.
- Mit Micro-Manager Plugin
- Micro-Manager ist auf gebaut und verwendet ImageJ (es installiert eine neue Version von ImageJ, die sich von einer anderen Version, die Sie möglicherweise bereits installiert wird) und enthält ein Plugin, um Daten zu öffnen. Alternativ können Sie den Inhalt der Micro-Manager-1.3/plugins Ordner in den Plugin-Ordner kopieren für eine andere Version von ImageJ.
- Zum Plugins-Menü die Option Micro-Manager und dann öffnen Micro-Manager File.
- Wählen Sie den Ordner mit den Daten, die Sie anzeigen möchten, und klicken Sie auf OK.
- Spielen Sie sich durch die Z-und T-Dimensionen.
- Mit LOCI plugin, um Filme mit BioFormats Importer öffnen.
- Übertragen Sie die XML-und txt-Dateien aus dem Ordner mit den tiff-Dateien, und benennen Sie die beiden Dateien, um den Namen des Datensatzes übereinstimmen.
- Innerhalb ImageJ, um die Plugins gehen Pull-Down-Menü wählen Sie LOCI und dann entweder Data Browser oder Bio-Formate Importer.
- Suchen Sie den Ordner mit Ihrem tiff-Stacks. Klicken Sie auf den ersten tiff-Datei, dann öffnen.
- Zeige Stack mit HyperStack. Unter Dataset Organisation: Select Group Dateien mit ähnlichen Namen, Swap Abmessungen und Alle Serien öffnen. Unter Speicher-Management: Wählen Sie: Verwenden virtuellen Stack (vor allem für große Datenmengen). Klicken Sie auf ok
- Das Plugin wird bestimmen die Dimensionen des Datensatzes (Anzahl der Zeitpunkte und Brennebenen) und zeigt den Bereich zwischen einer Reihe von <> Klammern. Klicken Sie auf OK, oder ändern Sie die Anzahl der Zeitpunkte und / oder Fokusebenen zu öffnen.
- Bestätigen Sie die Dimension jeder Serie entspricht.
- Spielen Sie sich durch die Z-und T-Dimensionen.
- Mit Micro-Manager Plugin
Repräsentative Ergebnisse
Abbildung 1. Stills aus einem Nomarski DIC Film illustriert normalen zellulären Vorgänge während der frühen C. elegans Embryo-Entwicklung: pronukleären Migration (0-5:45), asymmetrische ersten Liga (6.45 bis 14.45 Uhr) und asynchrone Zweitligisten (14:45-27:00). Die Daten wurden mit einem 60x 1,35 NA Objektiv gesammelt. 20 Brennebenen bei 1 Mikrometer Abständen wurden alle 15 Sekunden mit 40 us Exposition gesammelt. Die Bilder wurden so gedreht, dass posterior wird nach rechts und ventral unten ist. Maßstabsbalken repräsentieren 10 Mikron.
Abbildung 2. Stills aus einem fluoreszierenden Film, der die dynamischen Bewegungen eines GFP-markierten Untereinheit des Chromosoms Passenger Complex (AIR-2) derzeit auf den Chromosomen von Metaphase zu frühen Anaphase (A bis C), bevor sie auf die Spindel Mittelbereich in Anaphase bis Zytokinese vervollständigt (C bis F). Die Daten wurden mit einem 60x 1,35 NA Objektiv gesammelt. Ein einziger Brennebene war alle 10 Sekunden mit 50 us Exposition gesammelt. Die Bilder wurden so gedreht, dass posterior ist auf der rechten Seite. Maßstabsbalken repräsentieren 10 Mikron.
Movie 1 Nomarski Film von Wild-Typ Embryo.
Film entsprechend 1 Abbildung. Posterior ist nach rechts unten und ventral an der unteren linken Seite. Zeigt einer gemeinsamen Brennebene der ursprünglichen Datenmenge. Das Bild wurde alle 15 Sekunden erfasst und wiedergegeben wird bei 14 Bildern pro Sekunde eingestellt. Klicken Sie hier, um Video zu sehen
Movie 2 Fluorescent Film von Wild-Typ Embryo, die GFP:: AIR-2.
Film entsprechend Abbildung 2. Posterior ist an der oberen rechten Seite. Film wurde als Single Brennebene gesammelt. Das Bild wurde alle 10 Sekunden erfasst und wiedergegeben wird bei 14 Bildern pro Sekunde eingestellt. Klicken Sie hier, um Video zu sehen
Discussion
Ein wesentlicher Gesichtspunkt für die Live-Time-Lapse-Bildgebung ist, um die Integrität und die Lebensfähigkeit der Zelle und den Organismus zu erhalten. DIC-Mikroskopie bietet den Vorteil, dass die Probe nicht mit ultraviolettem Licht und eine übermäßige Erwärmung der Lichtquelle ausgesetzt. DIC-Mikroskopie ist gut geeignet, um die Zellwanderung und Zellform Veränderungen wie Zytokinese zu erkennen und einige subzellulären Strukturen wie die mitotische Spindel und Kernmembran zu identifizieren. Fluoreszenz-Imaging von Reporter-Proteine ergänzt DIC-Mikroskopie durch die Identifizierung zusätzlicher subzellulären Kompartimenten und ermöglicht Visualisierung von spezifischen Proteinen. Zur Minderung der Gefahren von Phototoxizität und Schädigung des Embryos während der Fluoreszenz-Imaging, wir üblicherweise die digitale Verstärkung der Kamera, um das reduzierte UV-Licht Intensität und Dauer der Beleuchtung auszugleichen. Für schwache fluoreszierende transgenen Reporter, um Dekonvolutionsalgorithmen zuweisen out-of-focus-Licht oder Schärfungs Algorithmen zur Verringerung der Hintergrund kann die Qualität der aufgenommenen Bilder zu verbessern. Während Fortgeschrittene Mikroskope wie die konfokale oder Multiphotonen-Systeme manchmal notwendig sind, haben wir festgestellt, dass viele fluoreszierenden Reporter abgebildet werden können mit diesem Mikroskop epifluoreszenten Setup, wodurch Bilder von hoher Qualität sein.
Micro-Manager (http://www.micro-manager.org), abgesehen davon, dass freie, speichert Dateien direkt auf TIFF-Format anstelle von proprietären Dateiformaten von vielen kommerziellen Software-Paketen. Das vereinfacht die Analyse unserer Daten durch den Wegfall der Dateikonvertierung Schritt notwendig, um die Bilddateien in ImageJ, Photoshop und anderen Bildbearbeitungsprogrammen gelesen.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Interne institutionelle Fonds und der Biological Sciences Scholars Program an der University of Michigan unterstützt diese Arbeit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Olympus BX61 microscope with Hamamatsu Orca-ER camera. 10x Plan Fluorite (NA 0.3) and 60x PlanAchromat (NA 1.35) objective lenses | Olympus Corporation | ||
| Micro-Manager 1.3.46 | Micro-Manager | http://www.micro-manager.org | |
| Image J 1.43 | http://rsbweb.nih.gov/ij | ||
| loci_tools.jar | http://www.loci.wisc.edu | ||
| Agarose - molecular biology/gel electrophoresis grade | |||
| Fisher Superfrost/Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Laboratory tape | Fisher Scientific | 15-901 | |
| 18 mm x 18 mm #1.5 coverslips | |||
| M9 (242 mM KH2PO4, 40 mM Na2HPO4, 9 mM g NaCl, 19 mM NH4Cl MgSO4) | |||
| (http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm). | |||
| Egg Buffer (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 25 mM HEPES, pH 7.3)25. | |||
| Vaseline | |||
| Brush/Stick | |||
| Razor blades | |||
| Heat block | |||
| Dissecting microscope | |||
| Worms22 | |||
| Platinum wire pick22 | |||
| 27G1/2 Precision Glide Needle or a scalpel with a small blade | BD Biosciences |
References
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