Summary
Il
Abstract
Processi cellulari, come il montaggio dei cromosomi, segregazione e citocinesi, sono intrinsecamente dinamica. Time-lapse imaging di cellule viventi, mediante fluorescenza marcata proteine reporter o contrasto interferenziale differenziale (DIC) microscopia, consente per l'esame della progressione temporale di questi eventi dinamici che altrimenti è dedotto da analisi di campioni fisso 1,2. Inoltre, lo studio della normativa di sviluppo di processi cellulari rende necessario condurre esperimenti di time-lapse su un organismo intatto durante lo sviluppo. L'embrione Caenorhabiditis elegans è leggero trasparente ed ha un rapido programma di sviluppo invariante con una cella conosciuto lignaggio 3, fornendo così un modello ideale esperimento per lo studio delle domande di biologia cellulare e dello sviluppo 4,5 6-9. C. elegans è modificabile alla manipolazione genetica in avanti genetica (sulla base di mutagenesi casuale 10,11) e genetica inversa per indirizzare geni specifici (sulla base di RNAi mediato da interferenze e mirati mutagenesi 12-15). Inoltre, gli animali transgenici possono essere facilmente create per esprimere proteine fluorescenti tag o giornalisti 16,17. Queste caratteristiche si combinano per rendere più facile identificare i percorsi genetici che regolano processi cellulari fondamentali e dello sviluppo in vivo 18-21. In questo protocollo presenteremo i metodi per l'imaging dal vivo di C. embrioni elegans utilizzando ottiche DIC o fluorescenza GFP su un microscopio composto epifluorescente. Dimostriamo la facilità con cui microscopi prontamente disponibili, tipicamente utilizzato per l'imaging campione fisso, può essere applicato anche per time-lapse analisi utilizzando software open-source per automatizzare il processo di imaging.
Protocol
Worm Preparazione
- Trasferimento L4 vermi larve di piatti appropriato 18-24 ore prima di imaging 22. Questo vi assicurerà uovo portante adulti per un ampia offerta di embrioni ai primi stadi.
- Preparare i tubi di vaselina e agarosio. Prepariamo vari tubi falcon da 15 ml di fusione vaselina in un bicchiere nel forno a microonde e la distribuzione in aliquote 4-5 ml per provetta. Allo stesso modo si fondono 2-3% (w / v) in soluzione di agarosio (M9 o Egg Buffer) e un'aliquota 4-5 mL in tubi falco. Fare attenzione a non far bollire per eccesso al fine di ridurre al minimo l'evaporazione. Il giorno di imaging, si fondono 1 tubetto di vaselina in A ° 65-70 calore blocco C e sciogliere 1 tubo di agarosio nel forno a microonde, di nuovo fare attenzione a minimizzare bollente. Conservare le provette nel blocco di calore per mantenere la vaselina e la agarosio allo stato fuso.
- Fai Agarose pad. Posizionare una nuova diapositiva microscopia tra 2 scivoli guida, che sono scivoli coperti da un singolo strato di nastro di laboratorio comune aderito alla parte superiore e inferiore di ciascuna unità di guida. Utilizzare una pipetta Pasteur con la fine rotto di mettere 2-3 gocce di fuso agarosio sulla nuova diapositiva. Coprire con un perpendicolare 2 ° diapositiva alla diapositiva originale, in modo da coprire e aiuta a diffondere la agarosio per creare un rilievo sottile quadrato. Il 2 ° scivolo deve poggiare sopra il nastro nelle diapositive guida. La concentrazione di agarosio può essere aumentato al 5% per più spessi cuscinetti.
- Utilizzando un ambito sezionare e un filo di platino "pick", il trasferimento di due vermi adulti a 9-12μL goccia di tampone M9 o uovo su un mm 18 x 18 coprioggetto mm.
- Tagliare worm apre con un ago (usiamo 27G1 / 2 aghi) o bisturi per liberare gli embrioni. Provate a tagliare a metà del worm.
- Inferiore agarosio pad (con il lato agar verso il basso) sul coprioggetto 18x18 millimetri contenente gli embrioni. Agar Trim si estende dal bordo del vetrino con una lametta.
- Coverslip sigillo utilizzando un pennello o sottile bastone di legno per applicare la vaselina fuso per tutti e quattro i bordi del coprioggetto.
Alternative ai monti agar sono appesi gocce 23 se gli embrioni sono sensibili alla pressione (cioè se il guscio dell'uovo non si forma correttamente). L'imaging può essere eseguita anche in utero di seguire la fecondazione o eventi precoci come meiosi. Worms dovrebbe essere anestetizzato con Levamisolo 24. Al fine di aumentare il numero di embrioni da un particolare stadio di sviluppo, diversi worm può essere dissezionato in una sola volta e gli embrioni posizionato insieme delicatamente con un raffinato puntale o un pennello ciglia o pipette a bocca.
4D Nomarski DIC (Differential Interference Contrast) Video
- Accendere il microscopio Olympus BX61. Perché la fotocamera è sensibile alle onde EM emesse da altri dispositivi è acceso per ultimo, il bulbo di mercurio (se necessario per GFP o fluorescenza) per primo. Avviare Micro-Manager una volta che tutto è in funzione. Scegliere il file di configurazione appropriato per l'imaging DIC o fluorescenti. La differenza principale è che il file DIC non include il controllo di otturatore fluorescenti. Ogni file seleziona anche il cubo appropriato filtro e del guadagno della telecamera.
- Trova embrioni sul microscopio con obiettivo 10x. Guarda nelle vicinanze di corpi senza fine per i gruppi di giovani embrioni al fine di ottenere più embrioni nel campo dell'imaging. Evitare di embrioni all'interno del worm per i migliori immagini.
- Utilizzando l'interruttore software per un ingrandimento superiore (40x a 100x) e risoluzione (NA 0,9-1,4) obiettivo per l'imaging.
- Regolare Nomarski Ottica DIC (I seguenti siti web contengono spiegazione utile di ottica DIC e la terminologia; http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/dic/dichome.html
http://microscopy.berkeley.edu/Resources/instruction/DIC.html)- Sul nostro Olympus BX61 i componenti importanti sono:
- Polarizzatore - cursore sotto il condensatore
- Prism condensatore Wollaston - torretta sul condensatore, proprio sotto il palco.
- Obiettivo prisma Wollaston - cursore sotto i cubi filtro
- 2 ° polarizzatore (Analyzer) - cubo filtro nella posizione DIC
- Passa Cubo Filtro per DIC per posizionare il Analyzer (2 polarizzatore nd) nel percorso della luce (programma dovrebbe fare questo in fase di start up).
- Assicurarsi che i due polarizzatori sono allineati correttamente (incrociate). Quando entrambi i prismi di Wollaston sono fuori dal percorso della luce del campo di vista dovrebbe essere buio. Se necessario, ruotare il polarizzatore sotto il condensatore fino a quando questo è corretto.
- Inserire il (superiore) Prisma obiettivo Wollaston nel percorso della luce.
- Ruotare la torretta sul condensatore per selezionare il prisma Wollaston che corrisponde l'obiettivo si sta utilizzando.
- Regolare il cursore di sotto di questa torretta per abbinare NA della lente.
- Attenzione che il condensatore sia ottimale illuminazione Koehler.
- Regolare il superiore Wollaston Prism per ottenere un contrasto ottimale ruotando la manopola sul cursore.
- Altre impostazioni di avvio controllato da software includono guadagno della telecamera (impostato a 0) e passare al salvataggio dei file come 8-bit non 16-bit dei file tiff.
- Sul nostro Olympus BX61 i componenti importanti sono:
- Regolare il livello di luce per dare un'immagine piacevole. (Di solito usano 4,7 Volt) (controllato via software). Noi preferiamo per illuminare il campione in modo che i pixel più luminosi sono appena al di sotto dei livelli di saturazione.
Buoni risultati DIC ottica in un'immagine con un 3-dimensionale guardare dove i granuli di tuorlo nell'embrione si distinguono chiaramente. In alternativa può essere descritto come se la luce che illumina il campione sembra brillare da un angolo in modo che una parte del campione (o caratteristiche del campione) è acceso vivaci e il lato opposto è in ombra e appare più scura. - Seleziona regione di interesse (ROI) per includere gli embrioni si vuole l'immagine, fare clic sul pulsante di ROI per ridurre la finestra.
- Aprire il multi-dimensionale finestra di acquisizione. Seleziona Z-stack (fette) e punti di Tempo.
- Usa manopola di focus microscopio per trovare il fondo dell'embrione (ultimo piano focale con alcuni granuli di tuorlo a fuoco). Clicca in basso su Seleziona. Ripetere l'operazione per identificare e impostare la parte superiore dell 'embrione. Noi di solito uso 1 passo micron e finisce con circa 20 piani focali. In genere raccogliere molteplici piani focali ad ogni punto di tempo, perché gli embrioni e le cellule sono relativamente spesso. Inoltre soprattutto quando le cellule cominciano a dividersi in diversi orientamenti che possono spostare le altre cellule nell'embrione intorno movimento dentro o fuori del piano focale originale. Se il microscopio non ha un motore a fuoco è possibile regolare manualmente la messa a fuoco di seguire il cellulare o il processo si è interessati.
- Indicare il numero di punti di tempo e l'intervallo di tempo necessario. Noi di solito utilizzare intervallo di 15 secondi e impostare un max di 500 punti del tempo. Si comincia con gli intervalli di tempo più di quanto abbiamo bisogno e fermare l'acquisizione quando desiderato. Se siete di imaging più piani focali, assicurarsi che ci sia abbastanza tempo per acquisire tutti i piani focali nell'intervallo di tempo tra i punti.
- Selezionare o creare un percorso per salvare i dati. Assicurarsi che il software sia impostato per visualizzare solo l'ultima immagine. Dare un nome al file e fare clic su Acquisisci. Monitorare l'acquisizione automatica delle immagini per i primi punti poco tempo per assicurarsi che funzioni correttamente.
- Clicca fermare quando si desidera interrompere l'acquisizione, passare a obiettivo 10x e preparare diapositiva successiva.
- Una volta fatto l'imaging rimuovere i componenti DIC dal percorso della luce. Olio pulito fuori obiettivo, se necessario. Spegnere tutto a partire con la fotocamera.
GFP Film
- Avviare microscopio e trovare gli embrioni come sopra. Utilizzare file di configurazione che include software di controllo di otturatore fluorescenti.
- Assicurarsi che il prisma superiore DIC (slider) non si trova nel percorso della luce.
- Passa Cubo filtro per FITC / GFP (impostata automaticamente all'avvio)
- Variazione del guadagno telecamera a 255 e file di immagine TIFF a 16 bit (impostato automaticamente all'avvio con questo file di configurazione).
- Spegnere la luce bianca.
- Fare clic su Live Imaging a immagine di anteprima. Lavorare velocemente per ridurre al minimo l'esposizione alla luce. In alternativa utilizzare immagini Snap per raccogliere singola immagine.
- La regolazione della potenza della lampadina Mercury / filtri a densità neutra, tempo di esposizione per ottenere una buona immagine. In generale, si consiglia di utilizzare la luce minima di raggiungere il campione di acquisire i dati che si desidera ridurre fotodanneggiamento alla cella e photobleaching dei segnali di fluorescenza.
- Impostare l'intervallo di tempo, il numero di punti di tempo e numero di piani focali. Spesso usiamo gli intervalli di 50-10 secondi e 1-3 piano focale.
- Seleziona il ROI e impostare i parametri per l'acquisizione dell'immagine come descritto in precedenza in Piazza di 13-19.
Film analisi
- I dati verranno salvati nella cartella con il nome inserito e contengono una serie di file tiff per ogni immagine della pila 4D, un file di testo e un file XML contenente i metadati quali i livelli di esposizione e intervalli di tempo.
- Le immagini TIFF possono essere aperti da ImageJ attraverso due metodi. Il primo (metodo a) è il più semplice e anche leggere i metadati di ogni file. Il secondo (metodo b) è in grado di utilizzare la memoria virtuale per aprire i file che sono più grandi rispetto alla quantità di memoria allocata per ImageJ, ma non include i metadati.
- Utilizzando Micro-Plugin Manager
- Micro-Manager è costruito su e usa ImageJ (si installa una nuova versione di ImageJ, che sarà diverso da qualsiasi altra versione che potrebbe essere installato in precedenza) e include un plugin per aprire i dati. In alternativa è possibile copiare il contenuto della cartella Micro-Manager-1.3/plugins nella cartella plugins di un'altra versione di ImageJ.
- Vai al menu Plugin, selezionare Micro-Manager e quindi Aprire Micro-File Manager.
- Selezionare la cartella contenente i dati che si desidera visualizzare e fare clic su OK.
- Gioca attraverso le dimensioni Z e T.
- Utilizzando LOCI plugin per aprire i filmati con Importatore BioFormats.
- Trasferire i file xml e txt dalla cartella contenente i file tiff e rinominare i due file che corrisponda al nome del set di dati.
- All'interno di ImageJ, andare al Plugin menu a tendina, selezionare LOCI e poi o Browser dati o Bio-Formati Importatore.
- Trovare la cartella con il tuo stack tiff. Fare clic sul primo file tiff, quindi aprire.
- Visualizza stack con HyperStack. Sotto l'organizzazione del set di dati: selezionare i file di gruppo con dimensioni Swap nomi simili, e aperto tutte le serie. Sotto la gestione della memoria: Seleziona: Usa stack virtuale (in particolare per grandi insiemi di dati). Fare clic su OK
- Il plugin determinare le dimensioni del set di dati (numero di punti di tempo e di piani focali) e visualizzare l'intervallo tra una serie di <> parentesi. Fare clic su OK o alterare il numero dei punti di tempo e / o piani focali per aprire.
- Confermare quale dimensione corrisponde a ciascuna serie.
- Gioca attraverso le dimensioni Z e T.
- Utilizzando Micro-Plugin Manager
Rappresentante Risultati
Stills Figura 1. Da un filmato che illustra Nomarski DIC normale eventi cellulari nei primi mesi del C. elegans sviluppo embrionale: la migrazione pronucleo (0-5:45), prima divisione asimmetrica (6:45-14:45) e asincroni seconda divisione (14:45-27:00). I dati sono stati raccolti con una lente 60x 1,35 NA. 20 piani focali ad intervalli di 1 micron, sono stati raccolti ogni 15 secondi con 40 ms di esposizione. Le immagini sono state ruotate in modo che posteriore è a destra e ventrale è in basso. Bar scala rappresentano il 10 micron.
Figura 2. Stills da un film fluorescente che illustra i movimenti dinamici di una GFP-etichettata subunità del complesso passeggeri cromosoma (AIR-2) presenti sui cromosomi di metafase anafase a presto (dalla A alla C) prima di apparire sul midzone mandrino fino in anafase citocinesi completa (C a F). I dati sono stati raccolti con una lente 60x 1,35 NA. Un unico piano focale sono stati raccolti ogni 10 secondi con 50 l'esposizione msec. Le immagini sono state ruotate in modo che posteriore è a destra. Bar scala rappresentano il 10 micron.
Movie 1 Movie Nomarski di Wild-Type Embryo.
Film corrispondente alla figura 1. Posteriore è in fondo a destra e ventrale è in basso a sinistra. Mostra un unico piano focale di dati originale. Immagine è stato raccolto ogni 15 secondi e riprodurre è fissato a 14 fotogrammi al secondo. Clicca qui per vedere video
Movie 2 Film fluorescente di Wild-Type embrione che esprimono GFP:: AIR-2.
Film corrispondente alla Figura 2. Posteriore è in alto a destra. Film è stato raccolto come un unico piano focale. Immagine è stato raccolto ogni 10 secondi e riprodurre è fissato a 14 fotogrammi al secondo. Clicca qui per vedere video
Discussion
Una considerazione importante per vivere time-lapse imaging è quello di preservare l'integrità e la vitalità della cellula e dell'organismo. Microscopia DIC offre il vantaggio che il campione non è esposta alla luce ultravioletta e il riscaldamento eccessivo dalla fonte di illuminazione. Microscopia DIC ben si adatta a rilevare la migrazione cellulare e cambia la forma delle cellule, come citocinesi e di individuare alcune strutture subcellulari, come il fuso mitotico e la membrana nucleare. Imaging di fluorescenza di proteine giornalista integra microscopia DIC identificando ulteriori compartimenti subcellulari e consentendo la visualizzazione di proteine specifiche. Per mitigare i rischi di fototossicità e danni per l'embrione durante imaging di fluorescenza, di solito aumentare il guadagno digitale della fotocamera per compensare la ridotta intensità della luce UV e la durata di illuminazione. Per i deboli giornalisti transgenici fluorescenti, gli algoritmi di deconvoluzione per riassegnare out-of-focus algoritmi di luce o deblurring per ridurre sfondo può migliorare la qualità delle immagini catturate. Mentre i microscopi avanzate come i sistemi confocale o multiphoton a volte sono necessarie, abbiamo trovato che molti giornalisti fluorescenti possono essere ripreso questa impostazione epifluorescente microscopio, producendo immagini di alta qualità.
Micro-Manager (http://www.micro-manager.org), oltre ad essere gratuito, salva i file direttamente in formato tiff invece di formati di file proprietari di molti pacchetti software commerciali. Questo semplifica notevolmente le analisi dei nostri dati, eliminando la fase di conversione file necessario per leggere i file di immagine in ImageJ, Photoshop e altri software di editing delle immagini.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Interno fondi istituzionali e le scienze biologiche Programma studiosi della University of Michigan sostenuto questo lavoro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Olympus BX61 microscope with Hamamatsu Orca-ER camera. 10x Plan Fluorite (NA 0.3) and 60x PlanAchromat (NA 1.35) objective lenses | Olympus Corporation | ||
| Micro-Manager 1.3.46 | Micro-Manager | http://www.micro-manager.org | |
| Image J 1.43 | http://rsbweb.nih.gov/ij | ||
| loci_tools.jar | http://www.loci.wisc.edu | ||
| Agarose - molecular biology/gel electrophoresis grade | |||
| Fisher Superfrost/Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Laboratory tape | Fisher Scientific | 15-901 | |
| 18 mm x 18 mm #1.5 coverslips | |||
| M9 (242 mM KH2PO4, 40 mM Na2HPO4, 9 mM g NaCl, 19 mM NH4Cl MgSO4) | |||
| (http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm). | |||
| Egg Buffer (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 25 mM HEPES, pH 7.3)25. | |||
| Vaseline | |||
| Brush/Stick | |||
| Razor blades | |||
| Heat block | |||
| Dissecting microscope | |||
| Worms22 | |||
| Platinum wire pick22 | |||
| 27G1/2 Precision Glide Needle or a scalpel with a small blade | BD Biosciences |
References
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