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Biology

이미징 C. 엘레간스 태아

doi: 10.3791/2625 Published: March 24, 2011

Summary

Abstract

이러한 염색체 조립, 분리 및 cytokinesis로 휴대 프로세스는, 본질적으로 동적입니다. 형광 - 표시 기자 단백질 또는 차등 간섭 대비 (DIC) 현미경을 사용하여 살아있는 세포의 시간 저속 영상은, 그렇지 않으면 고정 샘플 1,2 분석에서 유추됩니다 이러한 동적 이벤트의 시간적 진행의 시험을 수 있습니다. 또한, 세포 프로세스의 개발 규제의 연구 개발 기간 동안 손상 유기체에서 시간 경과 실험을 실시하고 필요로. Caenorhabiditis 엘레간스 배아 따라서 4,5 및 개발 6-9 세포 생물학 질문을 공부에 이상적인 실험 모델을 제공 빛을 투명 3 혈통 알려진 세포와 빠른, 불변량 발달 프로그램을하고 있습니다. C.가 엘레간스 앞으로 유전학 (무작위 돌연변이 유발 10,11 기준)과 특정 유전자를 대상으로 역방향 유전학 (RNAi - 중재 간섭에 기초하고 돌연변이 유발 12-15 타겟)에 의해 유전자 조작을 수정할 수있는 것입니다. 또한, 유전자 변형 동물은 쉽게 찬란 태그 단백질이나 기자 16,17 표현을 만들 수 있습니다. 이러한 특징은 쉽게 생체내 18-21의 근본적인 세포 발달 과정을 조절 유전자 경로를 식별할 수 있도록 결합되어 있습니다. 이 프로토콜에서는 C. 라이브 이미징을위한 방법을 제시 복합 epifluorescent 현미경의 DIC 광학 또는 GFP의 형광을 사용하여 엘레간스의 배아. 우리는 일반적으로 고정 샘플 이미징에 사용되는 즉시 사용할 수 현미경은, 또한 이미징 프로세스를 자동화하기 위해 오픈 소스 소프트웨어를 사용 시간 저속 분석을 위해 적용할 수있는 쉽게 보여줍니다.

Protocol

웜 준비

  1. 이전 이미지 22 적절한 접시 18 24으로 L4 애벌레 벌레를 전송합니다. 이것은 초기 배아의 충분한 공급 달걀 베어링 성인을 보장합니다.
  2. 바셀린하고, 아가로 오스의 튜브를 준비합니다. 우리는 전자 레인지에서 비커에 바셀린을 용해하고 관 당 4-5 ML의 나누어지는으로 분배하여 여러 15mL 팰컨 튜브를 준비합니다. 마찬가지로 2-3% (W / V) 버퍼의 아가로 오스 (M9 또는 달걀 버퍼)와 팔콘 튜브로 나누어지는 4-5 ML을 용해. 증발을 최소화하기 위해 초과로 끓여야하지 않도록주의하십시오. 영상의 날, 65-70 ° C 열 블록에 바셀린 1 튜브를 녹으 전자렌지에 아가로 오스 1 튜브를 녹여 다시 끓어 최소화하기 위해주의하십시오. 용융 상태에 바셀린하고, 아가로 오스를 유지하는 열 블록에 튜브를 저장합니다.
  3. 아가로 오스 패드를 확인합니다. 각 가이​​드 슬라이드의 상단과 하단을 준수 일반적인 실험실 테이프의 단일 층으로 덮여 슬라이드 2 개의 가이드 슬라이드 사이에 새로운 현미경 슬라이드를 놓습니다. 새 슬라이드에 녹아 아가로 오스로부터 2-3 방울을 배치 부러 엔드와 파스퇴르 피펫을 사용합니다. 원본 슬라이드 2 슬라이드 직각와 커버, 그것이 포함하고 얇은 사각형 패드를 만들 수있는 아가로 오스를 확산하는 데 도움이되도록. 2 슬라이드 가이드 슬라이드에 테이프 위에 나머지해야합니다. 아가로 오스 농도가 두꺼운 패드 5 %의 증가 수 있습니다.
  4. 해부 범위와 백금 와이어를 사용하면 18mm X 18mm의 coverslip에 M9이나 에그 버퍼의 9 - 12μL 드롭, 전송이 성인 웜 "을 선택하십시오."
  5. 바늘 (우리가 27G1 / 2 바늘을 사용) 또는 배아를 공개 메스와 오픈 웜 컷. 웜 중간에 잘라보십시오.
  6. 배아를 포함하는 18x18 mm의 coverslip에 아가로 오스 패드 (아래 한천 사이드)를 낮춥니다. 트림 한천​​은 면도날로 커버 슬립의 가장자리에서 확장됩니다.
  7. coverslip 넷 모두의 가장자리에 녹아 바셀린을 적용하기 위해 페인트 또는 얇은 나무 스틱을 이용하여 인감 Coverslip.

(알 껍질이 제대로 형성되지 않는 경우 IE) 배아는 압력에 민감한있다면 달려있어 한천 마운트에 대안은 23 방울. 이미징는 수정이나 감수 분열과 같은 초기 이벤트를 따라 utero에서 수행할 수 있습니다. 웜는 Levamisole 24 anesthetized해야합니다. 개발의 특정 단계에서 배아의 수를 증가하기 위해서는 몇 가지 벌레 한 시간과 부드럽게 피펫 미세 팁 또는 속눈썹 브러쉬를 사용하여 함께 위치 배아 또는 입 pipetting에 의해 해부 수 있습니다.

4D Nomarski DIC (차등 간섭 대비) 영화

  1. 올림푸스 BX61 현미경을 켜십시오. 카메라가 다른 기기에 의해 방출 EM 파도에 민감하기 때문에 그것은 마지막으로, 수은 전구 (GFP 또는 형광 필요한 경우) 첫째 설정되어 있습니다. 모든가되면 마이크로 관리자를 시작합니다. DIC 또는 형광 이미징에 해당하는 구성 파일을 선택합니다. 주요 차이점은 DIC 파일 형광 셔터 제어를 포함하지 않는다는 것입니다. 각 파일은 해당 필터 큐브 및 카메라 이득 설정을 선택합니다.
  2. 10X 목표를 사용하여 현미경에서 배아를 찾습니다. 이미징 분야 내에서 여러 배아를 얻기 위해서 젊은 배아의 그룹에 대한 웜기구 근처보세요. 최고의 이미지에 대한 웜 내부 배아를 사용하지 마십시오.
  3. 목적은 이미징을 위해 (1.4 NA 0.9) 높은 배율 (100x로 40x)와 해상도로 소프트웨어 스위치를 사용합니다.
  4. ; Nomarski DIC 광학을 (다음 웹 사이트가 도움이 DIC 광학의 설명과 용어를 포함하는 조정 http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/dic/dichome.html
    http://microscopy.berkeley.edu/Resources/instruction/DIC.html)
    1. 우리 올림푸스 BX61에있는 중요한 구성 요소는 다음과 같습니다
      1. 편광판 - 콘덴서 아래의 슬라이더
      2. 콘덴서 월라스튼 프리즘 - 터렛 콘덴서에 그냥 무대 아래.
      3. 대상 월라스튼 프리즘 - 필터 큐브 아래의 슬라이더
      4. 2 편광판 (분석기) - DIC 위치에 필터 큐브
    2. 빛의 경로 (소프트웨어 시작이해야)의 분석 (2 편광자)를 위치 DIC에 필터 큐브를 전환합니다.
    3. 두 polarizers가 제대로 (교차) 정렬되었는지 확인합니다. 두 월라스튼 프리즘은 빛을 경로 밖에있는 경우보기의 필드는 어둠해야합니다. 필요한 경우이 정확한지 때까지 콘덴서 아래의 편광을 회전.
    4. 빛의 경로에 목표 (어퍼) 월라스튼 프리즘을 삽입합니다.
    5. 당신이 사용하고있는 목표를 일치 월라스튼 프리즘을 선택 콘덴서에 포탑을 회전합니다.
    6. 렌즈의 NA와 일치하도록이 포탑 아래의 슬라이더를 조정하십시오.
    7. 최적의 쾰러 조명을위한 콘덴서를 집중.
    8. 상단 월라스튼 PRI를 조정SM이 슬라이더에있는 손잡이를 회전하여 최적의 콘트라스트를 얻을 수 있습니다.
    9. 소프트웨어 시작에 의해 제어되는 다른 설정은 카메라의 이득 (0으로 설정)와 8 비트 아니라 16 비트 TIFF 파일로서 저장 파일에 스위치를 포함합니다.
  5. 좋은 이미지를주는 빛의 레벨을 조정합니다. (보통 4.7 볼트를 사용하는 () 소프트웨어를 통해 제어). 우리는 가장 밝은 픽셀 그냥 포화 수준 이하 있도록 예제를 조명하는 것을 선호합니다.
    배아의 노른자의 과립이 명확하게 눈에 띄는 3 차원 얼굴로 이미지에 좋은 DIC 광학 결과입니다. 예제를 조명 빛이 시료의 한쪽 (또는 표본의 기능)이 밝은 조명과 반대편은 그림자에 있으며 어두운 표시되도록 각도에서 빛나는하는 것으로 판단되는 경우 등 또는이 설명하실 수 있습니다.
  6. 이 이미지에 원하는 배아를 포함하는이자 (ROI)의 지역을 선택하고, 창문을 줄이기 위해 투자 수익 (ROI) 버튼을 설정을 누릅니다.
  7. 다차원 수집 창을 엽니다. Z - 스택 (조각)과 시간 포인트를 선택합니다.
  8. 배아의 하단 (초점의 일부 노른자의 과립 지난 초점 비행기)를 찾기 위해 현미경의 초점 노브를 사용하십시오. 선택 아래를 클릭하십시오. 배아의 정상을 확인하고 설정하는 반복합니다. 우리는 일반적으로 하나 마이크론 단계 크기를 사용하고 ~ 20 초점 비행기와 끝. 배아 및 세포가 상대적으로 두께가 있기 때문에 우리는 일반적으로 각각의 시점에서 여러 개의 초점 비행기를 수집합니다. 또한 세포가 서로 다른 방향으로 나누어 시작 특히 그들은 원래 초점 비행기 그들을 또는 밖으로 이동 배아에서 주변의 다른 세포를 치환 수 있습니다. 당신의 현미경이 초점 모터가없는 경우에는 수동으로 관심있는 셀 또는 프로세스를 따르도록 초점을 조정할 수 있습니다.
  9. 시간 지점과 시간 간격의 입력 번호가 필요합니다. 우리는 일반적으로 15초 간격을 사용하여 500 시간 포인트의 최대를 설정합니다. 원하는 때 우리가 인수를 필요로하고 중단 없을 정도로 우리는 더 많은 시간을 포인트로 시작합니다. 당신은 이미지 여러 초점 비행기있다면, 시간이 지점 사이의 간격에 초점 비행기의를 얻기위한 시간이 충분한지 확인하십시오.
  10. 데이터를 저장할 위치를 선택하거나 만듭니다. 소프트웨어에만 마지막으로 이미지를 표시하도록 설정되어 있는지 확인합니다. 파일 이름을주고 취득을 클릭합니다. 제대로 작동하기 위해 처음 몇 시간 지점에 대한 자동 이미지 수집을 모니터링합니다.
  11. 이 인수를 중지하려는 경우 중지를 클릭, 10X 목표로 전환하여 다음 슬라이드를 준비합니다.
  12. 완료되면 영상이 빛을 경로에서 DIC 구성 요소를 제거합니다. 객관적 필요한 경우 해제 깨끗한 기름. 카메라와 함께 시작을 모두 켭니다.

GFP 영화

  1. 현미경을 시작하고 위의 배아를 찾으십시오. 형광 셔터의 소프트웨어 제어를 포함 구성 파일을 사용합니다.
  2. 상단 DIC 프리즘 (슬라이더가) 빛 경로에 있지 않은지 확인합니다.
  3. FITC / GFP에 필터 큐브를 (자동으로 시작시 설정) 스위치
  4. 16 비트 TIFF (자동으로이 구성 파일과 함께 시작에서 설정)에 255 카메라 게인 및 이미지 파일을 변경합니다.
  5. 하얀 빛을 끄십시오.
  6. 미리보기 이미지 영상 라이브 클릭하십시오. 빛의 노출을 최소화하기 위해 신속하게 작동합니다. 또는 단일 이미지를 수집하는 스냅 이미지를 사용합니다.
  7. 수은 전구 전원 / 중성 농도 필터, 좋은 이미지를 얻을 노출 길이를 조정합니다. 일반적으로, 당신은 형광 신호의 셀을 클릭하고 photobleaching에 photodamage을 줄이기 위해 원하는 데이터를 얻기위한 샘플을 도달 최소 조명을 사용해야합니다.
  8. 시간 간격, 시간 포인트의 번호와 초점 비행기의 개수를 설정합니다. 우리는 종종 50~10초 간격과 1-3 초점 비행기를 사용합니다.
  9. 투자 수익 (ROI)을 선택하고 이전 단계 13-19에 설명된대로 이미지 수집을위한 매개 변수를 설정합니다.

분석 영화

  1. 데이터는 사용자가 입력한 이름으로 폴더와 4D 스택의 각 이미지를 TIFF 파일의 일련의 텍스트 파일과 노출 수준 및 시간 간격과 같은 XML 파일이 포함된 메타 데이터를 포함에 저장됩니다.
  2. TIFF 이미지는 두 가지 방법을 통해 ImageJ으로 열 수 있습니다. (방법) 첫 번째는 가장 간단한이며, 또한 각 파일의 메타 데이터를 읽습니다. (방법 B) 두 번째 ImageJ에 할당된 메모리의 양을보다 큰 파일을 열려면 가상 메모리를 사용할 수 있지만, 그것은 메타 데이터를 포함하지 않습니다.
    1. 마이크로 관리자 플러그인을 사용하여
      1. 마이크로 관리자에 구축하고 사용 ImageJ를 (이것은 당신이 이전에 설치된 수도 있습니다 그 밖의 다른 버전과 다를 수 있습니다 ImageJ의 새 버전을 설치) 및 데이터를 열 수있는 플러그인을 포함하고 있습니다. 또는 당신은 ImageJ의 다른 버전에 대한 플러그인 폴더로 Micro-Manager-1.3/plugins 폴더의 내용을 복사할 수 있습니다.
      2. , 플러그인 메뉴로 이동 마이크로 관리자를 선택한 다음 열기를 마이크로 관리자 파일입니다.
      3. 당신이 확인하고 확인을 클릭하여 원하는 데이터를 포함하는 폴더를 선택합니다.
      4. Z와 T 치수를 통해 재생할 수 있습니다.
    2. LOCI plugi를 사용하여BioFormats 가져오기와 함께 영화를 엽니다 N.
      1. TIFF 파일이 들어있는 폴더에서 XML과 TXT 파일을 전송하고, 데이터 집합의 이름과 일치하는 두 파일의 이름을 바꿉니다.
      2. ImageJ 내에서, 데이터 브라우저 또는 바이오 형식 수입 중 다음 플러그인으로 이동 풀다운 메뉴를, LOCI을 선택합니다.
      3. 귀하의 티파니 스택이있는 폴더를 찾습니다. 첫 번째 TIFF 파일을 클릭한 다음 엽니다.
      4. Hyperstack와 스택을 볼 수 있습니다. 데이터 집합 조직에서 유사 이름, 스왑 크기와 그룹 파일을 선택하고 모든 시리즈를 엽니다. 메모리 관리에서 선택 (특히 대용량 데이터 집합에 대한) 가상 스택을 사용합니다. 확인을 클릭합니다
      5. 플러그인 설정 데이터의 크기를 (# 시간 지점과 초점 비행기의) 확인하고 <> 괄호 집합 사이의 범위를 표시합니다. 확인을 클릭하거나 시간 지점 및 / 또는 열 초점 비행기의 수를 변경할 수 있습니다.
      6. 치수는 각 시리즈에 해당하는 확인합니다.
      7. Z와 T 치수를 통해 재생할 수 있습니다.

대표 결과

그림 1
Nomarski DIC 영화에서 그림 1. 스틸스 일찍 C. 동안 정상적인 세포 이벤트를 설명하는 엘레간스의 배아 개발 : pronuclear 마이 그 레이션 (0-5:45), 비대칭 1 부 (6시 45분부터 14시 45분까지)와 비동기 2 부 (14:45-27:00). 데이터는 60x 1.35 NA 렌즈로 수집했다. 하나 마이크론 간격 20 초점 비행기는 40 μs 노출과 함께 15 초마다를 수집했다. 그 뒷부분의 오른쪽 복부 아래입니다하므로 이미지 회전했다. 스케일 바는 10 미크론을 나타냅니다.

그림 2
그림 2. metaphase에서 초기 anaphase (A C)를 anaphase에서 스핀들 midzone에 게재되기 전에까지하는 염색체에 존재하는 염색체 여객 복합 GFP - 라벨 subunit (AIR - 2)의 역동적인 움직임을 설명하는 형광 영화에서 스틸 cytokinesis 완료 (F로 C). 데이터는 60x 1.35 NA 렌즈로 수집했다. 하나의 초점 평면은 50 μsec 노출 10 초마다를 수집했다. 그 뒷부분이 오른쪽으로되도록 이미지 회전했다. 스케일 바는 10 미크론을 나타냅니다.

와일드 타입 배의 영화 한 Nomarski 영화.
그림 1에 해당하는 영화. 뒷부분이 오른쪽 복부 아래로 것은 왼쪽 하단입니다. 설정 원본 데이터의 단일 초점 비행기를 표시합니다. 이미지가 매 15 초 수집되어 재생이 다시 초당 14 프레임으로 설정 것은. 비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오

GFP를 표현 야생 형 배아의 영화 두 형광등 영화 : AIR - 2.
그림 2에 해당하는 영화. 뒷부분은 오른쪽 상단에 있습니다. 영화는 하나의 초점 비행기로 수집했다. 이미지가 매 10 초 수집되어 재생이 다시 초당 14 프레임으로 설정 것은. 비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오

Discussion

라이브 시간 저속 영상을위한 주요 고려 사항은 세포와 유기체의 무결성과 생존을 보존하는 것입니다. DIC 현미경은 시료가 조명 소스에서 자외선 및 과도한 가열에 노출되지이라는 이점을 제공합니다. DIC 현미경은 세포를 마이 그 레이션과 같은 cytokinesis 같은 세포 모양의 변화를 감지하고 같은 mitotic 스핀들과 핵 막 같은 subcellular 구조를 식별하는 데 적합합니다. 기자 단백질의 형광 이미징 추가 subcellular 구획을 식별하고 특정 단백질의 시각화를함으로써 DIC 현미경을 보완합니다. phototoxicity 및 형광 이미징 동안 배아 손상의 위험을 완화하기 위해, 우리는 보통 감소 UV 조명 강도 및 조명 기간을 상쇄하기 위해 카메라의 디지털 게인을 향상시킬 수 있습니다. 희미한 형광 유전자 변형 기자 들면, deconvolution 알고리즘은 배경이 촬영된 이미지의 품질을 향상시킬 수 감소 밖의 포커스 라이트 또는 deblurring 알고리즘을 할당합니다. 이러한 공촛점 또는 multiphoton 시스템과 같은 고급 현미경 가끔 필요하지만, 우리는 많은 형광 기자가 고품질의 이미지를 항복이 epifluorescent 현미경 설정을 사용하여 몇 군데 수있는 것으로 나타났습니다.

마이크로 관리자 (http://www.micro-manager.org)은 무료로되고 이외에 직접 TIFF 형식으로 파일을 대신 많은 상용 소프트웨어 패키지의 독점 파일 형식을 저장합니다. 이것은 크게 ImageJ, 포토샵 및 기타 이미지 편집 소프트웨어에서 이미지 파일을 읽는 데 필요한 파일 변환 단계를 제거함으로써 데이터의 분석을 간소화합니다.

Disclosures

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

내부 기관 자금과 미시간 대학에서 생물 과학 학자 프로그램이 작업을 지원합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Olympus BX61 microscope with Hamamatsu Orca-ER camera. 10x Plan Fluorite (NA 0.3) and 60x PlanAchromat (NA 1.35) objective lenses Olympus Corporation
Micro-Manager 1.3.46 Micro-Manager http://www.micro-manager.org
Image J 1.43 http://rsbweb.nih.gov/ij
loci_tools.jar http://www.loci.wisc.edu
Agarose - molecular biology/gel electrophoresis grade
Fisher Superfrost/Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Laboratory tape Fisher Scientific 15-901
18 mm x 18 mm #1.5 coverslips
M9 (242 mM KH2PO4, 40 mM Na2HPO4, 9 mM g NaCl, 19 mM NH4Cl MgSO4)
(http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm).
Egg Buffer (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 25 mM HEPES, pH 7.3)25.
Vaseline
Brush/Stick
Razor blades
Heat block
Dissecting microscope
Worms22
Platinum wire pick22
27G1/2 Precision Glide Needle or a scalpel with a small blade BD Biosciences

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References

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이미징<em> C. 엘레간스</emEpifluorescent 현미경과 오픈 소스 소프트웨어를 사용> 태아
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Verbrugghe, K. J. C., Chan, R. C. Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software. J. Vis. Exp. (49), e2625, doi:10.3791/2625 (2011).More

Verbrugghe, K. J. C., Chan, R. C. Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software. J. Vis. Exp. (49), e2625, doi:10.3791/2625 (2011).

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