Summary
Den
Abstract
Cellulära processer, såsom kromosom montering, segregering och cytokines, är i sig dynamisk. Time-lapse avbildning av levande celler, med fluorescerande-märkt reporter proteiner eller differential interferens kontrast (DIC) mikroskopi, möjliggör granskning av den tidsmässiga utvecklingen av dessa dynamiska händelser som annars framgår av en analys av fasta prover 1,2. Dessutom kräver studier av utvecklings-förordningar i cellulära processer genomföra tidsförlopp experiment på en intakt organism under utveckling. Den Caenorhabiditis elegans embryot är lätt transparent och har en snabb, invariant utvecklande program med en känd cellsläktträd 3, vilket ger en idealisk experiment modell för att studera frågor inom cellbiologi 4,5 och utveckling 6-9. C. elegans kan ändras till genetisk manipulation av framåt genetik (baserat på slumpmässiga mutagenes 10,11) och omvänd genetik för att rikta specifika gener (baserat på RNAi-medierad störningar och riktade mutagenes 12-15). Dessutom kan transgena djur lätt skapas för att uttrycka fluorescerande taggade proteiner eller reportrar 16,17. Dessa egenskaper kombineras för att göra det enkelt att identifiera de genetiska signalvägar som reglerar cellens grundläggande och utvecklingsprocesser in vivo 18-21. I detta protokoll presenterar vi metoder för live avbildning av C. elegans embryon med DIC optik eller GFP fluorescens som sammansatt epifluorescent mikroskop. Vi visar hur enkelt det är lätt tillgänglig mikroskop, som normalt används för fast prov Imaging kan också användas för tidsförlopp analys med hjälp av öppen källkod för att automatisera imaging process.
Protocol
Worm Förberedelser
- Överför L4 larver maskar lämpliga plattor 18-24 timmar före avbildning 22. Detta kommer att säkerställa att du har ägg-bärande vuxna för en god tillgång på tidiga embryon.
- Förbered rör av vaselin och agaros. Vi förbereder flera 15ml falk rören genom att smälta vaselin i en bägare i mikrovågsugnen och utlämning till 4-5 mL alikvot per rör. Likaså smälta 2-3% (w / v) agaros i buffert (M9 eller Egg buffert) och alikvot 4-5 mL i falk rör. Var noga med att inte koka till överdrift för att minimera avdunstning. På dag för bildframställning, smälta en tub vaselin i 65-70 ° C värmeblock och smälta 1 tub agaros i mikron, återigen vara noga med att minimera kokar över. Förvara rören i värmeblock att hålla vaselin och agaros i smält tillstånd.
- Gör Agarose pad. Placera en ny mikroskopi bild mellan 2 guide diabilder, som glider omfattas av ett enda lager av gemensamma laboratorium tejp anslutit sig till toppen och botten av varje guide bild. Använd en pasteurpipett med slutet avbrytas för att placera 2-3 droppar av smält agaros på den nya bilden. Täck med en 2: a bild vinkelrätt mot den ursprungliga bilden, så att det täcker och hjälper till att sprida agaros att skapa en tunn square pad. Den 2: a bilden ska vila över tejpen på guiden bilderna. Den agaros koncentration kan höjas till 5% för tjockare kuddar.
- Med hjälp av en dissekera omfattning och en platinatråd "pick", överföring 2 vuxna maskar till en 9-12μL droppe M9 eller Egg buffert på en 18 mm x 18 mm täckglas.
- Skär maskar öppna med en nål (vi använder 27G1 / 2 nålar) eller skalpell för att frigöra embryon. Försök att skära i mitten av masken.
- Lägre agaros pad (med agar nedåt) på 18x18 mm täckglas innehåller embryon. Trim agar sträcker sig från kanten av locket glida med ett rakblad.
- Täta Täck med hjälp av en pensel eller smal träpinne att tillämpa smält vaselin till alla fyra kanterna på täckglas.
Alternativ till agar fästen hänger droppar 23 om embryon är känsliga för tryck (dvs. om äggskalet inte utgör ordentligt). Imaging kan också utföras i livmodern att följa befruktning eller början av händelser som meios. Maskar ska bedövas med levamisol 24. För att öka antalet embryon från en viss fas i utvecklingen, kan flera maskar skall dissekeras på en gång och embryona placeras tillsammans försiktigt med en fin spets pipett eller en ögonfrans borste eller genom munnen pipettering.
4D Nomarski DIC (Differential interferenskontrast) Filmer
- Slå på Olympus BX61 mikroskop. Eftersom kameran är känslig för EM vågor som avges från andra enheter den slås på sist, det kvicksilver lampa (om det behövs för GFP eller fluorescens) först. Starta Micro-Manager när allt är på. Välj lämpliga konfigurationsfilen för DIC eller fluorescerande avbildning. Den stora skillnaden är att DIC filen inte innehåller kontroll av fluorescerande slutare. Varje fil väljer också lämpligt filter kuben och kamera förstärkningsinställningen.
- Hitta embryon på mikroskopet med 10x objektiv. Titta nära mask organ för grupper av unga embryon för att få flera embryon inom imaging fältet. Undvik embryon inne i masken för bästa bilder.
- Med hjälp av programvaran byta till en högre förstoring (40x till 100x) och upplösning (NA 0,9 till 1,4) för avbildning mål.
- Justera Nomarski DIC optik (Följande webbplatser innehåller bra förklaring av DIC optik och terminologi, http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/dic/dichome.html
http://microscopy.berkeley.edu/Resources/instruction/DIC.html)- På vår Olympus BX61 viktiga komponenter är:
- Polarisator - reglaget under kondensorn
- Kondensor Wollaston Prism - torn på kondensorn, precis nedanför scenen.
- Mål Wollaston Prism - reglaget under filtret kuber
- 2: a Polariserande (Analyzer) - filter kub i DIC läge
- Växla filter Cube till DIC att placera Analyzer (2: a polarisator) i ljusstrålen (programvara bör göra detta vid start).
- Se till att de två polarisationsfilter är rätt anpassade (korsade). När båda Wollaston prismor av ljusstrålen synfältet ska vara mörka. Om det behövs, rotera polarisationsfiltret under kondensorn tills detta är korrekt.
- Sätt målet (övre) Wollaston Prism i ljusstrålen.
- Vrid tornet på kondensorn för att välja Wollaston prisma som matchar det mål du använder.
- Justera reglaget under detta torn för att matcha NA av objektiv.
- Fokusera kondensorn för optimal Koehler belysning.
- Justera den övre Wollaston PriSM för att få optimal kontrast genom att vrida på ratten på reglaget.
- Andra inställningar styrs av mjukvaran start inkluderar kamera vinst (inställd på 0) och byta till att spara filer som 8-bitars inte 16-bitars TIFF-filer.
- På vår Olympus BX61 viktiga komponenter är:
- Justera ljusnivå för att ge bra bild. (Brukar använda 4,7 Volt) (styrs via mjukvara). Vi föredrar att belysa provet så att den ljusaste pixlarna strax under mättnad.
Bra DIC optik ger en bild med en 3-dimensionell titta där gulan granulat i embryot framträder tydligt. Alternativt kan detta beskrivas som om ljuset lyser provet ser ut att skina från en vinkel så att ena sidan av provet (eller funktioner i provet) lyser starkt och den motsatta sidan finns i skuggorna och visas mörkare. - Välj regionen av intresse (ROI) till att även omfatta embryon som du vill bilden klickar in ROI-knappen för att minska fönster.
- Öppna den flerdimensionella förvärvet fönster. Välj Z-staplar (skivor) och poäng tid.
- Använd ratten mikroskop fokus att hitta botten av embryot (sista fokalplanet med några äggula granulat i fokus). Klicka på Välj botten. Upprepa för att identifiera och ställa upp i embryot. Vi använder vanligtvis en storlek mikron steg och sluta med ~ 20 fokalplan. Vi samlar i regel flera fokalplan vid varje tidpunkt eftersom embryon och celler är relativt tjock. Dessutom speciellt när celler börjar dela på olika inriktningar som de kan tränga undan andra celler runt i embryot att flytta dem in och ut av den ursprungliga fokalplanet. Om din mikroskop inte har ett fokus motorn kan du manuellt justera fokus att följa cellen eller process som du är intresserad.
- Ingång antal tidpunkter och tidsintervall behövs. Vi använder vanligtvis 15 sekunder intervall och ställa in en max 500 tidpunkter. Vi börjar med mer tid poäng än vi behöver och sluta förvärvet när så önskas. Är du imaging flera fokalplan, se till att det finns tillräckligt med tid att förvärva samtliga fokalplan i intervallet mellan tidpunkter.
- Välj eller skapa en plats att spara data. Se till att programvaran är inställd på att visa sista bilden bara. Ge filen ett namn och klicka på Hämta. Övervaka automatiserade bilden förvärvet för första gången pekar på att den fungerar ordentligt.
- Klicka på Stopp när du vill stoppa förvärvet, växla till 10x objektiv och förbereda nästa bild.
- När du är klar avbildning bort DIC komponenter från ljusstrålen. Ren olja utanför mål om det behövs. Stäng av allt som börjar med kameran.
GFP Filmer
- Starta mikroskop och hitta embryon som ovan. Använd konfigurationsfil som innehåller programvara kontroll av fluorescerande slutare.
- Se till att den övre DIC prisma (reglaget) är inte i ljusstrålen.
- Växla filter Cube till FITC / GFP (automatiskt vid start)
- Byt Kamera få till 255 och bildfil till 16-bitars TIFF (automatiskt in vid start med denna konfiguration fil).
- Stäng av vitt ljus.
- Klicka Live Imaging för att förhandsgranska bilden. Arbeta snabbt för att minimera ljus. Alternativt använder Snap på bilden för att samla enda bild.
- Justera Kvicksilver lampa ström / neutral filter densitet, exponering längd för att få en bra bild. I allmänhet bör du använda minst ljus som når provet inhämta de uppgifter du vill minska fotoskador till cellen och fotoblekning av fluorescens signaler.
- Ställ in tidsintervall, antal tidpunkter och antalet fokalplan. Vi använder ofta 5-10 sekunders intervall och 1-3 fokalplan.
- Välj ROI och ställa in parametrar för bildtagning som tidigare beskrivits i steg 13-19.
Analysera filmer
- Uppgifterna kommer att sparas i mappen med det namn du har angett och innehåller en rad TIFF-filer för varje bild av 4D stacken, en textfil och en XML-fil som innehåller metadata som exponeringsnivåer och tidsintervaller.
- TIFF-bilder kan öppnas genom ImageJ via två metoder. Den första (metod A) är den enklaste och kommer också att läsa metadata för varje fil. Den andra (metod b) kan använda virtuellt minne för att öppna filer som är större än den mängd minne som tilldelas ImageJ, men det inkluderar inte metadata.
- Med en mikro-Manager Plugin
- Micro-Manager är byggd på och använder ImageJ (det installerar en ny version av ImageJ som kommer att vara annorlunda än någon annan version som du tidigare har installerat) och inkluderar en plugin för att öppna data. Alternativt kan du kopiera innehållet i Micro-Manager-1.3/plugins mappen till plugins mappen för en annan version av ImageJ.
- Gå till Plugins-menyn, välj Micro-Manager och därefter Öppna Micro-Manager fil.
- Välj den mapp som innehåller de data du vill visa och klickar ok.
- Spela via Z-och T-dimensioner.
- Använda loci plugiN för att öppna filmer med BioFormats Importör.
- Överför XML-och txt-filer från mappen som innehåller TIFF-filer och byta namn på de två filerna för att matcha namnet på datamängden.
- Inom ImageJ, gå till Plugins rullgardinsmenyn, välj lokus och sedan antingen Data webbläsare eller Bio-format Importör.
- Leta reda på mappen med din tiff stackar. Klicka på första TIFF-filen och öppna sedan.
- Visa stack med HyperStack. Under Dataset organisation: Välj Gruppera filer med liknande namn, Pendla dimensioner och Öppna alla serier. Under Minneshantering: Välj: Använd virtuell stack (särskilt för stora datamängder). Klicka på OK
- Insticksprogrammet kommer att bestämma dimensioner som data (# av tidpunkter och fokalplan) och visa varierar mellan ett antal <> parentes. Klicka på OK eller ändra antalet tidpunkter och / eller fokala plan för att öppna.
- Bekräfta vilken dimension motsvarar varje serie.
- Spela via Z-och T-dimensioner.
- Med en mikro-Manager Plugin
Representativa resultat
Figur 1. Stillbilder från en Nomarski DIC film som illustrerar normala cellulära händelser under början av C. elegans embryo utveckling: pronuclear migration (0-5:45), asymmetrisk första divisionen (6:45 till 14:45) och asynkrona andra divisionen (14:45-27:00). Data samlades in med en 60x 1,35 NA-lins. 20 fokalplan på 1 mikron mellanrum samlades in var 15 sekunder med 40 ìs exponering. Bilderna var roteras så att bakre är till höger och ventrala är nere. Skala Bar representerar 10 mikrometer.
Figur 2. Stillbilder från en fluorescerande film som illustrerar den dynamiska rörelser en GFP-märkta subenheten av kromosom passagerare komplex (AIR-2) som finns på kromosomerna från metafas till tidig anafas (A till C) innan de visas på spindeln mellanzonen i anafas tills cytokines klar (C till F). Data samlades in med en 60x 1,35 NA-lins. En enda fokalplan samlades in var 10 sekunder med 50 μsec exponering. Bilderna var roteras så att bakre är till höger. Skala Bar representerar 10 mikrometer.
Film 1 Nomarski Film på vildtyp embryo.
Film motsvarande figur 1. Bakre är att längst ner till höger och ventrala är att det nedre vänstra. Visar en enda fokalplan ursprungliga uppsättning data. Bild samlades in var 15 sekund och spela upp är satt till 14 bilder per sekund. Klicka här för att se på video
Film 2 Fluorescerande Film på vildtyp embryo som uttrycker GFP:: AIR-2.
Film motsvarande figur 2. Bakre är att det övre högra. Movie samlades in som en enda fokalplan. Bild samlades in var 10 sekunder och spela upp är satt till 14 bilder per sekund. Klicka här för att se på video
Discussion
En viktig fråga för live time-lapse avbildning är att bevara integritet och livskraft cellen och organismen. DIC mikroskopi ger fördelen att provet inte utsätts för ultraviolett ljus och hög värme från belysning källa. DIC mikroskopi är väl lämpad att upptäcka cell migration och cell ändrar form som cytokines och att identifiera några subcellulära strukturer, såsom mitotiska spindeln och nukleära membranet. Fluorescens avbildning av reportern proteiner kompletterar DIC mikroskopi genom att identifiera ytterligare subcellulära fack och möjliggör visualisering av specifika proteiner. För att minska riskerna med fototoxicitet och skador på fostret under fluorescens avbildning ökar vi vanligtvis digitala vinst på kameran för att kompensera minskad intensitet UV-ljus och varaktighet belysning. För svagt fluorescerande transgena reportrar, att deconvolution algoritmer omfördela out-of-fokus ljus eller deblurring algoritmer för att minska bakgrund kan förbättra kvaliteten på de tagna bilderna. Medan avancerade mikroskop som konfokala eller multiphoton system är ibland nödvändigt, har vi funnit att många fluorescerande reportrar kan avbildas med detta epifluorescent mikroskop inställning, vilket ger högkvalitativa bilder.
Micro-Manager (http://www.micro-manager.org), förutom att vara fri, sparar filer direkt till TIFF-format istället för proprietära filformat för många kommersiella programvarupaket. Detta förenklar avsevärt analyser av våra data genom att eliminera steg filen omvandling som behövs för att läsa bildfiler i ImageJ, Photoshop och andra bildbehandlingsprogram.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Interna institutionella fonder och de biologiska vetenskaperna Scholars Program vid University of Michigan stött detta arbete.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Olympus BX61 microscope with Hamamatsu Orca-ER camera. 10x Plan Fluorite (NA 0.3) and 60x PlanAchromat (NA 1.35) objective lenses | Olympus Corporation | ||
| Micro-Manager 1.3.46 | Micro-Manager | http://www.micro-manager.org | |
| Image J 1.43 | http://rsbweb.nih.gov/ij | ||
| loci_tools.jar | http://www.loci.wisc.edu | ||
| Agarose - molecular biology/gel electrophoresis grade | |||
| Fisher Superfrost/Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Laboratory tape | Fisher Scientific | 15-901 | |
| 18 mm x 18 mm #1.5 coverslips | |||
| M9 (242 mM KH2PO4, 40 mM Na2HPO4, 9 mM g NaCl, 19 mM NH4Cl MgSO4) | |||
| (http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm). | |||
| Egg Buffer (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 25 mM HEPES, pH 7.3)25. | |||
| Vaseline | |||
| Brush/Stick | |||
| Razor blades | |||
| Heat block | |||
| Dissecting microscope | |||
| Worms22 | |||
| Platinum wire pick22 | |||
| 27G1/2 Precision Glide Needle or a scalpel with a small blade | BD Biosciences |
References
- Gerlich, D., Koch, B., Dupeux, F., Peters, J. M., Ellenberg, J. Live-cell imaging reveals a stable cohesin-chromatin interaction after but not before DNA replication. Curr Biol. 16, 1571-1578 (2006).
- Nabeshima, K. Dynamics of centromeres during metaphase-anaphase transition in fission yeast: Dis1 is implicated in force balance in metaphase bipolar spindle. Mol Biol Cell. 9, 3211-3225 (1998).
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Dev Biol. 100, 64-119 (1983).
- Oegema, K., Hyman, A. A. Cell division. WormBook. , 1-40 (2006).
- Heuvel, S. vanden Cell-cycle regulation. WormBook. , 1-16 (2005).
- Chisholm, A. D., Hardin, J. Epidermal morphogenesis. WormBook. , 1-22 (2005).
- Gonczy, P., Rose, L. S. Asymmetric cell division and axis formation in the embryo. WormBook. , 1-20 (2005).
- Nance, J., Lee, J. Y., Goldstein, B. Gastrulation in C. elegans. WormBook. , 1-13 (2005).
- Priess, J. R. Notch signaling in the C. elegans embryo. WormBook. , 1-16 (2005).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
- O'Connell, K. F., Leys, C. M., White, J. G. A genetic screen for temperature-sensitive cell-division mutants of Caenorhabditis elegans. Genetics. 149, 1303-1321 (1998).
- Fire, A. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans [see comments]. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Jansen, G., Hazendonk, E., Thijssen, K. L., Plasterk, R. H. Reverse genetics by chemical mutagenesis in Caenorhabditis elegans. Nat Genet. 17, 119-121 (1997).
- Liu, L. X. High-throughput isolation of Caenorhabditis elegans deletion mutants. Genome Res. 9, 859-867 (1999).
- Bazopoulou, D., Tavernarakis, N. The NemaGENETAG initiative: large scale transposon insertion gene-tagging in Caenorhabditis elegans. Genetica. 137, 39-46 (2009).
- Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics. 157, 1217-1226 (2001).
- Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Mol Cell Biol. 5, 3484-3496 (1985).
- Piano, F., Schetter, A. J., Mangone, M., Stein, L., Kemphues, K. J. RNAi analysis of genes expressed in the ovary of Caenorhabditis elegans. Curr Biol. 10, 1619-1622 (2000).
- Gonczy, P. Functional genomic analysis of cell division in C. elegans using RNAi of genes on chromosome III. Nature. 408, 331-336 (2000).
- Sonnichsen, B. Full-genome RNAi profiling of early embryogenesis in Caenorhabditis elegans. Nature. 434, 462-469 (2005).
- Mohler, W. A., Isaacson, A. B. Imaging embryonic development in Caenorhabditis elegans. Cold Spring Harb Protoc. , (2010).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Bembenek, J. N. Cortical granule exocytosis in C. elegans is regulated by cell cycle components including separase. Development. 134, 3837-3848 (2007).
- Poteryaev, D., Squirrell, J. M., Campbell, J. M., White, J. G., Spang, A. Involvement of the actin cytoskeleton and homotypic membrane fusion in ER dynamics in Caenorhabditis elegans. Mol Biol Cell. 16, 2139-2153 (2005).
- Bianchi, L., Driscoll, M. Culture of embryonic C. elegans cells for electrophysiological and pharmacological analyses. WormBook. , 1-15 (2006).
