Summary
مطلوب معرفة العدد الدقيق للخلايا قابلة للحياة لكثير من التلاعب زراعة الأنسجة. هذا البروتوكول يصف كيفية التفريق بين الخلايا الحية والميتة وتحديد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. على الرغم من أنه يصف العد الجذعية العصبية البشرية / السلائف الخلايا (hNSPCs) ، ويمكن استخدامه لأنواع الخلايا الأخرى.
Abstract
مطلوب معرفة العدد الدقيق للخلايا قابلة للحياة في حجم معين من الخلية لتعليق كثير من التلاعب الروتينية زراعة الأنسجة ، والخلايا مثل الطلاء لكيمياء سيتولوجية مناعية أو transfections الخلية. هذا البروتوكول يصف طريقة بسيطة وسريعة للتمييز بين الخلايا الحية والميتة وقياس تركيز الخلية ومجموع عدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. هذا الإجراء يتطلب أولا فصل الخلايا من النمو وإعادة التعليق السطحية لهم في وسائل الإعلام. المقبل ، وتضعف الخلايا في محلول أزرق التريبان (مثالي لتركيز من شأنها أن تعطي خلايا 20-50 في الربع) ووضعها في عدادة الكريات. أخيرا ، بلغ متوسط بحساب الخلايا قابلة للتطبيق في العديد من الأرباع تم اختيارها عشوائيا ، وتقسيم متوسط حجم رباعي واحدة 1 2 ملم (0.1 ميكرولتر) وضرب من قبل عامل التخفيف يعطي عدد من الخلايا لكل لتر. ضرب هذا التركيز من قبل الخلية في الحجم الكلي ميكرولتر يعطي إجمالي عدد الخلايا. يصف هذا البروتوكول العد الجذعية العصبية البشرية / السلائف الخلايا (hNSPCs) ، ولكن يمكن أن تستخدم أيضا لكثير من أنواع الخلايا الأخرى.
Protocol
الركض الخلايا الجذعية العصبية البشرية
ملاحظة : يرجى الرجوع إلى الإنسان الركض الخلايا الجذعية العصبية المقالة على كيفية فصل وresuspend الخلايا. http://www.jove.com/index/Details.stp؟ID=263
إعداد تعليق لخلية العد
- 25 مكان ميكرولتر من 0.4 ٪ حل التريبان الأزرق و 20 ميكرولتر من وسائل الإعلام في خلية أنبوب إيبندورف.
- Resuspend الخلايا لتحسب من خلال استغلال بلطف الأنبوب الذي يحتوي على الخلايا في حجم معروف من وسائل الإعلام لخلق نظام التعليق متجانسة. مكان 5 ميكرولتر من الخلايا في الأنبوب إيبندورف من الخطوة السابقة. هذه الخطوة يخفف من تركيز الخلية من قبل عامل من 10.
- وضع غطاء من الزجاج على عدادة الكريات ، وتحميل حوالي 11-12 ميكرولتر من التعليق الخلية.
عد الخلايا في عدادة الكريات
- مراقبة الشبكة بأكملها من عدادة الكريات في مرحلة مجهر التباين. التركيز على واحد رباعي من الشبكة (مثل واحد باللون الأحمر).
- والخلايا الميتة أو التي تحتضر ويظهر اللون الأزرق لأنه قد تعرض للتلف الغشاء ، وغير قادرين على استبعاد الصبغة الزرقاء التريبان. وخلايا قابلة للحياة لا تظهر زرقاء وستكون محاطة "هالة" من الضوء على النقيض من المرحلة (ستكون "مرحلة مشرق").
- حساب عدد الخلايا قادرة على البقاء في واحد رباعي (منطقة 1 ملم 2). يمكنك أيضا تحديد قابلية الخلية عن طريق قسمة عدد من الخلايا قادرة على البقاء على العدد الكلي للخلايا. عدد الخلايا في الأرباع 04/03 العشوائية وتحديد متوسط عدد الخلايا في رباعي. ومن المعروف منذ حجم رباعي ب 10 مل -4 أو 0.1 ميكرولتر ، يمكن تحديد تركيز الخلايا
- يمكنك استخدام الاختصار التالية لتحديد الخلايا # / ميكرولتر :
مجموع عدد الخلايا في الخلايا = # أنبوب / X ميكرولتر ميكرولتر في أنبوب
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يصف هذا البروتوكول بطريقة مباشرة وسريعة لتحديد تركيز خلية لمجموعة متنوعة من التجارب التي تنطوي على الخلايا. باستخدام الاختصار الموصوفة في 3D ، ويمكن للمرء بسرعة وبدقة تحديد تركيز الخلية ومجموع عدد الخلايا في حجم معين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
فإن الكتاب أن نعترف الدكتور فيليب H. شوارتز من العصبية الوطنية الجذعية البشرية الموارد خلية في مستشفى الأطفال في ليالي ، أورانج كاونتي معهد البحوث لتوفير hNSPC الثقافات.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Phase Contrast Hemacytometer | Tool | Hausser Scientific | 02-671-54 | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Trypan Blue Stain 0.4% | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15250-061 | Distributed by Invitrogen under the indicated catalog # |
References
- Marchenko, S., Flanagan, L. A. Passaging Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 (2007).
- Caprette, D. avidR. Using a Hemacytometer. BioEd Online. , http://www.bioedonline.org/slides/slide01.cfm?q=%22hemacytometer&dpg=3 (2008).
- Caprette, D. avidR. Counting Chamber (Hemacytometer). BioEd Online. , http://www.bioedonline.org/slides/slide01.cfm?q=%22hemacytometer%22&dpg=2 (2008).
