Summary
La connaissance du nombre exact de cellules viables est nécessaire pour de nombreuses manipulations culture de tissus. Ce protocole décrit comment différencier entre les cellules vivantes et mortes et de quantifier les cellules en utilisant un hématimètre. Bien qu'il décrit compter humaine souches neurales / cellules précurseurs (hNSPCs), il peut être utilisé pour d'autres types cellulaires.
Abstract
La connaissance du nombre exact de cellules viables dans un volume donné d'une suspension cellulaire est nécessaire pour les manipulations de routine de nombreux culture de tissus, comme les cellules de placage pour l'immunocytochimie ou pour transfections cellulaires. Ce protocole décrit une méthode simple et rapide pour différencier les cellules vivantes et mortes et de quantifier la concentration de cellules et nombre total de cellules en utilisant un hématimètre. Cette procédure exige d'abord détacher les cellules d'une surface de croissance et les remettre en suspension dans les médias. Ensuite, les cellules sont diluées dans une solution de bleu Trypan (idéalement à une concentration qui donne 20 à 50 cellules par quadrant) et placé dans le hématimètre. Enfin, la moyenne des chiffres de cellules viables dans plusieurs quadrants sélectionnés au hasard, en divisant la moyenne par le volume d'un 1 mm 2 quadrants (0,1 pi) et en multipliant par le facteur de dilution donne le nombre de cellules par litre En multipliant cette concentration cellulaire par le volume total en ul donne le nombre total de cellules. Ce protocole décrit le comptage humaine souches neurales / cellules précurseurs (hNSPCs), mais peut aussi être utilisé pour de nombreux autres types cellulaires.
Protocol
Le repiquage des cellules souches humaines
Note: S'il vous plaît se référer à l' homme neuronal repiquage Cellules souches article sur la façon de se détacher et de remettre en suspension les cellules. http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263
Préparer la suspension cellulaire pour le comptage
- Placer 25 ul de solution de 0,4% au bleu Trypan et 20 pi de milieu cellulaire dans un tube Eppendorf.
- Resuspendre les cellules pour être comptés en tapotant doucement le tube contenant les cellules dans un volume connu des médias pour créer une suspension homogène. Placer 5 ul de cellules dans le tube eppendorf de l'étape précédente. Cette étape dilue la concentration cellulaire d'un facteur 10.
- Placez le couvercle en verre sur le hématimètre et la charge d'environ 11-12 ul de la suspension cellulaire.
Comptage des cellules dans le hémacytomètre
- Observez la grille entière de l'hématimètre dans un microscope à contraste de phase. Focus sur un quadrant de la grille (comme celui en rouge).
- Les cellules mortes ou mourantes apparaîtra bleu parce que leur membrane a été endommagée et ne sont pas en mesure d'exclure le colorant bleu trypan. Les cellules viables n'apparaîtra pas bleu et sera entouré par un "halo" de lumière en contraste de phase (sera «phase-bright»).
- Comptez le nombre de cellules viables dans un quadrant (zone 1 mm 2). Vous pouvez également déterminer la viabilité cellulaire en divisant le nombre de cellules viables par le nombre total de cellules. Compter les cellules dans 3-4 quadrants aléatoire et déterminer le nombre moyen de cellules par quadrant. Puisque le volume d'un quadrant est connu pour être de 10 ml ou 0,1 ul -4, la concentration de cellules peut être déterminé
- Vous pouvez utiliser le raccourci suivant pour déterminer les cellules # / ul:
Nombre total de cellules dans un tube = # cellules / ul ul X dans le tube
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Discussion
Ce protocole décrit une méthode simple et rapide pour déterminer la concentration de cellules pour une variété d'expériences impliquant des cellules. Utiliser le raccourci décrit en 3D, on peut déterminer rapidement et précisément la concentration de cellules et nombre total de cellules dans un volume donné.
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Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier le Dr Philip H. Schwartz, de la National des Ressources Humaines des cellules souches neurales à l'Hôpital des enfants s, Orange County Institut de recherche pour fournir des cultures hNSPC.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Phase Contrast Hemacytometer | Tool | Hausser Scientific | 02-671-54 | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Trypan Blue Stain 0.4% | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15250-061 | Distributed by Invitrogen under the indicated catalog # |
References
- Marchenko, S., Flanagan, L. A. Passaging Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 (2007).
- Caprette, D. avidR. Using a Hemacytometer. BioEd Online. , http://www.bioedonline.org/slides/slide01.cfm?q=%22hemacytometer&dpg=3 (2008).
- Caprette, D. avidR. Counting Chamber (Hemacytometer). BioEd Online. , http://www.bioedonline.org/slides/slide01.cfm?q=%22hemacytometer%22&dpg=2 (2008).
