Подсчет правам нервные стволовые клетки

Summary

Знание точного числа жизнеспособных клеток требуется для многих манипуляций культуры ткани. Этот протокол описывает, как различать живых и мертвых клеток и клеток с использованием количественно hemacytometer. Хотя она описывает подсчета человека нейронных стволовых / клеток-предшественников (hNSPCs), он может быть использован для других типов клеток.

Abstract

Знание точного количества жизнеспособных клеток в данном объеме суспензии клеток требуется для многих рутинных манипуляций культуры тканей, таких как покрытие клеток для иммуноцитохимии или для сотовых трансфекции. Этот протокол описывает простой и быстрый метод для разграничения живых и мертвых клеток и количественной концентрации клеток и общее количество клеток с использованием hemacytometer. Эта процедура требует, прежде всего отсоединение клетки от поверхности роста и суспендирования их в средствах массовой информации. Затем клетки разводят в решении Трипановый синий (в идеале до концентрации, что даст 20-50 клеток на квадрант) и помещен в hemacytometer. Наконец, в среднем насчитывает жизнеспособных клеток в нескольких случайно выбранных секторах, разделив среднем на объем не менее одного 1 мм ² квадранта (0,1 мкл) и умножения на коэффициент разбавления дает число клеток в л Умножив это концентрации клеток на общий объем в мкл дает общее число клеток. Этот протокол описывает подсчета человека нейронных стволовых / клеток-предшественников (hNSPCs), но также может быть использован и для многих других типов клеток.

Protocol

Пассирования правам нервные стволовые клетки

Примечание: Пожалуйста, обратитесь к пассажей правам нейронных стволовых клеток статью о том, чтобы отключить и ресуспендирования клеток. http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263

Подготовка клеточной суспензии для подсчета

1. Место 25 мкл 0,4% Голубой Трипан раствора и 20 мкл клеточной среды в трубке Эппендорф.
2. Ресуспендируют ячейки, которые будут учитываться аккуратным постукиванием трубки, содержащей клетки в известном объеме средств массовой информации для создания однородной суспензии. Место 5 мкл клеток в пробирку Эппендорфа из предыдущего шага. Этот шаг разбавляет концентрацию клеток по 10 раз.
3. Место покровного стекла на hemacytometer и загрузить около 11-12 мкл клеточной суспензии.
   
   
   
   

Подсчет Ячейки в Hemacytometer

1. Соблюдайте все сетки hemacytometer в микроскоп фазового контраста. Сосредоточьтесь на одной четверти сетки (например, одна в красном).
   
   
   
   
2. Мертвые или умирающие клетки появится синий, потому что их мембраны был поврежден и не в состоянии исключить красителя Трипановый синий. Жизнеспособные клетки не появятся синие и будут окружены "гало" света в фазового контраста (будет "фаза-яркий").
3. Подсчитайте количество жизнеспособных клеток в одном квадранте (площадью 1 мм ^2). Вы можете также определить жизнеспособность клеток путем деления числа жизнеспособных клеток на общее число клеток. Граф клеток в 3-4 случайных квадрантах и ​​определить среднее число клеток на квадранте. Поскольку объем квадранте, как известно, 10 ^-4 мл или 0,1 мл, концентрация клеток может быть определена
   
   
   
   
   
   
4. Вы можете использовать следующую сокращенную процедуру, чтобы определить # клеток / мкл:
   
   
   
   Общее количество клеток в трубы = # клеток / мкл X мкл в трубке

Discussion

Этот протокол описывает простой и быстрый способ определения концентрации клеток для различных экспериментов с клетками. Использование контекстного описано в 3d, можно быстро и точно определить концентрацию клеток и общего числа клеток в данном объеме.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Phase Contrast Hemacytometer	Tool	Hausser Scientific	02-671-54	Distributed by Fisher under the indicated catalog #
Trypan Blue Stain 0.4%	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15250-061	Distributed by Invitrogen under the indicated catalog #