Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Подсчет правам нервные стволовые клетки

doi: 10.3791/262 Published: August 22, 2007

Summary

Знание точного числа жизнеспособных клеток требуется для многих манипуляций культуры ткани. Этот протокол описывает, как различать живых и мертвых клеток и клеток с использованием количественно hemacytometer. Хотя она описывает подсчета человека нейронных стволовых / клеток-предшественников (hNSPCs), он может быть использован для других типов клеток.

Abstract

Знание точного количества жизнеспособных клеток в данном объеме суспензии клеток требуется для многих рутинных манипуляций культуры тканей, таких как покрытие клеток для иммуноцитохимии или для сотовых трансфекции. Этот протокол описывает простой и быстрый метод для разграничения живых и мертвых клеток и количественной концентрации клеток и общее количество клеток с использованием hemacytometer. Эта процедура требует, прежде всего отсоединение клетки от поверхности роста и суспендирования их в средствах массовой информации. Затем клетки разводят в решении Трипановый синий (в идеале до концентрации, что даст 20-50 клеток на квадрант) и помещен в hemacytometer. Наконец, в среднем насчитывает жизнеспособных клеток в нескольких случайно выбранных секторах, разделив среднем на объем не менее одного 1 мм 2 квадранта (0,1 мкл) и умножения на коэффициент разбавления дает число клеток в л Умножив это концентрации клеток на общий объем в мкл дает общее число клеток. Этот протокол описывает подсчета человека нейронных стволовых / клеток-предшественников (hNSPCs), но также может быть использован и для многих других типов клеток.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Пассирования правам нервные стволовые клетки

Примечание: Пожалуйста, обратитесь к пассажей правам нейронных стволовых клеток статью о том, чтобы отключить и ресуспендирования клеток. http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263

Подготовка клеточной суспензии для подсчета

  1. Место 25 мкл 0,4% Голубой Трипан раствора и 20 мкл клеточной среды в трубке Эппендорф.
  2. Ресуспендируют ячейки, которые будут учитываться аккуратным постукиванием трубки, содержащей клетки в известном объеме средств массовой информации для создания однородной суспензии. Место 5 мкл клеток в пробирку Эппендорфа из предыдущего шага. Этот шаг разбавляет концентрацию клеток по 10 раз.
  3. Место покровного стекла на hemacytometer и загрузить около 11-12 мкл клеточной суспензии.

    262_Figure-01

Подсчет Ячейки в Hemacytometer

  1. Соблюдайте все сетки hemacytometer в микроскоп фазового контраста. Сосредоточьтесь на одной четверти сетки (например, одна в красном).

    262_Figure-02

  2. Мертвые или умирающие клетки появится синий, потому что их мембраны был поврежден и не в состоянии исключить красителя Трипановый синий. Жизнеспособные клетки не появятся синие и будут окружены "гало" света в фазового контраста (будет "фаза-яркий").
  3. Подсчитайте количество жизнеспособных клеток в одном квадранте (площадью 1 мм 2). Вы можете также определить жизнеспособность клеток путем деления числа жизнеспособных клеток на общее число клеток. Граф клеток в 3-4 случайных квадрантах и ​​определить среднее число клеток на квадранте. Поскольку объем квадранте, как известно, 10 -4 мл или 0,1 мл, концентрация клеток может быть определена


    262_Figure-03


  4. Вы можете использовать следующую сокращенную процедуру, чтобы определить # клеток / мкл:

    262_Figure-04

    Общее количество клеток в трубы = # клеток / мкл X мкл в трубке

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Этот протокол описывает простой и быстрый способ определения концентрации клеток для различных экспериментов с клетками. Использование контекстного описано в 3d, можно быстро и точно определить концентрацию клеток и общего числа клеток в данном объеме.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Авторы хотели бы выразить признательность д-р Филип Х. Шварца о человеческом нейронных стволовых клеток ресурсов в Детской больнице с, Orange County научно-исследовательский институт для обеспечения hNSPC культур.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Phase Contrast Hemacytometer Tool Hausser Scientific 02-671-54 Distributed by Fisher under the indicated catalog #
Trypan Blue Stain 0.4% Reagent GIBCO, by Life Technologies 15250-061 Distributed by Invitrogen under the indicated catalog #

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Marchenko, S., Flanagan, L. A. Passaging Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 (2007).
  2. Caprette, D. avidR. Using a Hemacytometer. BioEd Online. http://www.bioedonline.org/slides/slide01.cfm?q=%22hemacytometer&dpg=3 (2008).
  3. Caprette, D. avidR. Counting Chamber (Hemacytometer). BioEd Online. http://www.bioedonline.org/slides/slide01.cfm?q=%22hemacytometer%22&dpg=2 (2008).
Подсчет правам нервные стволовые клетки
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Marchenko, S., Flanagan, L. Counting Human Neural Stem Cells. J. Vis. Exp. (7), e262, doi:10.3791/262 (2007).More

Marchenko, S., Flanagan, L. Counting Human Neural Stem Cells. J. Vis. Exp. (7), e262, doi:10.3791/262 (2007).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter