Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Räkna mänskliga neurala stamceller

doi: 10.3791/262 Published: August 22, 2007

Summary

Kunskap om det exakta antalet livskraftiga celler krävs för många manipulationer vävnadsodling. Detta protokoll beskriver hur att skilja mellan levande och döda celler och kvantifiera celler med hjälp av en hemacytometer. Även om det beskriver räknar mänskliga neurala stamceller / föregångare celler (hNSPCs), kan den användas för andra celltyper.

Abstract

Kunskap om det exakta antalet livskraftiga celler i en given volym av en cellsuspensionen krävs för många kultur rutin vävnad manipulationer, såsom plätering celler för immuncytokemi eller för cell transfections. Detta protokoll beskriver en enkel och snabb metod för att skilja mellan levande och döda celler och kvantifiera cellkoncentrationen och totalt antal celler med hjälp av en hemacytometer. Detta förfarande kräver först loss celler från en tillväxt yta och resuspending dem i media. Därefter är de celler utspädd i en lösning av Trypan blå (helst till en koncentration som ger 20-50 celler per kvadrant) och placeras i hemacytometer. Slutligen, i genomsnitt de räknar livskraftiga celler i flera slumpmässigt utvalda kvadranter, dividera genomsnitt volymen av en 1 mm 2 kvadranten (0,1 l) och multiplicera med spädningsfaktorn ger antalet celler per liter Multiplicera detta cellkoncentrationen med den totala volymen i l ger det totala antalet celler. Detta protokoll beskriver räknar mänskliga neurala stamceller / föregångare celler (hNSPCs), men kan även användas till många andra celltyper.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Passaging mänskliga neurala stamceller

Obs: Se Passaging mänskliga neurala stamceller artikel om hur man loss och återsuspendera cellerna. http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263

Förbereda cellsuspensionen för räkning

  1. Placera 25 l på 0,4% Trypan Blå lösning och 20 l av cell medier i ett Eppendorf-rör.
  2. Resuspendera celler som skall räknas genom att försiktigt knacka på röret med celler i en känd volym av media för att skapa en homogen suspension. Plats 5 ìl av celler i Eppendorf-rör från föregående steg. Detta steg späder cellen koncentrationen med en faktor 10.
  3. Placera locket glas på hemacytometer och ladda om 11-12 l av cellsuspensionen.

    262_Figure-01

Räkna celler i Hemacytometer

  1. Följ hela nätet av hemacytometer i ett faskontrastmikroskop. Fokus på en kvadrant av nätet (t.ex. ett i rött).

    262_Figure-02

  2. Döda eller döende celler kommer att visas blå eftersom deras membran har skadats och inte kan utesluta Trypan blått färgämne. Livsdugliga celler kommer inte att visas blått och kommer att omges av en "gloria" av ljus i faskontrast (kommer att vara "fas-ljus").
  3. Räkna antalet livskraftiga celler i en kvadrant (område 1 mm 2). Du kan också bestämma cellviabiliteten genom att dividera antalet livskraftiga celler med det totala antalet celler. Räkna celler i 3-4 slumpmässiga kvadranter och bestämma det genomsnittliga antalet celler per kvadrant. Eftersom volymen av en kvadrant är känd för att vara 10 -4 ml eller 0,1 l, kan koncentrationen av celler bestämmas


    262_Figure-03


  4. Du kan använda följande genväg för att bestämma # celler / l:

    262_Figure-04

    Totalt # av celler i provrör = # celler / l X l i rör

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Detta protokoll beskriver ett enkelt och snabbt sätt att bestämma cellkoncentrationen för en mängd olika experiment med celler. Använda genvägar som beskrivs i 3d, kan man snabbt och exakt bestämma cellkoncentrationen och totalt antal celler i en given volym.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Författarna vill tacka för Dr Philip H. Schwartz av den nationella människorättskommissionen Neural Stem Cell Resurs på Barnens s Hospital, Orange County Forskningscentralen för att ge hNSPC kulturer.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Phase Contrast Hemacytometer Tool Hausser Scientific 02-671-54 Distributed by Fisher under the indicated catalog #
Trypan Blue Stain 0.4% Reagent GIBCO, by Life Technologies 15250-061 Distributed by Invitrogen under the indicated catalog #

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Marchenko, S., Flanagan, L. A. Passaging Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 (2007).
  2. Caprette, D. avidR. Using a Hemacytometer. BioEd Online. http://www.bioedonline.org/slides/slide01.cfm?q=%22hemacytometer&dpg=3 (2008).
  3. Caprette, D. avidR. Counting Chamber (Hemacytometer). BioEd Online. http://www.bioedonline.org/slides/slide01.cfm?q=%22hemacytometer%22&dpg=2 (2008).
Räkna mänskliga neurala stamceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Marchenko, S., Flanagan, L. Counting Human Neural Stem Cells. J. Vis. Exp. (7), e262, doi:10.3791/262 (2007).More

Marchenko, S., Flanagan, L. Counting Human Neural Stem Cells. J. Vis. Exp. (7), e262, doi:10.3791/262 (2007).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter