Summary
Способность манипулировать человеческой нейронных стволовых / клеток-предшественников (hNSPCs) в пробирке позволяет исследовать их полезность в качестве клеточных трансплантатов для использования в терапевтических целях, а также изучить человеческие развития нервной системы. Этот протокол представляет метод культивирования и пассажи hNSPCs в надежде на повышение воспроизводимости человеческого исследования стволовых клеток.
Abstract
Способность манипулировать человеческой нейронных стволовых / клеток-предшественников (hNSPCs) в пробирке предоставляет средства для изучения их полезность как клеточных трансплантатов для использования в терапевтических целях, а также для изучения многих фундаментальных процессов человеческого развития нервной системы и патологии. Этот протокол представляет собой простой метод культивирования и пассажи hNSPCs в надежде на стандартизацию этой техники и повышения воспроизводимости человеческого исследования стволовых клеток. HNSPCs мы используем были изолированы от трупного послеродовой коры мозга, о человеческом нейронных стволовых клеток ресурсов и выросли как приверженец культур на колбы покрыты фибронектина (Palmer и др., 2001;.. Шварц и др., 2003). Мы культуре нашей hNSPCs в DMEM: F12, свободной от сыворотки среде с EGF, FGF и PDGF и прохождение их 1:02 примерно раз в семь дней. Используя эти условия, большинство клеток в культуре поддерживать морфологии биполярных и выражать маркеры недифференцированных нервные стволовые клетки (например, нестин и Sox2).
Protocol
Примечание: Для рутинной культивирования наших hNSPCs, мы меняем 50-100% от средств массовой информации каждый день, и обычно их прохождения 1:02 раз в неделю. Медиакультуры содержит 20% BIT-9500, 1X антибиотик / противогрибковым, и факторы роста (EGF, FGF и PDGF каждый на 40 нг / мл) в DMEM: F12 СМИ базу.
Подготовка покрытием колбы и окончательно оторвать Клетки
- Для подготовки новых контейнеров для пассировать клетки, пальто T25 колбы с 10 мкг / мл человеческого фибронектина в EMEM течение 4 часов, или на ночь, на 37 ° C культуре ткани инкубатора. Прямо перед пассирования клеток, фибронектина удалить раствором и промыть колбы с PBS.
- Передача старой «условной» средств массовой информации из ячейки, которые будут пассировать на новый фибронектина покрытием колбы (например, что половина конечного объема средств массовой информации для каждой колбе будет «условной» СМИ). Эти условия культивирования помочь сохранить эти клетки в недифференцированное состояние.
- Как только все средства массовой информации будет удален из ячейки, которые будут пассировать, промыть клетки сразу с PBS. Будьте осторожны, чтобы не иссякнуть клеток.
- Добавить клеточной диссоциации буферов (CDB) непосредственно на клетки (1,0-1,5 мл на флакон T25). Инкубируйте клетки в буфере в течение 5 минут при комнатной температуре. Осторожно нажав колбу поможет ускорить ячейки отряда.
Центрифугирование, суспендирования и покрытие Клетки
- Добавить сыворотке средах (DMEM: F12 с 10% тепла инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки) (использовать ~ 3X объема CDB) в колбу с отдельной клетки. Удалить СМИ и клеток к 15 мл коническую трубку. Использование небольшого объема свежей сыворотки средах для полоскания колбу и восстановления остаточных клеток.
- Центрифуга СМИ и клеток при 1000 оборотов в минуту (~ 200xg) в течение 5 минут.
- Всасывающая с сывороткой средах и ресуспендируйте клеток в свежей культуральной среды, пипетирования вверх и вниз, чтобы сделать однородной суспензии клеток.
- Передача половины ресуспендировали клеток в каждом новом колбу на 1:02 раскол. Обратите внимание на новый номер прохода на колбу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы обнаружили, что этот протокол обеспечивает надежную культур hNSPCs. Одним из важнейших факторов для наших клеток является то, что они должны быть как достаточно плотная культуры и не может быть пассировать до того, что клетки являются редкими. В наших руках, редкие культуры растут очень медленно или полностью прекратить делиться. По этой причине мы, как правило расколоть нашу культуру 1:2 или 1:3, когда культура чрезвычайно плотной. Покрытие поверхности культуры блюдо с фибронектина очень важно, поскольку оно способствует правильное прикладывание клеток и миграции, но, в отличие от ламинин, он также позволяет использовать сотовый Диссоциация буфера (КБР), чтобы отделить клетки. Сотовые привязанность к ламинин слишком силен и не требует использования протеолитических ферментов (например, трипсина) для мобильного отряда. Неферментативного ЦКБ предпочтительнее трипсина с протеолитического расщепления белков клеточной поверхности может привести к морфологическим изменениям в hNSPCs с течением времени. Кроме того, культивирование hNSCPs в кондиционированной среде помогает сохранять эти клетки в недифференцированное состояние.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Авторы выражают глубокую признательность д-р Филип Х. Шварца о человеческом нейронных ресурсов стволовых клеток в детской больнице, Orange County научно-исследовательский институт для обеспечения hNSPCs и начального обучения на своем культивирования.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| BIT-9500 (BSA, Insulin, Transferrin) | Reagent | Stem Cell Technologies | 09500 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Reagent | Invitrogen | 15240-062 | |
| DMEM:F12 (1X) | Reagent | Invitrogen | 11330-032 | |
| EMEM (1X) | Reagent | Mediatech, Inc. | MT-10-010-CV | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Fetal Bovine Serum | Reagent | Invitrogen | 10437-028 | |
| FGF, human basic recombinant | Reagent | PeproTech Inc | 100-18B | |
| PDGF-AB | Reagent | PeproTech Inc | 100-00AB | |
| EGF, human recombinant | Reagent | BD Biosciences | CB40052 | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Cell Culture Flask, 25 cm2 | Tool | Corning | 10-126-28 | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Fibronectin, human, natural | Reagent | BD Biosciences | CB40008A | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Human Neural Stem/Precursor Cells | Cells | National Human Neural Stem Cell Resource | ||
| Cell Dissociation Buffer | Reagent | Invitrogen | 13150-016 |
References
- Flanagan, L. A., Rebaza, L. M., Derzic, S., Schwartz, P. H., Monuki, E. S. Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins. J. Neurosci. Res. 83, 845-856 (2006).
- Nethercott, H. N., Maxwell, H., Schwartz, P. H. Neural stem cell culture. Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide. Loring, J. F., Wesselschmidt, R. W., Schwartz, P. H. , Elsevier/Cell Press. (2007).
- Palmer, T. D., Schwartz, P. H., Taupin, P., Kaspar, B., Stein, S. A., Gage, F. H. Cell culture. Progenitor cells from human brain after death. Nature. 411, 42-43 (2001).
- Schwartz, P. H., Bryant, P. J., Fuja, T. J., Su, H., O'Dowd, D. K., Klassen, H. Isolation and characterization of neural progenitor cells from post-mortem human cortex. J Neurosci Res. 74, 838-851 (2003).
