Summary
체외에서 인간의 신경 줄기 / 전구체 세포 (hNSPCs)를 조작하는 능력은 치료 목적을 위해 세포 이식으로 자신의 유틸리티를 조사하고 인간의 신경 발달을 탐험하실 수 있습니다. 이 프로토콜은 인간의 줄기 세포 연구의 증가 재현성의 희망에 culturing 및 passaging hNSPCs의 방법을 보여줍니다.
Abstract
체외에서 인간의 신경 줄기 / 전구체 세포 (hNSPCs)를 조작하는 능력은 치료 목적을 위해 세포 이식으로 자신의 유틸리티를 조사할뿐만 아니라 인간의 신경 발달과 병리 많은 근본적인 과정을 탐구하는 수단을 제공합니다. 이 프로토콜은이 기술을 표준화하고 인간의 줄기 세포 연구의 재현성을 증가 기대에 culturing 및 passaging hNSPCs의 간단한 방법을 제공합니다. 우리가 사용하는 hNSPCs은 국립 인간 신경 줄기 세포 자원에 의해 시체 같은 출생 후의 두뇌 cortices으로부터 격리 및 flasks에 점착 성의 문화가 fibronectin (팔머 외, 2001..; 슈워츠 외, 2003)와 코팅으로 성장했다. DMEM에 우리 문화는 우리 hNSPCs : F12 혈청이없는 미디어 EGF, FGF 및 PDGF와 함께 보충 및 통로들을 1시 2분 약 매 칠일. 이러한 조건을 사용하여 문화의 세포의 대부분은 바이폴라 형태를 유지하고 undifferentiated 신경 줄기 세포 (예 : nestin 및 sox2 등)의 마커를 표현한다.
Protocol
참고 : 일주일에 한번씩 우리 hNSPCs의 일상 culturing 들어, 우리가 매일하고 일반적으로 통로를 1시 2분 미디어 50-100%을 변경합니다. F12 기지 미디어 : 문화 미디어는 20 %의 비트 9500 DMEM에 1X 항생제 / antimycotic 및 성장 요인을 (EGF, FGF 및 PDGF 40 NG / ML 각)이 포함되어 있습니다.
코팅 휴대용 술병을 준비하고 세포를 Dissociating
- 37 10 μg / 야간 4 시간 또는 EMEM에 ML 인간 fibronectin과 passaged 세포, 코트 T25 flasks, ° C 조직 문화의 인큐베이터에 대한 새로운 flasks를 준비합니다. 오른쪽 세포를 passaging 전에 fibronectin 솔루션을 제거하고 PBS로 flasks을 씻어.
- 새로운 fibronectin - 코팅 flasks (각 플라스크에 대한 미디어의 절반 최종 볼륨이 "시설"미디어된다는 등)에 passaged 수 세포에서 오래된 "시설"미디어를 전송합니다. 이러한 culturing 조건들은 undifferentiated 상태에서 이러한 세포를 유지 도움이됩니다.
- 일단 미디어의 모든 passaged 수 세포에서 제거, PBS로 한번 세포를 씻어. 세포를 건조하지 않도록 조심 해요.
- 직접 세포 (T25 플라스크에 대한 1.0-1.5 ML)에 셀 분리 버퍼 (CDB)를 추가합니다. 실온에서 약 5 분 동안 버퍼에 세포를 품어. 부드럽게 휴대용 술병을 감청하는 것은 세포 분리 속도를 도움이 될 것입니다.
, Centrifuging Resuspending 및 도금 세포
- 분리된 세포와 술병을 (CDB의 ~ 3 배 볼륨을 사용) : 혈청 함유 미디어 (F12 10 %로 열 inactivated 태아 소 혈청 DMEM)을 추가합니다. 15 ML 원뿔 관에 미디어 및 세포를 제거합니다. 플라스크를 씻어 잔류 세포를 복구하는 신선한 혈청 함유 미디어의 작은 볼륨을 사용합니다.
- 5 분 1,000 RPM (~ 200xg)에서 미디어 및 세포를 원심 분리기.
- 혈청 함유 미디어에서 흡입 및 단일 세포 현탁액을하고 위아래로 pipetting, 신선한 문화 매체에있는 세포를 resuspend.
- 1시 2분 분할에 대한 새로운 각 플라스크에 resuspended 세포의 절반을 전송합니다. 플라스크에있는 새로운 통로 번호를 적어 둡니다.
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Discussion
우리는이 프로토콜 hNSPCs의 신뢰할 수있는 문화를 제공하는 것으로 나타났습니다. 우리의 세포에 대한 하나의 중요한 요소들은 상당히 밀도 문화로 보관하고 세포가 스파스되는 시점 passaged 수 없습니다 필요합니다. 우리 손에, 스파스 문화는 매우 느리게 성장 또는 완전히 분열 중지. 문화가 매우 밀도 때 이러한 이유로, 우리는 보통 우리 문화 1시 2분 또는 1시 3분 분할. 그것이 좋은 세포 부착 및 마이 그 레이션을 촉진하지만, laminin 달리, 그것은 또한 세포를 분리하기 위해 셀 분리 버퍼 (CDB)의 사용을 허용 이후 fibronectin과 문화 요리의 코팅 표면은 중요합니다. laminin에 세포 부착이 너무 강해이며 세포 분리를위한 proteolytic 효소 (예 : 트립신)의 사용이 필요합니다. 비 효소 CDB는 세포 표면 단백질의 proteolytic 절단은 시간이 지남에 따라 hNSPCs의 형태학의 변화로 이어질 수 있기 때문에 트립신을 선호합니다. 또한, 에어컨 미디어 culturing의 hNSCPs들은 undifferentiated 상태에서 이러한 세포를 유지하는 데 도움이됩니다.
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Acknowledgments
저자는 기꺼이 어린이 병원, 그들의 culturing에 hNSPCs과 초기 교육을 제공하는 오렌지 카운티 연구소 국립 인간 신경 줄기 세포 자원의 박사 필립 H. 슈워츠 인정합니다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| BIT-9500 (BSA, Insulin, Transferrin) | Reagent | Stem Cell Technologies | 09500 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Reagent | Invitrogen | 15240-062 | |
| DMEM:F12 (1X) | Reagent | Invitrogen | 11330-032 | |
| EMEM (1X) | Reagent | Mediatech, Inc. | MT-10-010-CV | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Fetal Bovine Serum | Reagent | Invitrogen | 10437-028 | |
| FGF, human basic recombinant | Reagent | PeproTech Inc | 100-18B | |
| PDGF-AB | Reagent | PeproTech Inc | 100-00AB | |
| EGF, human recombinant | Reagent | BD Biosciences | CB40052 | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Cell Culture Flask, 25 cm2 | Tool | Corning | 10-126-28 | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Fibronectin, human, natural | Reagent | BD Biosciences | CB40008A | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Human Neural Stem/Precursor Cells | Cells | National Human Neural Stem Cell Resource | ||
| Cell Dissociation Buffer | Reagent | Invitrogen | 13150-016 |
References
- Flanagan, L. A., Rebaza, L. M., Derzic, S., Schwartz, P. H., Monuki, E. S. Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins. J. Neurosci. Res. 83, 845-856 (2006).
- Nethercott, H. N., Maxwell, H., Schwartz, P. H. Neural stem cell culture. Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide. Loring, J. F., Wesselschmidt, R. W., Schwartz, P. H. , Elsevier/Cell Press. (2007).
- Palmer, T. D., Schwartz, P. H., Taupin, P., Kaspar, B., Stein, S. A., Gage, F. H. Cell culture. Progenitor cells from human brain after death. Nature. 411, 42-43 (2001).
- Schwartz, P. H., Bryant, P. J., Fuja, T. J., Su, H., O'Dowd, D. K., Klassen, H. Isolation and characterization of neural progenitor cells from post-mortem human cortex. J Neurosci Res. 74, 838-851 (2003).
