Summary
La capacité de manipuler humaine souches neurales / cellules précurseurs (hNSPCs) in vitro permet d'étudier leur utilité comme les greffes de cellules à des fins thérapeutiques et d'explorer le développement humain de neurones. Ce protocole présente une méthode de culture et de hNSPCs repiquage dans l'espoir de reproductibilité croissante de la recherche des cellules souches humaines.
Abstract
La capacité de manipuler humaine souches neurales / cellules précurseurs (hNSPCs) in vitro constitue un moyen d'étudier leur utilité comme les greffes de cellules à des fins thérapeutiques ainsi que d'explorer de nombreux processus fondamentaux du développement neuronal humain et la pathologie. Ce protocole présente une méthode simple de culture et de hNSPCs repiquage dans l'espoir de normaliser cette technique et en augmentant la reproductibilité de la recherche des cellules souches humaines. Le hNSPCs nous utilisons ont été isolés à partir de cadavres cortex cérébral post-natal par la National des Ressources Humaines des cellules souches neurales et cultivés comme cultures adhérentes sur les flacons enduits de fibronectine (Palmer et al, 2001;.. Schwartz et al, 2003). Nous la culture de notre hNSPCs dans un milieu DMEM: F12 milieu sans sérum complété par l'EGF, FGF et PDGF et le passage entre eux 01h02 environ tous les sept jours. En utilisant ces conditions, la majorité des cellules dans la culture de maintenir une morphologie bipolaire et expriment des marqueurs des cellules souches neurales indifférenciées (comme nestine et Sox2).
Protocol
Note: Pour la culture de routine de notre hNSPCs, nous changeons de 50-100% de la presse chaque jour d'autres et généralement leur passage 1h02 une fois par semaine. Les milieux de culture contient BIT-9500 à 20%, 1X facteurs antibiotiques / antimycotiques, et la croissance (EGF, FGF et PDGF chacun à 40 ng / ml) dans du DMEM: F12 média de base.
Préparer le flacon couché et dissocier les cellules
- Pour préparer de nouveaux flacons pour les cellules repiquées, manteau flacons T25 avec 10 ug / ml de fibronectine humaine dans EMEM pendant 4 heures ou toute la nuit, dans un 37 ° C de culture de tissu incubateur. Juste avant repiquage des cellules, enlever la solution de fibronectine et rincer les flacons avec du PBS.
- Transfert de l'ancien «conditionnée» des médias à partir des cellules d'être repiquées à la nouvelle fibronectine revêtement flacons (tels que la moitié du volume final de médias pour chaque ballon sera le «conditionnée» des médias). Ces conditions de culture aider à maintenir ces cellules dans leur état indifférencié.
- Une fois que tous les médias est enlevé des cellules à être repiquées, rincer les cellules une fois avec du PBS. Prenez soin de ne pas sécher les cellules.
- Ajouter dissociation cellulaire Tampon (CDB) directement sur les cellules (1,0-1,5 ml pour un flacon T25). Incuber les cellules dans le tampon pendant environ 5 minutes à température ambiante. Tapotant doucement le flacon permettra d'accélérer le détachement cellulaire.
Centrifugation, remise en suspension, et les cellules Placage
- Ajouter sérum contenant des médias (DMEM: F12 avec 10% inactivé à la chaleur sérum de veau fœtal) (utiliser ~ 3X le volume de la CDB) dans le ballon avec des cellules individuelles. Retirez le papier et les cellules d'un tube de 15 ml conique. Utiliser un petit volume de sérum frais milieux contenant pour rincer le flacon et récupérer des cellules résiduelles.
- Centrifuger les médias et les cellules à 1000 rpm (~ 200xg) pendant 5 minutes.
- Aspirer les médias contenant du sérum et de remettre en suspension les cellules dans des milieux de culture frais, pipetage haut et bas pour faire une suspension cellulaire homogène.
- Transfert de la moitié des cellules resuspendues dans chaque nouveau flacon pour une fraction de 01h02. Notez le numéro de nouveau passage sur le flacon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nous avons trouvé que ce protocole fournit des cultures fiable de hNSPCs. Un facteur essentiel pour nos cellules est qu'elles doivent être maintenues en tant que cultures assez dense et ne peuvent pas être passées, au point que les cellules sont clairsemées. Dans nos mains, les cultures poussent très lentement clairsemées ou complètement cessent de se diviser. Pour cette raison, nous avons l'habitude diviser nos cultures 1:2 ou 1:3 quand une culture est extrêmement dense. Revêtement de la surface d'une boîte de culture avec de la fibronectine est important car il favorise la fixation des cellules bonne et la migration, mais, contrairement à la laminine, il permet également l'utilisation de cellules tampon de dissociation (CDB) pour détacher les cellules. La fixation des cellules à la laminine est trop forte et nécessite l'utilisation d'une enzyme protéolytique (trypsine par exemple) pour le détachement cellulaire. Non enzymatique CDB est préférée à la trypsine, depuis le clivage protéolytique des protéines de surface cellulaire peut conduire à des changements morphologiques dans hNSPCs au fil du temps. En outre, hNSCPs culture dans des milieux conditionnés contribue à maintenir ces cellules dans leur état indifférencié.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Les auteurs remercient le Dr Philip H. Schwartz, de la National des Ressources Humaines des cellules souches neurales à l'Hôpital des Enfants, le comté d'Orange Institut de recherche pour fournir hNSPCs et de l'instruction initiale dans leur culture.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| BIT-9500 (BSA, Insulin, Transferrin) | Reagent | Stem Cell Technologies | 09500 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Reagent | Invitrogen | 15240-062 | |
| DMEM:F12 (1X) | Reagent | Invitrogen | 11330-032 | |
| EMEM (1X) | Reagent | Mediatech, Inc. | MT-10-010-CV | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Fetal Bovine Serum | Reagent | Invitrogen | 10437-028 | |
| FGF, human basic recombinant | Reagent | PeproTech Inc | 100-18B | |
| PDGF-AB | Reagent | PeproTech Inc | 100-00AB | |
| EGF, human recombinant | Reagent | BD Biosciences | CB40052 | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Cell Culture Flask, 25 cm2 | Tool | Corning | 10-126-28 | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Fibronectin, human, natural | Reagent | BD Biosciences | CB40008A | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Human Neural Stem/Precursor Cells | Cells | National Human Neural Stem Cell Resource | ||
| Cell Dissociation Buffer | Reagent | Invitrogen | 13150-016 |
References
- Flanagan, L. A., Rebaza, L. M., Derzic, S., Schwartz, P. H., Monuki, E. S. Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins. J. Neurosci. Res. 83, 845-856 (2006).
- Nethercott, H. N., Maxwell, H., Schwartz, P. H. Neural stem cell culture. Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide. Loring, J. F., Wesselschmidt, R. W., Schwartz, P. H. , Elsevier/Cell Press. (2007).
- Palmer, T. D., Schwartz, P. H., Taupin, P., Kaspar, B., Stein, S. A., Gage, F. H. Cell culture. Progenitor cells from human brain after death. Nature. 411, 42-43 (2001).
- Schwartz, P. H., Bryant, P. J., Fuja, T. J., Su, H., O'Dowd, D. K., Klassen, H. Isolation and characterization of neural progenitor cells from post-mortem human cortex. J Neurosci Res. 74, 838-851 (2003).
