Summary
La capacidad de manipular humana madre neurales / células precursoras (hNSPCs) in vitro permite investigar su utilidad como los trasplantes de células con fines terapéuticos y para explorar el desarrollo neuronal humano. Este protocolo presenta un método de cultivo y hNSPCs pases con la esperanza de la reproducibilidad de cada vez mayor de la investigación con células madre humanas.
Abstract
La capacidad de manipular humana madre neurales / células precursoras (hNSPCs) in vitro constituye un medio para investigar su utilidad como los trasplantes de células con fines terapéuticos, así como para explorar muchos de los procesos fundamentales del desarrollo humano y la patología neuronal. Este protocolo presenta un método simple de cultivo y hNSPCs pases con la esperanza de la normalización de esta técnica y el aumento de la reproducibilidad de la investigación con células madre humanas. El hNSPCs usamos fueron aislados de cadáveres corteza cerebral postnatal por el Instituto Nacional de Recursos Humanos de las células madre neurales y crecido como adherente culturas en frascos recubiertas con fibronectina (Palmer et al, 2001;.. Schwartz et al, 2003). Nosotros la cultura de nuestro hNSPCs en DMEM: F12 medio libre de suero suplementado con EGF, FGF y PDGF y el paso de las 1:02 aproximadamente cada siete días. Usando estas condiciones, la mayoría de las células en el cultivo mantienen una morfología bipolar y expresan marcadores de células madre indiferenciadas neural (como la nestina y Sox2).
Protocol
Nota: Para el cultivo de la rutina de nuestra hNSPCs, podemos cambiar el 50-100% de los medios de comunicación cada dos días y por lo general les paso 01:02 una vez por semana. La cultura de los medios de comunicación contiene un 20% BIT-9500, 1X factores de antibiótico / antimicótico, y el crecimiento (EGF, FGF y PDGF cada uno a 40 ng / ml) en DMEM: F12 medios de base.
Preparación del frasco recubiertas y disociar las células
- Para preparar nuevos frascos para las células pases, abrigo T25 frascos con 10 mg / ml de fibronectina humana en el EMEM durante 4 horas, o durante la noche, en un 37 ° C incubadora de cultivo de tejidos. Justo antes de los pases de las células, eliminar la solución de fibronectina y enjuague los frascos con PBS.
- La transferencia de la antigua "condicionada" medios de comunicación de las células para ser pasados al nuevo recubiertos de fibronectina frascos (por ejemplo, que la mitad del volumen final de los medios de comunicación para cada frasco será la "condición" los medios de comunicación). Estas condiciones de cultivo para mantener estas células en su estado indiferenciado.
- Una vez que todos los medios de comunicación se elimina de las células para ser pasados, lavar las células una vez con PBS. Tenga cuidado de no secar las células.
- Añadir disociación celular Buffer (CDB) directamente sobre las células (1,0 a 1,5 ml de un frasco T25). Se incuban las células en el búfer durante unos 5 minutos a temperatura ambiente. Golpeando suavemente el frasco ayudará a acelerar el desprendimiento de células.
Centrifugación, resuspensión, y las Pilas de Revestimiento
- Añadir el suero que contienen los medios de comunicación (DMEM: F12 con 10% inactivado por calor suero fetal bovino) (uso ~ 3 veces el volumen de la CDB) en el matraz con células desprendidas. Retire el papel y las células a un tubo cónico de 15 ml. Use una pequeña cantidad de suero fresco contiene los medios de comunicación para enjuagar el frasco y se recuperan las células residuales.
- Centrifugar los medios de comunicación y las células a 1000 rpm (~ 200xg) durante 5 minutos.
- Aspiración de los medios de comunicación que contiene suero y resuspender las células en medio de cultivo fresco, pipeteando arriba y abajo para hacer una suspensión celular homogénea.
- La transferencia de la mitad de las células se resuspendieron en cada nuevo frasco de una división de 1:2. Anote el número de paso de nuevo en el frasco.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hemos encontrado que este protocolo ofrece culturas fiable de hNSPCs. Un factor crítico para nuestras células es que tienen que ser lo bastante denso y las culturas no pueden ser pasados al punto de que las células son escasas. En nuestras manos, culturas escasa crecen muy lentamente o desaparecen completamente división. Por esta razón, se suelen dividir nuestras culturas 1:2 o 1:3 cuando la cultura es extremadamente denso. Revestimiento de la superficie de una placa de cultivo con fibronectina es importante, ya que promueve la unión de las células buenas y las migraciones, pero, a diferencia de la laminina, sino que también permite el uso de disociación celular Buffer (CDB) para separar las células. La adhesión celular a la laminina es muy fuerte y requiere el uso de una enzima proteolítica (por ejemplo, tripsina) para el desprendimiento de células. No enzimática CDB se prefiere a la tripsina ya la escisión proteolítica de las proteínas de superficie de la célula puede dar lugar a cambios morfológicos en hNSPCs lo largo del tiempo. Además, hNSCPs cultivo en medios de comunicación acondicionado ayuda a mantener estas células en su estado indiferenciado.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Los autores agradecen el Dr. Philip H. Schwartz de la Comisión Nacional de Recursos Humanos de las células madre neurales en el Hospital de Niños del Condado de Orange el Instituto de Investigación para proporcionar hNSPCs y la instrucción inicial en su cultivo.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| BIT-9500 (BSA, Insulin, Transferrin) | Reagent | Stem Cell Technologies | 09500 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Reagent | Invitrogen | 15240-062 | |
| DMEM:F12 (1X) | Reagent | Invitrogen | 11330-032 | |
| EMEM (1X) | Reagent | Mediatech, Inc. | MT-10-010-CV | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Fetal Bovine Serum | Reagent | Invitrogen | 10437-028 | |
| FGF, human basic recombinant | Reagent | PeproTech Inc | 100-18B | |
| PDGF-AB | Reagent | PeproTech Inc | 100-00AB | |
| EGF, human recombinant | Reagent | BD Biosciences | CB40052 | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Cell Culture Flask, 25 cm2 | Tool | Corning | 10-126-28 | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Fibronectin, human, natural | Reagent | BD Biosciences | CB40008A | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Human Neural Stem/Precursor Cells | Cells | National Human Neural Stem Cell Resource | ||
| Cell Dissociation Buffer | Reagent | Invitrogen | 13150-016 |
References
- Flanagan, L. A., Rebaza, L. M., Derzic, S., Schwartz, P. H., Monuki, E. S. Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins. J. Neurosci. Res. 83, 845-856 (2006).
- Nethercott, H. N., Maxwell, H., Schwartz, P. H. Neural stem cell culture. Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide. Loring, J. F., Wesselschmidt, R. W., Schwartz, P. H. , Elsevier/Cell Press. (2007).
- Palmer, T. D., Schwartz, P. H., Taupin, P., Kaspar, B., Stein, S. A., Gage, F. H. Cell culture. Progenitor cells from human brain after death. Nature. 411, 42-43 (2001).
- Schwartz, P. H., Bryant, P. J., Fuja, T. J., Su, H., O'Dowd, D. K., Klassen, H. Isolation and characterization of neural progenitor cells from post-mortem human cortex. J Neurosci Res. 74, 838-851 (2003).
