Summary
A capacidade de manipular-tronco neurais humanas / precursor células (hNSPCs) in vitro permite investigar a sua utilidade como transplantes de células para fins terapêuticos e para explorar o desenvolvimento neural humano. Este protocolo apresenta um método de cultivo e hNSPCs passaging na esperança de reprodutibilidade crescente de pesquisas sobre células estaminais humanas.
Abstract
A capacidade de manipular-tronco neurais humanas / precursor células (hNSPCs) in vitro fornece um meio para investigar a sua utilidade como transplantes de células para fins terapêuticos, bem como para explorar muitos processos fundamentais do desenvolvimento neural humana e patologia. Este protocolo apresenta um método simples de cultura e hNSPCs passaging na esperança de padronizar esta técnica e aumentar a reprodutibilidade da pesquisa sobre células estaminais humanas. O hNSPCs usamos foram isolados a partir de cadáveres córtex cerebral pós-natal pela Célula de Recursos Humanos Neural Stem Nacional e cresceu como adepto culturas em frascos revestidos com fibronectina (Palmer et al, 2001;.. Schwartz et al, 2003). Nós nossa cultura hNSPCs em DMEM: F12 sem soro meios suplementados com EGF, FGF, PDGF e passagem e eles 1:02 aproximadamente a cada sete dias. Utilizando essas condições, a maioria das células na cultura manter uma morfologia bipolar e expressam marcadores de células indiferenciadas as células-tronco neurais (como nestina e Sox2).
Protocol
Nota: Para cultura de rotina do nosso hNSPCs, mudamos 50-100% dos meios de comunicação todos os dias e, geralmente, a passagem deles 01:02 uma vez por semana. A cultura da mídia contém BIT-9500 20%, 1X fatores antibiótico / antimicótico e crescimento (EGF, FGF, PDGF e cada um com 40 ng / ml) em DMEM: F12 media base.
Preparando o balão revestido e Dissociar as células
- Para preparar novos frascos para as células várias passagens, casaco T25 frascos com 10 mg / ml fibronectina humana no EMEM por 4 horas, ou durante a noite, em um 37 ° C a cultura de tecidos incubadora. Direito antes passaging as células, remova a solução fibronectina e enxaguar os frascos com PBS.
- Transferir o velho "condicionados" media a partir de células a ser várias passagens para o novo fibronectina revestido balões (de tal forma que metade do volume final de mídia para cada frasco será o "condicionada" de mídia). Estas condições de cultivo ajudar a manter essas células em seu estado indiferenciado.
- Depois de todos os meios de comunicação é removida das células para ser várias passagens, lavar as células uma vez com PBS. Tome cuidado para não secar as células.
- Adicionar celular dissociação Buffer (CDB) diretamente sobre as células (1,0-1,5 ml para um frasco T25). Incubar as células no buffer por cerca de 5 minutos à temperatura ambiente. Batendo o frasco vai ajudar a acelerar o desprendimento de células.
Centrifugação, ressuspensão e Células Plating
- Adicionar soro contendo media (DMEM: F12 com 10% inativado pelo calor soro fetal bovino) (use ~ o volume de 3X CDB) para o frasco com as células destacadas. Remova a mídia e as células para um tubo de 15 ml. Use um pequeno volume de soro fresco contendo mídia para lavar o balão e recuperar as células residual.
- Centrifugar a mídia e as células a 1000 rpm (~ 200xg) por 5 minutos.
- Sucção fora da mídia contendo soro e ressuspender as células em meio de cultura fresco, pipetando para cima e para baixo para fazer uma suspensão celular homogênea.
- Transferência de metade das células ressuspenso em cada frasco novo para um split 1:2. Anote o número de nova passagem sobre o frasco.
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Discussion
Descobrimos que este protocolo proporciona culturas confiável de hNSPCs. Um fator crítico para as nossas células é que elas precisam ser mantidas como culturas bastante densa e não pode ser várias passagens a tal ponto que as células são esparsas. Em nossas mãos, culturas esparsas crescem muito lentamente ou deixam completamente de se dividir. Por essa razão, costumamos dividir nossas culturas 1:2 ou 1:3 quando uma cultura é extremamente densa. Superfície do revestimento de uma placa de cultura com fibronectina é importante, pois promove a ligação célula boa e migração, mas, ao contrário de laminina, que também permite o uso de celular dissociação Buffer (CDB) para destacar as células. A adesão a laminina é muito forte e requer o uso de uma enzima proteolítica (por exemplo, a tripsina) para desprendimento de células. Não-enzimática CDB é preferível a tripsina desde clivagem proteolítica de proteínas de superfície celular pode levar a alterações morfológicas no hNSPCs ao longo do tempo. Além disso, hNSCPs cultura nos meios de comunicação condicionado ajuda a manter essas células em seu estado indiferenciado.
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Acknowledgments
Os autores agradecem o Dr. Philip H. Schwartz da Célula de Recursos Humanos Neural Stem Nacional no Hospital da Criança, Orange County Instituto de Pesquisa para a prestação de hNSPCs e instrução inicial em sua cultura.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| BIT-9500 (BSA, Insulin, Transferrin) | Reagent | Stem Cell Technologies | 09500 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Reagent | Invitrogen | 15240-062 | |
| DMEM:F12 (1X) | Reagent | Invitrogen | 11330-032 | |
| EMEM (1X) | Reagent | Mediatech, Inc. | MT-10-010-CV | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Fetal Bovine Serum | Reagent | Invitrogen | 10437-028 | |
| FGF, human basic recombinant | Reagent | PeproTech Inc | 100-18B | |
| PDGF-AB | Reagent | PeproTech Inc | 100-00AB | |
| EGF, human recombinant | Reagent | BD Biosciences | CB40052 | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Cell Culture Flask, 25 cm2 | Tool | Corning | 10-126-28 | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Fibronectin, human, natural | Reagent | BD Biosciences | CB40008A | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Human Neural Stem/Precursor Cells | Cells | National Human Neural Stem Cell Resource | ||
| Cell Dissociation Buffer | Reagent | Invitrogen | 13150-016 |
References
- Flanagan, L. A., Rebaza, L. M., Derzic, S., Schwartz, P. H., Monuki, E. S. Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins. J. Neurosci. Res. 83, 845-856 (2006).
- Nethercott, H. N., Maxwell, H., Schwartz, P. H. Neural stem cell culture. Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide. Loring, J. F., Wesselschmidt, R. W., Schwartz, P. H. , Elsevier/Cell Press. (2007).
- Palmer, T. D., Schwartz, P. H., Taupin, P., Kaspar, B., Stein, S. A., Gage, F. H. Cell culture. Progenitor cells from human brain after death. Nature. 411, 42-43 (2001).
- Schwartz, P. H., Bryant, P. J., Fuja, T. J., Su, H., O'Dowd, D. K., Klassen, H. Isolation and characterization of neural progenitor cells from post-mortem human cortex. J Neurosci Res. 74, 838-851 (2003).
