Summary
Förmågan att manipulera mänskliga neurala stamceller / föregångare celler (hNSPCs) in vitro gör det möjligt att undersöka deras nytta som cell transplantationer i terapeutiskt syfte och för att utforska människans neurala utveckling. Detta protokoll presenteras en metod för odling och passaging hNSPCs i hopp om att öka reproducerbarhet av mänskliga stamceller.
Abstract
Förmågan att manipulera mänskliga neurala stamceller / föregångare celler (hNSPCs) in vitro ger en möjlighet att undersöka deras nytta som cell transplantationer för terapeutiska ändamål samt att utforska många grundläggande processer av mänskliga neurala utveckling och patologi. Detta protokoll utgör en enkel metod för odling och passaging hNSPCs i hopp om att standardisera denna teknik och ökad reproducerbarhet av mänskliga stamceller. Det hNSPCs vi använder var isolerade från avliden efter födsel hjärnans cortex av National Human Neural Stem Cell Resurs och vuxit som anhängare kulturer på flaskor belagda med fibronektin (Palmer et al, 2001;.. Schwartz et al, 2003). Vi kulturen våra hNSPCs i en DMEM: F12 serumfritt medier kompletteras med fonden, FGF och PDGF och passagen dem 01:02 ungefär var sjunde dag. Med hjälp av dessa villkor, majoriteten av cellerna i kulturen upprätthålla en bipolär morfologi och uttrycka markörer för odifferentierade neurala stamceller (som nestin och sox2).
Protocol
Obs: För rutinmässig odling av våra hNSPCs, vi ändrar 50-100% av media varannan dag och oftast passagen dem 1:02 gång i veckan. Kulturen medier innehåller 20% BIT-9500, 1X antibiotika / antimykotika och tillväxtfaktorer (EGF, FGF och PDGF vardera 40 ng / ml) i DMEM: F12 basen medier.
Förbereda Coated Flask och ta avstånd Celler
- För att förbereda nya flaskor för passerats celler, päls T25 kolvar med 10 mikrogram / ml humant fibronektin i EMEM i 4 timmar eller över natten, i ett 37 ° C vävnadskultur inkubator. Precis innan passaging cellerna, ta bort fibronektin lösningen och skölj kolvar med PBS.
- Överför gamla "betingade" media från celler som skall passerats till den nya fibronektin-belagda kolvar (så att halva slutliga volymen av media för varje kolv kommer att vara "villkorat" media). Dessa odling villkor hjälper till att hålla dessa celler i sitt odifferentierade tillstånd.
- När allt material tas bort från celler som skall passerats, spola cellerna en gång med PBS. Var noga med att inte torka ut i cellerna.
- Lägg Cell Dissociation Buffer (CDB) direkt på celler (1,0-1,5 ml för en T25 kolv). Inkubera cellerna i bufferten i ca 5 minuter i rumstemperatur. Försiktigt trycka kolven kommer att hjälpa till att snabba upp cellen lossnar.
Centrifugering, Resuspending och celler Plating
- Lägg serum innehållande media (DMEM: F12 med 10% värmeinaktiveras fetalt bovinserum) (använd ~ 3X volymen CDB) till kolven med fristående celler. Ta bort media och celler till en 15 ml koniska rör. Använd en liten mängd färskt serum innehållande media att skölja kolven och återhämta kvarvarande celler.
- Centrifugera i media och celler vid 1000 rpm (~ 200xg) i 5 minuter.
- Sug bort serum innehållande media och återsuspendera cellerna i färska kulturmedia pipettera upp och ned för att göra en homogen cellsuspension.
- Överföring hälften av den återsuspenderade celler till varje ny kolv för ett 01:02 split. Notera den nya passagen nummer på kolven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har funnit att detta protokoll ger tillförlitliga kulturer hNSPCs. En kritisk faktor för våra celler är att de måste hållas som tämligen tät kulturer och kan inte passerats till den grad att cellerna är gles. I våra händer, glesa kulturer växer mycket långsamt eller helt upphör att dela sig. Av denna anledning delar vi oftast våra kulturer 1:2 eller 1:3 när en kultur är mycket tät. Beläggning ytan av en kultur fat med fibronektin är viktigt eftersom det främjar god cellbindning och migration, men till skillnad från laminin, även tillåter användningen av Cell Dissociation Buffer (CDB) för att lösgöra cellerna. Cellbindning till laminin är för stark och kräver användning av en proteolytiska enzym (t ex trypsin) för cell lossnar. Icke-enzymatiska CDB är att föredra framför trypsin sedan proteolytisk klyvning av proteiner cellytan kan leda till morfologiska förändringar i hNSPCs över tiden. Dessutom hjälper odling hNSCPs i betingad media upprätthålla dessa celler i sitt odifferentierade tillstånd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Författarna erkänner tacksamt Dr Philip H. Schwartz av den nationella människorättskommissionen Neural Stem Cell Resurs vid barnsjukhuset i Orange County Forskningscentralen för att ge hNSPCs och inledande undervisning i sin odling.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| BIT-9500 (BSA, Insulin, Transferrin) | Reagent | Stem Cell Technologies | 09500 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Reagent | Invitrogen | 15240-062 | |
| DMEM:F12 (1X) | Reagent | Invitrogen | 11330-032 | |
| EMEM (1X) | Reagent | Mediatech, Inc. | MT-10-010-CV | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Fetal Bovine Serum | Reagent | Invitrogen | 10437-028 | |
| FGF, human basic recombinant | Reagent | PeproTech Inc | 100-18B | |
| PDGF-AB | Reagent | PeproTech Inc | 100-00AB | |
| EGF, human recombinant | Reagent | BD Biosciences | CB40052 | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Cell Culture Flask, 25 cm2 | Tool | Corning | 10-126-28 | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Fibronectin, human, natural | Reagent | BD Biosciences | CB40008A | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Human Neural Stem/Precursor Cells | Cells | National Human Neural Stem Cell Resource | ||
| Cell Dissociation Buffer | Reagent | Invitrogen | 13150-016 |
References
- Flanagan, L. A., Rebaza, L. M., Derzic, S., Schwartz, P. H., Monuki, E. S. Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins. J. Neurosci. Res. 83, 845-856 (2006).
- Nethercott, H. N., Maxwell, H., Schwartz, P. H. Neural stem cell culture. Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide. Loring, J. F., Wesselschmidt, R. W., Schwartz, P. H. , Elsevier/Cell Press. (2007).
- Palmer, T. D., Schwartz, P. H., Taupin, P., Kaspar, B., Stein, S. A., Gage, F. H. Cell culture. Progenitor cells from human brain after death. Nature. 411, 42-43 (2001).
- Schwartz, P. H., Bryant, P. J., Fuja, T. J., Su, H., O'Dowd, D. K., Klassen, H. Isolation and characterization of neural progenitor cells from post-mortem human cortex. J Neurosci Res. 74, 838-851 (2003).
