Summary
نظهر كيف يمكن استخدام جذور النباتات شعر مركب لدراسة النباتات الريزوبيم التفاعلات وnodulation في الأنواع يصعب تحويل -
Abstract
مشابهة لtumerfaciens الأجرعية ، يمكن rhizogenes الأجرعية نقل السلطات الوطنية المعينة الاجانب الى خلايا النبات على أساس الحكم الذاتي الذي يحفز الجذر (ري) البلازميد ألف. يمكن أن يسبب شعر rhizogenes تشكيل الجذر على الأنسجة النباتية والنباتات شكل مركب بعد التحول. مركب على هذه النباتات ، وبعض من الجذور وإعادة إحياء المعدلة وراثيا ، التي تحمل نوع T - DNA البرية وناقلات ثنائية هندسيا ، بينما يطلق النار لا تزال غير المعدلة وراثيا ، ويعملون على توفير الطاقة ودعم النمو. وهذه النباتات جذر شعر مركب لا تنتج البذور المعدلة وراثيا ، ولكن هناك عددا من الميزات الهامة التي تجعل من هذه النباتات المركبة مفيدة جدا في مجال البحوث النباتية. أولا ، مع طائفة واسعة المضيف ، A. ويمكن تحويل rhizogenes الأنواع النباتية كثيرة ، ولا سيما dicots ، مما يسمح للهندسة الوراثية في مجموعة متنوعة من الأنواع. الثانية ، A. rhizogenes يصيب الأنسجة وexplants مباشرة ، ولا الثقافات الأنسجة قبل التحول من الضروري الحصول على النباتات المركبة ، مما يجعلها مثالية لتحويل الأنواع النباتية المتمردة. وعلاوة على ذلك ، يمكن توليد أنسجة الجذر المعدلة وراثيا في غضون أسابيع. لtruncatula Medicago ، يمكننا الحصول على الجذور كما المعدلة وراثيا في فترة قصيرة تبلغ ثلاثة أسابيع ، وأسرع من الانخفاض الطبيعي التحول الأزهار Arabidopsis. عموما ، وشعر تكنولوجيا جذور النباتات المركب هو أداة مرنة ومفيدة لدراسة وظائف الجينات والجذر الظواهر ذات الصلة. هنا علينا أن نظهر كيف يمكن استخدام جذور النباتات شعر مركب لدراسة النباتات الريزوبيم التفاعلات وnodulation في M. يصعب تحويل الأنواع truncatula.
Protocol
وقد استخدم البروتوكول التالي لإنشاء محطات الجذر شعر مركب في أنواع البقول طراز M. truncatula. وقد تم تكييف بروتوكولات مماثلة لأنواع النباتات لا يقل عن ثمانية 1-4. استخدمنا M. truncatula النباتات الجذرية شعر مركب لدراسة وظائف الجينات في جذر والتنمية العقيدات. تم فصل البروتوكول إلى أربعة أقسام : 1) إعداد المواد النباتية ؛ 2) محطات توليد جذر شعر مركب ، 3) التكافلية العدوى الوزن الرطب ؛ و 4) المعدلة وراثيا تحديد الجذر. استخدمنا ناقلات الثنائية التي تحتوي على بروتين الفلورية الخضراء (GFP) الجين كمراسلة لفحص جذور النباتات المعدلة وراثيا في مركب 3. مقارنة مع المضادات الحيوية القائمة على الاختيار ، القائم على الفحص GFP سريعة ، سهلة ، وغير مكلفة. في بناء لدينا ، هو الدافع وراء ER - التعبير الأمثل عن طريق الجينات GFP مروج للاليوبيكويتين السوبر ، الذي إشارات قوية في الجذور التأسيسية GFP المعدلة وراثيا ، مما يسمح للجذور التمييز بسهولة بين المعدلة وراثيا وغير المعدلة وراثيا.
1. إعداد مواد نباتية
- ويتم حصاد البذور M. truncautla من النباتات التي تزرع في الدفيئة (الرطوبة النسبية 50 ٪ ، 16 / 8 ح الضوء / الظلام ، 22/18 درجة مئوية اليوم / الليلة درجة الحرارة). ويمكن تخزين البذور الناضجة في 4 درجة مئوية.
- ومشطوب البذور في حوالي 100 مل من حامض الكبريتيك 10 المركزة (95-98 ٪ ، سيغما الدريخ ، MO) لمدة 10 دقيقة مع اهتزاز الدورية.
- يتم شطف البذور 5-7 مرات بالماء المعقم مع الإثارة لطيف.
- ثم يتم نقع البذور في الماء في درجة حرارة الغرفة لمدة 6 ساعات والاحتفاظ بها في 4 درجات مئوية لمدة 36-48 ساعة لمزامنة الإنبات.
- وتنتشر حوالي 20-30 البذور على أوراق الترشيح رطبة توضع في طبق بتري. يتم الاحتفاظ بها عند 22 درجة مئوية ، مع 16 / 8 ح الضوء / الظلام دورة ، و 40 μmol.m -2. ق شدة الضوء -1 ، لمدة 5-6 أيام.
- يتم نقل الشتلات نبتت في التربة ، ووضعها في الاحتباس الحراري لمدة شهر.
2. محطات توليد جذر مركب مشعر
- تحولت يبني ثنائي تحمل جينات من الاهتمام إلى A. rhizogenes باستخدام البروتوكولات القياسية. وهندستها لدينا مجموعة من ناقلات ثنائية تحتوي على الجين GFP كعلامة التي تسهل فحص الأنسجة وراثيا. تحتوي هذه النواقل المختلفة والمروجين لها جميع مواقع الاستنساخ عبارة (Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا) للتعبير عن مدى أو إسكات الجينات المستهدفة 3،5.
- هو مثقف rhizogenes ألف رطل في المتوسط 50ml مع اختيار المضادات الحيوية المناسبة عند 28 درجة مئوية لمدة 16-24 ساعة.
- تجمع البكتيريا وإعادة تعليق على التركيز النهائي للOD 600 = 0.3 في النيتروجين خالية من المغذيات النباتية حل (الجدول رقم 1 و 6).
- شعر لدعم التجديد الجذري ، ومصفوفة دعم معقمة ("الصوف الصخري" ، Hummert الدولية ، والأرض ، مدينة MO) ويقتطع من المقابس من حوالي 3 سم 3. نضع 4 شمعات في طبق بتري واحد.
- وشوهدت حفرة على رأس كل المكونات باستخدام ماصة الحافة لتسهيل إدخال explants ألف. يضاف rhizogenes (5 مل) إلى كل المكونات.
- ويستأصل قسم تبادل لاطلاق النار مع البراعم الإبطية 2-3 قبل قطع مائلة. ثم يتم إدراج يزدرع في المكونات ، ونمت عند 22 درجة مئوية لمدة نحو ثلاثة أسابيع. علينا أن نحافظ على explants Medicago دون سقي في الأيام ال 10 الأولى ، ثم ، والمياه لهم حل النيتروجين 5 مل خالية عند الضرورة. وجدنا ان ازالة النسيج الإنشائي القمي قد تقلل من تشكيل جذور العرضي.
3. التكافلية الوزن الرطب (Sinorhizobium Meliloti) العدوى
- بعد ثلاثة أسابيع ، فإن بعض جذور عرضية تخرج من الصوف الصخري. يتم نقل النباتات الجذرية شعر مركب إلى الرمل أو الفيرميكوليت (معقمة) ، مع أو من دون الصوف الصخري. أنها نمت في الاحتباس الحراري الى 22 درجة مئوية ، 16 / 8 ح الضوء / الظلام دورة ، و 300 μmol.m -2. ق -1 شدة الضوء لمدة أكثر من أسبوع.
- الوزن الرطب قبل الإصابة ، S. هو مثقف meliloti 1201 في 50 - استخراج مانيتول الخميرة مل متوسطة لمدة 7 أيام عند 30 درجة مئوية (الجدول رقم 2 ، و6،7).
- مخففة إعادة علقت خلايا الوزن الرطب إلى تركيز النهائي من OD 600 = 0.08 باستخدام النيتروجين حل التغذية الحرة. وتعليق 10 مل جديدة من S. تم تطبيق meliloti لكل مصنع المركبة للحث على تشكيل العقيدات.
4. تحديد الجذر المعدلة وراثيا
- بعد اسبوعين من التلقيح الوزن الرطب ، والنباتات مركب تصل الجذور عن طريق الغسيل في الماء. يمكن فصلها بسهولة الجذور من رمال أو البيرلايت في الماء.
- نضع جذور شعر تحت المجهر الأشعة فوق البنفسجية (نيكون SMZ1500 ، الإثارة 460 500nm ، 505nm مزدوج اللون ، الحاجز أكثر من 510nm). جذور المعدلة وراثيا هي GFP إيجابية والجذور هي العارض GFP سلبية. ثم نجمعها accordin الجذورز إشارة GFP ، وتحصي أعداد العقيدات ، وقياس طول الجذر ، وحساب الجذر الوحشي الكثافة. وتستخدم جذور GFP السلبية السيطرة.
5. ممثل النتيجة
في تجربتنا ، وإعادة إحياء جذور الشعر الجديد من explants في 2-3 أسابيع بعد A. rhizogenes innoculation. تحت المجهر الأشعة فوق البنفسجية ، والجذور وراثيا تحمل جينات GFP تظهر قوية مخضر (الشكل 1). وكان 25 ٪ من جذور أنتجت كمية من الجذور وإعادة إحياء جزء من جذور GFP إيجابية تعتمد على ظروف وبيئة explants نمو متوسط plants.On المركب وجذور شعر المعدلة وراثيا 3 لزيادة كفاءة التحول ، 1) عذاب غطاء من البلاستيك ، كما هو موضح في شريط الفيديو ، ويكفي للحفاظ على الرطوبة في علبة النمو خلال الأيام القليلة الأولى ، والنباتات لا تتطلب سوى القليل من الماء في الأيام القليلة الأولى. الري المفرط يضر تشكيل جذور شعر ؛ 2) تركيز innoculant الأجرعية مهم للتحول. كمية زائدة من الخلايا ليست مفيدة لتشكيل جذور شعر أو تشكيل العقيدات. لتكوين العقيدات ، والحل يحتاج إلى سقي النيتروجين خالية ، وإلا فإن العقيدات القليلة النموذج.
يمكن أن تتولد جذور النباتات شعر مركب باستخدام النبتات أو الشتلات entact كمادة انطلاق. تعديلات طفيفة على البروتوكول أعلاه هي ncessary لتوليد جذور شعر من الأنسجة الأخرى 8. الأهم من ذلك ، شعر كل جذر هو حدث التحول مستقلة. ولذلك ، فإن الظواهر التي لوحظت في مصنع واحد مركب من مجموع الأحداث transforamtion عديدة تحتاج إلى تأكيد من التكرار في محطات متعددة مركب
الشكل 1. يمكن فرز ألف جذور المعدلة وراثيا في الفترة من جذور شعر. وتم تشكيل العقيدات باء في جذور النباتات شعر مركب ، ونحن وضعت لمدة 4 أسابيع من العمر م. النباتات يمكن truncatula الجذر شعر تحت المجهر الأشعة فوق البنفسجية وجذور GFP إيجابية التعرف عليها بسهولة. (السهم الأحمر : GFP الجذرية ؛ السهم الأصفر : عدم GFP الجذر)
| الأوراق المالية | g/200ml | الأسهم مل / لتر |
| MgSO 4 0.7 H 2 O | 12.3 | 2 |
| CaCl 2 0.2 H 2 O | 14.7 | 4 |
| K 2 4 هبو 0.3 H 2 O | 6.8 | 1 |
| K 2 SO 4 | 11 | 4 |
| 3 الحديد الكلورين 0.6 H 2 O | 0.49 | 2.5 |
| المغذيات الدقيقة | انظر أدناه | 1 |
| المغذيات الدقيقة | ز للتر الواحد |
| H 3 BO 3 | 0،142 |
| MnSO 4. H 2 O | 0،077 |
| 4 ZnSO 0.7 H 2 O | 0.1725 |
| كبريتات النحاس 0.5 4 H 2 O | 0،037 |
| NaMoO 4. H 2 O | 0،024 |
| كوكلي 2. H 2 O | 0.0025 |
| NISO 4 | 0،001 |
الجدول 1. الحل التغذية Nitogen خالية
| K 2 HPO4 | 0.5g |
| كلوريد الصوديوم | 0.1g |
| MgSO 4 · 7H 2 O | 0.2g |
| مستخلصات الخميرة | 0.4g |
| مانيتول | 10G |
| الرقم الهيدروجيني = 6.8 |
الجدول 2. خلاصة الخميرة المتوسطة مانيتول (لتر)
Discussion
محطة توليد شعر جذر مركب هو وسيلة سريعة وسهلة للحصول على كميات كبيرة من المواد المعدلة وراثيا عن الأنواع dicot كثيرة. على الرغم من أن هذه الطريقة لا يمكن ان تنتج البذور المعدلة وراثيا ، يمكن أن تنتج المواد المعدلة وراثيا في غضون بضعة أسابيع. الأسلوب هو مناسبة خاصة بالنسبة للنباتات التي تجد صعوبة إقامة مزارع الأنسجة أو توليد transformants مستقرة. على مر السنين ، وقد استخدمنا هذه التقنية لدراسة وظائف الجينات ووظائفها المروج ، microRNAs ، الجذر الوحشي والتنمية الجذرية ، والدفاع ، واستجابات التوتر اللاأحيائية ، nodulation والعمليات التكافلية الأخرى ، والاستجابات هرمون التنميط الأيضية ، والتنميط الجيني ، وتحليل البروتين ، و غيرها من العمليات البيولوجية. البروتوكول هو قوية وقابلة للتكرار.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور كريس تايلور (جامعة ولاية أوهايو) لإدخال التكنولوجيا شعر الجذر إلى مختبرنا والدكاترة. Senthil سوبرامانيان (جنوب داكوتا جامعة ولاية) ، وخوان تشانغ (Ludong جامعة شاندونغ الصين) لتحسين البروتوكول. كما نشكر الدكتور تشنغ هاو (الزراعة جامعة نانجينغ) ليساعد في صنع هذا الفيديو. ويدعم هذا العمل في جزء من المنح المقدمة من وزارة الطاقة (DE - SC0001295) ، جبهة الخلاص الوطني (MCB - 0923779) وزارة الزراعة (2010-65116-20514) لOY
References
- Limpens, E., Ramos, J., Franken, C., Raz, V., Compaan, B., Franssen, H., Bisseling, T., Geurts, R. RNA interference in Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Arabidopsis and Medicago truncatula. J. Exp. Bot. 55, 983-992 (2004).
- Collier, R., Fuchs, B., Walter, N., Kevin, L. W., Taylor, C. G. Ex vitro composite plants: an inexpensive, rapid method for root biology. Plant J. 43, 449-457 (2005).
- Zhang, J., Subramanian, S., Stacey, G., Yu, O. Flavones and flavonols play distinct critical roles during nodulation of Medicago truncatula by Sinorhizobium meliloti. Plant J. 57, 171-183 (2009).
- Boisson-Dernier, A., Chabaud, M., Garcia, F., Becard, G., Rosenberg, C., Barker, D. G. Agrobacterium-rhizogenes-transformed roots of Medicago truncatula for the study of nitrogen-fixing and endomycorrhizal symbiotic associations. Mol. Plant-Microbe Interact. 14, 695-700 (2001).
- Zhang, J., Subramanian, S., Zhang, Y., Yu, O. Flavone synthases from Medicago truncatula are flavanone-2-hydroxylases and are important for nodulation. Plant Physiol. 144, 741-751 Forthcoming.
- Subramanian, S., Hu, X., Lu, G., Odelland, J., Yu, O. The promoters of two isoflavone synthase genes respond differentially to nodulation and defense signals in transgenic soybean roots. Plant Mol Biol. 54, 623-639 (2004).
- Vincent, J. A manual for the practical study of root nodule bacteria International Biological Program Handbook. , Blackwell Science Ltd. Oxford. 1-13 (1970).
- Subramanian, S., Graham, M. Y., Yu, O., Graham, T. L. RNA Interference of Soybean Isoflavone Synthase Genes Leads to Silencing in Tissues Distal to the Transformation Site and to Enhanced Susceptibility to Phytophthora sojae. Plant Physiol. 137, 1345-1353 (2005).
