Summary
Kıllı kök kompozit bitkiler, bitki-Rhizobium etkileşimleri ve nodül-dönüşümü zor olan türlerin çalışma nasıl kullanılabileceğini Biz göstermek
Abstract
Agrobacterium tumerfaciens benzer şekilde, Agrobacterium rhizogenes plazmid (Ri) kök neden özerk dayanan bitki hücre içine yabancı DNA'lar aktarabilirsiniz. A. rhizogenes bitki dokularında tüylü kök oluşumuna neden ve kompozit bitkiler dönüşüm sonrası oluşabilir. Bu bileşik tesisler üzerinde, rejenere köklerinin bazıları, vahşi tip T-DNA ve mühendislik ikili vektör taşıyan transgenik; sürgünler, enerji ve büyümesine destek sağlamak için hizmet veren, hâlâ, transgenik olmayan. Bu kıllı kök kompozit bitkilerin transgenik tohum üretmek değil, ama, çok faydalı olan bu kompozit bitkiler bitki araştırma yapmak önemli özelliklerinden bir dizi vardır. İlk olarak, geniş bir host yelpazesi ile, A. rhizogenes türlerde genetik mühendislik sağlayan, özellikle birçok bitki türleri, ikiçeneklilerin dönüştürebilirsiniz. İkincisi, A. rhizogenes doğrudan enfekte doku ve eksplantlar; inatçı bitki türleri dönüştürmek için ideal hale dönüşümü için önce herhangi bir doku kültürleri, kompozit bitkiler elde etmek için gerekli . Ayrıca, transgenik kök dokular, birkaç hafta içinde oluşturulabilir. Medicago truncatula için, biz, normal çiçek daldırma Arabidopsis dönüşümü daha hızlı, üç hafta gibi kısa transgenik kökleri elde edebilirsiniz. Genel olarak, kıllı kök kompozit santrali teknolojisi, gen fonksiyonlarını incelemek ve ilgili-fenotipleri kök çok yönlü ve faydalı bir araçtır. Burada kıllı kök kompozit bitkiler bitki Rhizobium etkileşimleri ve nodül dönüşümü zor olan türlerin M. çalışma nasıl kullanılabileceğini göstermek truncatula.
Protocol
Aşağıdaki protokol, bir model baklagil türleri M. kıllı kompozit bitkilerin kök oluşturmak için kullanılan truncatula. Benzer protokolleri en az sekiz 1-4 bitki türleri için adapte edilmiştir. M. kullanılan truncatula kıllı kök kompozit bitkilerin kök ve nodül gelişimi gen fonksiyonları çalışma. 2) kıllı kök kompozit üretim tesisleri; 3) simbiyotik Rhizobia enfeksiyonu ve 4) transgenik kök kimlik bitki materyali hazırlama) 1: protokol dört bölüme ayrılmıştır. Biz transgenik kompozit bitkilerin kök 3 tarama için bir muhabir olarak, yeşil flüoresan protein (GFP) geni içeren ikili bir vektör kullandı. Antibiyotik-temelli seçimi ile karşılaştırıldığında, GFP tabanlı tarama, hızlı, kolay ve ucuzdur. Bizim inşa ER-ifade-optimize GFP geninin transgenik ve transgenik olmayan kökleri arasında kolay ayrım sağlayan, transgenik kökleri güçlü kurucu GFP sinyalleri süper ubikuitin organizatörü tarafından tahrik edilir.
1. Bitki Materyali Hazırlama
- M. truncautla tohumları serada yetiştirilen bitkiler (% 50 bağıl nem, 16 / 8 saat ışık / karanlık, 22/18 ° C gün / gece sıcaklık) hasat edilir. Olgun tohumları 4 ° C'de saklanabilir
- Yaklaşık 100 tohumları periyodik sallayarak 10 dakika için 10 ml konsantre sülfürik asit (% 95-98, Sigma-Aldrich, MO) Kırma.
- Tohumlar 5-7 kez yavaşça sallanarak steril su ile durulanır.
- Bu tohumlar daha sonra 6 saat boyunca oda sıcaklığında suya batırılmış ve 4 ° C 36-48 saat çimlenme senkronize etmek için tutulur.
- Yaklaşık 20-30 tohum, bir Petri kabındaki yerleştirilen nemli filtre kağıtları üzerinde yayılır. 22 korunur ° C, 16 / 8 saat aydınlık / karanlık döngüsünü ve 40 ile μmol.m -2 s -1 ışık yoğunluğu, 5-6 gün boyunca.
- Çimlenmiş fideler toprağa aktarılır ve bir ay boyunca sera yerleştirilir.
2. Tüylü Kök Kompozit Tesisleri oluşturuluyor
- İkili yapıları ilgi genleri taşıyan A. dönüştü standart protokolleri kullanarak rhizogenes. Biz transgenik dokuların tarama kolaylaştıracak bir belirteç olarak GFP genini içeren bir dizi ikili vektörler tasarladık. Bu bağlamda, çeşitli rehberleri içeren ve tüm Gateway aşırı ifadesi veya hedef genlerin 3,5, susturma klonlama siteleri (Invitrogen, Carlsbad, CA).
- A. rhizogenes uygun antibiyotik seçimi ile 28 50ml LB orta ° C de 16-24 saat kültür.
- Bakteriler azot bitki besin solüsyonu (Tablo 1 ve 6) = 0.3 toplanan ve OD 600, nihai konsantrasyonu yeniden askıya alınır.
- Kıllı kök rejenerasyon, steril bir matriks (Taşyünü ", Hummert Uluslararası, Earth City, MO) desteklemek için yaklaşık 3 cm 3 fişler halinde kesilir. Biz 4 fişler bir Petri kabı içine yerleştirin.
- Eksplantlar ekleme kolaylaştırmak için bir pipet kullanarak her fiş üstüne bir delik dürttü. A. rhizogenes (5 ml) her fiş eklenir.
- 2-3 aksiller tomurcukları ile bir çekim bölümünde çekik bir kesim tarafından eksize edilir. Eksplant sonra fişi içine eklenir ve 22 ° C'de yaklaşık üç hafta boyunca yetiştirilen. Biz 5 ml azot içermeyen bir çözüm gerektiğinde su onları, daha sonra, ilk 10 gün boyunca sulama olmadan Medicago eksplantlar tutmak . Biz apikal meristem çıkarmadan adventif köklerin oluşumunu düşürebilir bulundu.
3. Simbiyotik Rhizobia (Sinorhizobium meliloti) Enfeksiyon
- Üç hafta sonra, bazı adventif kökler Taşyünü ortaya çıkacaktır. Kıllı kök kompozit bitkiler Taşyünü ile veya olmadan, kum veya vermikülit (steril) aktarılır. Bu serada yetiştirilen 22 ° C, 16 / 8 saat aydınlık / karanlık döngüsü, ve 300 μmol.m -2 -1 ışık yoğunluğu bir hafta daha.
- Rhizobia enfeksiyonu, S. önce meliloti 1201, 50 ml maya özü-mannitol 30 ° C (Tablo 2 ve 6,7) 7 gün boyunca orta kültüre .
- Yeniden askıya rhizobia hücreleri OD 600 nihai konsantrasyonu = 0.08 kullanarak azot ücretsiz beslenme çözüm seyreltilir. S. 10 ml taze süspansiyon meliloti nodül oluşumu ikna etmek için her kompozit tesisi yapıldı.
4. Transgenik Kök Tanımlama
- Rhizobia aşılama İki hafta sonra, bileşik bitkiler su ile yıkama kadar köklü. Kökleri, suda kolayca kum veya perlit ayrılabilir.
- Biz bir UV-mikroskop altında (Nikon SMZ1500 Uyartım 460-500nm, Dikroik 505nm, 510nm daha Bariyer) kıllı kökleri yer. Transgenik kökleri GFP pozitif ve adventif kökler GFP negatif. Daha sonra kökleri accordin toplamakg GFP sinyal ve nodül numaraları sayısı, kök uzunluğu ölçmek ve yan kök yoğunluğunu hesaplamak. GFP negatif kökleri kontrol olarak kullanılır.
5. Temsilcisi Sonucu
Yaptığımız denemelerde, yeni saç köklerinin A. eksplantlar sonra 2-3 hafta içinde yeniden rhizogenes aşılar. UV-mikroskop altında, GFP geni taşıyan transgenik kökleri güçlü yeşil floresan (Şekil 1). Rejenere kökleri ve GFP pozitif kökleri kısmını miktarı eksplantlar ve bileşik plants.On ortalama büyüme ortamı şartlarına bağlıdır, üretilen köklerinin% 25, transgenik kıllı kökleri 3. Dönüşüm verimliliği, 1) artırmak için videoda gösterildiği gibi plastik kapak azap, ilk birkaç gün boyunca büyüme tepsiye nemi korumak için yeterli olup, bitkilerin sadece ilk birkaç gün içinde çok az suya ihtiyaç duyarlar. Aşırı sulama kıllı kök oluşumu için zararlıdır; 2) Agrobacterium innoculant konsantrasyonu dönüşüm için önemlidir. Aşırı miktarda hücre kıllı kök oluşumu veya nodül oluşumu için yararlı değildir. Nodül oluşumu için, sulama çözüm azot serbest olması gerekir, aksi takdirde birkaç nodüller oluşturacak.
Kıllı kök kompozit bitkilerin başlangıç materyali olarak kotiledonlarında veya entact fide kullanarak oluşturulabilir. Yukarıdaki protokol sadece küçük değişiklikler diğer dokular 8 kıllı kökleri oluşturmak için ncessary. Önemli olan, her kıllı kök bağımsız bir dönüşüm olayı. Bu nedenle, tek bir kompozit bitki gözlenen fenotipleri birden fazla kompozit tesislerinde tekrarlar tarafından teyit edilmesi için gereken birkaç transforamtion olayların toplamıdır
Şekil 1. A. Transgenik kökleri kıllı kökleri dışarı sıralanabilir. B. Nodüller kıllı kök kompozit tesislerinde kuruldu. 4 haftalık M. yerleştirilir UV-mikroskop ve GFP pozitif kökleri altında truncatula kıllı kök bitkiler kolayca tespit edilebilir. (Kırmızı ok: GFP kök; Sarı ok: non-GFP kök)
| Hisse senedi | g/200ml | ml stok / litre |
| MgSO 4 .7 H 2 O | 12,3 | 2 |
| CaCl 2 .2 H 2 O | 14,7 | 4 |
| K 2 HPO 4 .3 H 2 O | 6,8 | 1 |
| K 2 SO 4 | 11 | 4 |
| Fe Cl 3 .6 H 2 O | 0,49 | 2,5 |
| Mikrobesinler | Aşağıya bakın | 1 |
| Mikrobesinler | g litre başına |
| H 3 BO 3 | 0,142 |
| MnSO 4 H 2 O | 0,077 |
| ZnSO 4 .7 H 2 O | 0,1725 |
| CuSO 4 .5 H 2 O | 0,037 |
| NaMoO 4. H 2 O | 0,024 |
| CoCl 2. H 2 O | 0,0025 |
| Niso 4 | 0,001 |
(Tablo 1). Nitogen içermeyen bir beslenme çözümü
| K 2 HPO4 | 0.5g |
| NaCl | 0.1g |
| MgSO 4 · 7H 2 O | 0.2g |
| Maya Ekstraktı | 0.4g |
| Mannitol | 10g |
| pH = 6.8 |
Tablo 2. maya (litre) mannitol orta ayıklamak
Discussion
Kıllı kök kompozit bitki oluşturma birçok dikotil tür için transgenik malzeme büyük miktarlarda elde etmek için hızlı ve kolay bir yöntem. Bu yöntem, transgenik tohum üretemez rağmen, birkaç hafta içinde transgenik malzemeleri üretmek. Yöntemi zorluk doku kültürleri kurmak ya da istikrarlı transformants üreten tesisler için uygundur. Yıllar geçtikçe, genlerin fonksiyonlarının, organizatörü fonksiyonları, microRNA, kök ve yan kök gelişimi, savunma ve abiyotik stres tepkileri, nodül ve diğer simbiyotik süreçleri, hormon yanıtları, metabolik profil, gen profilleme, proteomik analiz ve incelemek için bu teknolojiyi kullandık diğer biyolojik süreçler. Protokol sağlam ve tekrarlanabilir.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Yazarlar bizim laboratuar ve Dr kıllı kök teknolojisini tanıtmak için Dr. Chris Taylor (Ohio State Üniversitesi) teşekkür etmek istiyorum. Senthil Subramanian (South Dakota State Üniversitesi), protokol geliştirmek için Juan Zhang (Çin Shandong Ludong Üniversitesi). Biz aynı zamanda bu video yapımında yardımcı olan Dr Hao Cheng (Nanjing Tarım Üniversitesi) teşekkür ederim. Bu çalışma OY DOE (DE-SC0001295), NSF (MCB-0.923.779) ve USDA (2010-65116-20514) hibe kısmen desteklenen
References
- Limpens, E., Ramos, J., Franken, C., Raz, V., Compaan, B., Franssen, H., Bisseling, T., Geurts, R. RNA interference in Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Arabidopsis and Medicago truncatula. J. Exp. Bot. 55, 983-992 (2004).
- Collier, R., Fuchs, B., Walter, N., Kevin, L. W., Taylor, C. G. Ex vitro composite plants: an inexpensive, rapid method for root biology. Plant J. 43, 449-457 (2005).
- Zhang, J., Subramanian, S., Stacey, G., Yu, O. Flavones and flavonols play distinct critical roles during nodulation of Medicago truncatula by Sinorhizobium meliloti. Plant J. 57, 171-183 (2009).
- Boisson-Dernier, A., Chabaud, M., Garcia, F., Becard, G., Rosenberg, C., Barker, D. G. Agrobacterium-rhizogenes-transformed roots of Medicago truncatula for the study of nitrogen-fixing and endomycorrhizal symbiotic associations. Mol. Plant-Microbe Interact. 14, 695-700 (2001).
- Zhang, J., Subramanian, S., Zhang, Y., Yu, O. Flavone synthases from Medicago truncatula are flavanone-2-hydroxylases and are important for nodulation. Plant Physiol. 144, 741-751 Forthcoming.
- Subramanian, S., Hu, X., Lu, G., Odelland, J., Yu, O. The promoters of two isoflavone synthase genes respond differentially to nodulation and defense signals in transgenic soybean roots. Plant Mol Biol. 54, 623-639 (2004).
- Vincent, J. A manual for the practical study of root nodule bacteria International Biological Program Handbook. , Blackwell Science Ltd. Oxford. 1-13 (1970).
- Subramanian, S., Graham, M. Y., Yu, O., Graham, T. L. RNA Interference of Soybean Isoflavone Synthase Genes Leads to Silencing in Tissues Distal to the Transformation Site and to Enhanced Susceptibility to Phytophthora sojae. Plant Physiol. 137, 1345-1353 (2005).
