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Neuroscience

एकल कक्ष की transcriptome विश्लेषण

Published: April 25, 2011 doi: 10.3791/2634
Automatic Translation
*1, *1, 1,2
1Department of Pharmacology, University of Pennsylvania, 2The Penn Genome Frontiers Institute, University of Pennsylvania
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

इस अनुच्छेद में हम चूहे प्राथमिक neuronal संस्कृतियों और बाद transcriptome ARNA प्रवर्धन विश्लेषण का उपयोग से एकल कक्षों की कटाई के लिए एक सरल विधि का वर्णन. यह दृष्टिकोण किसी भी कोशिका प्रकार के generalizable है.

Protocol

1. सेल संस्कृति

हमारी प्रयोगशाला प्रयोगों के लिए नीचे प्राथमिक neuronal चूहे hippocampal संस्कृतियों का उपयोग करता है. निम्नलिखित कैसे इन सेल संस्कृतियों बनाया और रखरखाव के लिए संशोधित बैंकर प्रोटोकॉल का वर्णन 9 वहाँ पाठ्यक्रम के होते हैं, इन सेल संवर्धन तकनीकों का क्रमपरिवर्तन है और किसी भी स्थापित विधि का एक संपूर्ण संख्या एक विशेष प्रयोगशाला है कि एक प्रदान करता है की विशिष्ट आवश्यकताओं के लिए सिलवाया. कक्षों की लगातार स्वस्थ आपूर्ति एक उपयुक्त विकल्प होगा.

  1. पांच autoclaved, गोल, 12 मिमी coverslips एक 35 मिमी डिश में रखा जाता है और 80 μg / एमएल borate बफर हे / एन में पाली-D-Lysine (70-150,000 मेगावाट) के साथ लेपित, पानी (सेल संस्कृति ग्रेड) के साथ rinsed, तो 1 / borate बफर हे N / एमएल laminin μg के साथ लेपित तो पानी के साथ फिर से rinsed. एनजी मीडिया (साल्ट है Earle और GlutaMAX ग्लूकोज (0.6% / w ध्) के साथ पूरक, पेनिसिलिन (100 यू / एमएल), स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 μg / एमएल), घोड़े सीरम (10% v / v) के साथ सदस्य) जोड़ा और है बर्तन एक मशीन (5% 37 पर सीओ 2 ° सी) में संग्रहीत हैं . PDL150/laminin पृथक न्यूरॉन्स पर एक monolayer के रूप में बढ़ने के लिए एक सब्सट्रेट के रूप में कार्य करता है. coverslips दो सप्ताह के लिए चढ़ाना पहले लेपित किया जा सकता है.
  2. चढ़ाना के दिन पर, भ्रूण दिन 18 चूहे hippocampi से प्राथमिक न्यूरॉन्स एनजी मीडिया में एक 100,000 कोशिकाओं / एमएल निलंबन की 1.5 एमएल जोड़कर चढ़ाया जाता है. चढ़ाना के बाद चार से छह घंटे, प्रत्येक 35 मिमी पकवान 5 मिमी 0.75 μL साइटोसिन बीटा डी arabinofuranoside (आरा सी) किसी भी contaminating glial कोशिकाओं के विकास को रोकने के लिए के साथ इलाज किया जाता है. चौबीस घंटे बाद, चढ़ाना मीडिया सदस्य के लिए है Earle लवण और 0.6 w / ध् ग्लूकोज%, 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट, और B27 के साथ पूरक एल-glutamine के साथ बदल रहा है. कक्ष के लिए किसी भी प्रयोगों में उपयोग करने से पहले कम से कम दो सप्ताह के लिए विकसित करने के लिए प्रक्रियाओं के पूर्ण विकास की अनुमति की अनुमति दी हैं.

2. तैयारी pipettes

RNases पर ध्यान दें: त्वचा, लार, और यहाँ तक कि सांस RNases के प्रमुख स्रोतों, एंजाइमों कि शाही सेना नीचा कर रहे हैं. यह आवश्यक है कि RNase मुक्त तकनीक प्रोटोकॉल ताकि नमूना RNases के साथ दूषित नहीं बन करता है और बाद में नीचा में इस बिंदु से मनाया जा रहा है. यह भी शामिल है हमेशा दस्ताने पहने जब नमूनों और अभिकर्मकों से निपटने, नमूने या अभिकर्मकों पर कभी नहीं बात कर, और निष्फल विंदुक युक्तियाँ और ट्यूबों के नए बक्से का उपयोग. अक्सर, pipettes शाही सेना के काम के लिए विशेष रूप से नामित नहीं हैं कि उन्हें RNase दूर (आण्विक Bioproducts) के रूप में एक RNase उपचार समाधान के साथ नीचे पोंछते द्वारा decontaminated हैं. हालांकि, इन समाधान के किसी भी बहाव एंजाइमी प्रतिक्रियाओं को बाधित तो यह भी महत्वपूर्ण है इन उपचार के साथ अपने नमूनों के प्रदूषण को रोकने.

  1. आटोक्लेव 1.5 मिमी बाहरी व्यास (ओवर ड्राफ्ट) कांच pipettes.
  2. एक micropipette खींचने का प्रयोग, एक electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए उपयुक्त व्यास, जो आपके खींचने, रेशा, और pipettes के आधार पर भिन्न हो सकते हैं pipettes पुल 10 बोर का आकार बहुत महत्वपूर्ण है के बाद से टिप सेल संग्रह करने के लिए पहले टूट जाएगा नहीं है.
  3. ध्यान से धूल से मुक्त वातावरण जहां सुझावों बरकरार रहेगा (आदर्श एक micropipette भंडारण जार का उपयोग करें) में pipettes दुकान.
  4. एक नियंत्रित फैशन में टिप को तोड़ने के लिए, एक हाथ में अपनी उंगलियों के बीच तना हुआ kimwipe पकड़ और बहुत धीरे से कागज 1 से 2 बार के पार विंदुक टिप ब्रश. खोलने के लक्ष्य कक्ष आकार के लगभग 75-100% होना चाहिए. इस कदम को समायोजित करें जब तक आप इच्छित परिणाम प्राप्त करने के लिए.

3. तैयारी संस्कृति, ट्यूब, और माइक्रोस्कोप

  1. 1.7 एमएल Eppendorf ट्यूबों के वांछित संख्या तैयार है. अगर सामग्री के लिए एकल कक्ष amplifications, या काटा सामग्री के भंडारण के लिए किसी अन्य समाधान के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है Pbs, पहली कतरा बफर के 2 μL जोड़ें.
  2. कटाई के लिए, आप एक 40x micromanipulator के साथ फिट उद्देश्य के साथ एक प्रकाश माइक्रोस्कोप की आवश्यकता होगी. लचीला टयूबिंग धारक से दूर प्रमुख के साथ एक विंदुक धारक का उपयोग करें. एक स्थिर सतह विंदुक के संग्रह के दौरान अवांछित आंदोलन को रोकने के टयूबिंग प्रत्यय. टयूबिंग के अंत में, एक सुई ताकि Luer-बंद कनेक्शन के साथ एक 1 एमएल सिरिंज और संलग्न किया जा सकता है उपयोगकर्ताओं के बीच में बदल डालें.
  3. यदि coverslips का उपयोग करते हुए, एक समय में एक coverslip के साथ काम करते हैं. यदि आवश्यक हो, एक नई 35 मिमी * पसंद के पीबीएस या मीडिया से युक्त डिश के लिए एक एकल coverslip हस्तांतरण. अब कोशिकाओं को इनक्यूबेटर बाहर हैं, वे और अधिक अस्वस्थ हो जाते हैं और उनके mRNA प्रोफाइल कि एक स्वस्थ कोशिका के से हटना होगा. यह उन्हें इनक्यूबेटर में रख जब उनके साथ काम नहीं कर रहा द्वारा अन्य coverslips पर कोशिकाओं के स्वास्थ्य की रक्षा के लिए महत्वपूर्ण है. जितना जल्दी संभव हो इनक्यूबेटर बाहर कोशिकाओं के साथ कार्य करें.

* हमारे सेटअप के साथ एक 35 मिमी डिश के ढक्कन का उपयोग करने के लिए यह आवश्यक है के बाद से वास्तविक पकवान की दीवारों को भी coversli की ओर micropipette के उचित उन्नति की अनुमति के लिए उच्च रहे हैंपी.

4. फसल काटने वाले कक्ष

  1. Micropipette धारक में micropipette सुरक्षित. प्रत्यय micropipette धारक micromanipulators पर डालने के लिए. 40x उद्देश्य सेट करें.
  2. खुर्दबीन मंच पर पकवान प्लेस और फसल के लिए उपयुक्त कोशिकाओं के एक क्षेत्र को खोजने के. प्राथमिक neuronal संस्कृतियों के मामले में अपेक्षाकृत पृथक सेल अपने पड़ोसियों से कोशिकाओं के आसपास और / या प्रक्रियाओं की फसल को रोकने चाहिए. सोम और प्रक्रियाओं के बीच mRNA टेप की जनसंख्या भिन्न है, इसलिए अगर दैहिक mRNAs में रुचि रखते हैं केवल, देखभाल करने के लिए प्रक्रियाओं के साथ सोम के प्रदूषण को रोकने के लिया जाना चाहिए. सेल आप को देखने के क्षेत्र का केंद्र में फसल के लिए इच्छा रखें.
  3. Micromanipulator का प्रयोग प्रकाश पथ में पकवान में समाधान की ओर micropipette अग्रिम. समाधान में पिपेट टिप लोअर. पर सिरिंज के माध्यम से हल्के से उड़ाने की इस बिंदु से सकारात्मक दबाव लागू करें. ऐपिस के माध्यम से देखो. विंदुक देखने के क्षेत्र में एक छाया के रूप में प्रकट करना चाहिए. खैर, कोशिकाओं के विमान से ऊपर विंदुक टिप की स्थिति को समायोजित जब तक यह विंदुक टिप पर मोटे ध्यान केंद्रित knobs का उपयोग दृश्य और ध्यान के क्षेत्र के भीतर है. इस बिंदु पर, यह अगर विंदुक के बोर आकार बहुत बड़ी या बहुत छोटी है मूल्यांकन किया जाना चाहिए. अभ्यास कटाई अगर सही बोर आकार में इस बिंदु पर हासिल किया गया है निर्धारित करने के लिए की क्षमता प्रदान करेगा.
  4. अब, कोशिकाओं के विमान की ओर विंदुक अग्रिम. यह महत्वपूर्ण है कि टिप भी हड़बड़ी उन्नत नहीं है, यह जो इस क्षेत्र से आप को इकट्ठा करना चाहते हैं में तोड़ने के लिए कारण. इसे रोकने के लिए, मोटे ध्यान केंद्रित का उपयोग करें micromanipulators का उपयोग कोशिकाओं की ओर विंदुक टिप को आगे बढ़ाने से पहले फोकल हवाई जहाज़ अग्रिम. जब आप कोशिकाओं के करीब हैं, ठीक ध्यान केंद्रित का उपयोग करें जब तक दोनों कोशिकाओं और विंदुक टिप को ध्यान में हैं. सकारात्मक दबाव लागू करने से पहले आप coverslip की उन्हें बंद उड़ाने से रोकने के लिए कोशिकाओं के विमान तक पहुँचने बंद करो.
  5. का प्रयोग करें micromanipulators विंदुक टिप स्थिति इतनी है कि यह सेल सोम आप फसल चाहते छू रहा है.
  6. सिरिंज का प्रयोग, मुंह से कोमल चूषण लागू जब तक सेल विंदुक टिप में प्रवेश करती है. यदि कक्ष विंदुक नहीं प्रवेश कर रही है, धीरे टिप सेल और नीचे करीब कदम जब तक यह coverslip से लिफ्टों.

5. सेल सेविंग

  1. Micromanipulator प्रयोग तुरंत समाधान के विंदुक ऊपर और बाहर ले जाने के.
  2. धारक से विंदुक निकालें.
  3. एक हाथ में 1.7 एमएल Eppendorf ट्यूब पकड़ो और धीरे नीचे की ओर ट्यूब की तरफ विंदुक की नोक तोड़. (0.1 एमएल निशान के लिए निशाना लगाओ.)
  4. टूटी हुई ट्यूब के अंदर केंद्रित टिप के साथ, एक विंदुक के शीर्ष उद्घाटन में एक 1-3 एमएल सिरिंज से जुड़ी सुई डालने. तेजी से सवार पिपेट में समाधान मजबूर ट्यूब में बाहर स्प्रे दबाना. सेल पिपेट की बहुत टिप में रहते हैं और यह पर्याप्त होना चाहिए ठीक सेल निष्कासित चाहिए. सावधान रहो करने के लिए नहीं टिप ट्यूब के पक्षों पर कोई भी तरल स्पर्श के रूप में केशिका कार्रवाई पिपेट में तरल वापस लाना होगा.
  5. जल्दी से नीचे एक डेस्कटॉप microfuge का उपयोग कर ट्यूब की सामग्री स्पिन और तुरंत फ्रीज (-80 पर दुकान ° सी) या आगे की प्रक्रिया (बेहतर) के लिए बर्फ पर जगह.

6. ARNA प्रवर्धन

  1. 1 पहले कतरा सीडीएनए संश्लेषण दौर:
    MRNA / सीडीएनए संकर बनाएँ.
    1. एकल कक्ष संग्रह मात्रा के हर 5 μL के लिए संग्रह ट्यूब (बर्फ पर) 1x निम्न में से जोड़ना. प्रतिक्रिया बड़ा संग्रह संस्करणों के लिए बढ़ाया जा सकता है (10 μL संग्रह मात्रा, आदि के लिए 2x). त्रुटि pipetting के लिए खाते के लिए संग्रह ट्यूबों की संख्या से अधिक 10-20% द्वारा निम्नलिखित अभिकर्मकों गुणा करके एक मास्टर मिश्रण बनाएँ. ARNA ampification प्रक्रिया में हर बाद में प्रतिक्रिया के लिए यह मत करो.
      • बर्फ पर
      • 1.2 μL dNTP (2.5 मिमी प्रत्येक)
      • 2.4 μL 5x पहले कतरा बफर
      • 0.3 μL T7 oligo प्राइमर (डीटी) (100 / एनजी μL)
      • 1.2 μL डीटीटी (100 मिमी)
    2. मात्रा nuclease मुक्त पानी के साथ 10.25 μL ऊपर लाओ. पिपेट मिश्रण और स्पिन संक्षिप्त microfuge का उपयोग.
    3. 70 पर 5 मिनट के लिए सेते डिग्री सेल्सियस mRNA की किसी भी माध्यमिक संरचना denature. तुरंत कम से कम 5 मिनट के लिए बर्फ पर जगह है.
    4. जोड़ें (फिर से एक मास्टर मिश्रण का उपयोग कर):
      • 0.3 μL RNasin (40 यू / μL)
      • 0.45 μL सुपरस्क्रिप्ट क्ष्क्ष्क्ष् (200 यू μL /)
      • 1 μL nuclease मुफ्त पानी
    5. पिपेट मिश्रण और स्पिन संक्षिप्त. 42 पर 1 घंटे के लिए सेते डिग्री सेल्सियस
    6. 70 में सेते डिग्री सेल्सियस 15 मिनट के लिए सुपरस्क्रिप्ट निष्क्रिय करने के लिए. पर अगले कदम की ओर बढ़ें.
  2. एक दूसरा कतरा सीडीएनए संश्लेषण दौर
    संकर / mRNA डीएनए के mRNA भाग से शाही सेना प्राइमरों बनाएँ संश्लेषण ओ में सहायताच डबल सीडीएनए फंसे.
      • बर्फ पर
      • 12 μL पहली कतरा प्रतिक्रिया करने के लिए जोड़ने के लिए,
      • 8 μL nuclease मुफ्त पानी
      • 7.5 μL 5x दूसरा कतरा बफर
      • 0.75 μL dNTP मिश्रण (2.5 मिमी प्रत्येक)
      • 0.25 μL डीएनए ligase (10 यू / μL)
      • 1 μL डीएनए पोलीमरेज़ मैं (10 यू / μL)
      • 0.25 μL RNase एच (2 यू μL /)
      Pipetting द्वारा अच्छी तरह मिक्स और संक्षेप में स्पिन. 16 पर 2 घंटे के लिए सेते ° सी.
    2. 1 μL टी -4 डीएनए पोलीमरेज़ (5 यू μL /): जोड़ें. Pipetting और स्पिन संक्षिप्त द्वारा मिक्स. 16 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट सेते
    3. 500 μL धोने के बजाय 750 μL के साथ 1 समय बफर के साथ 11 धो: 2 बार साफ मामूली संशोधनों के साथ निर्माता के निर्देशों के अनुसार Qiagen MinElute किट का उपयोग कर प्रतिक्रिया . Nuclease मुफ्त पानी में Elute.
    4. 2-4 μL या इथेनॉल तेज़ी से Speedvac का उपयोग करने के लिए ध्यान लगाओ. इथेनॉल वर्षा के लिए, ग्लाइकोजन एक न्यूक्लिक एसिड वाहक के रूप में कार्य करता है और प्रयोग किया जाता है जब डीएनए या शाही सेना की छोटी मात्रा में precipitating है. सोडियम एसीटेट से सोडियम डीएनए रीढ़ की हड्डी के नकारात्मक प्रभारी बेअसर में मदद करता है, वर्षा में सहायता. यह दिनचर्या precipitations के लिए एक मास्टर मिश्रण बनाने के लिए आवश्यक नहीं है.
      • 29 μL DEPC पानी जोड़ें
      • 2 μL ग्लाइकोजन (5mg/mL)
      • 1 / 10 (3 μL) की मात्रा 3M सोडियम एसीटेट
      • 2.5 संस्करणों (~ 250 μL) ठंड 100% इथेनॉल
      अच्छी तरह मिक्स. -80 पर वेग ° C (30 हे / N न्यूनतम).
    5. 4 में 20 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस
    6. निकालें सतह पर तैरनेवाला और 800 μL 70% इथेनॉल के साथ गोली धोने. करने के लिए पूरी तरह से गोली या तो pipetting या अतिरिक्त नमक को हटाने में सहायता vortexing द्वारा बेदखल करने के लिए सुनिश्चित करें.
    7. 4 पर एक और 20 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस निकालें सतह पर तैरनेवाला और 15-20 मिनट के लिए शुष्क हवा.
    8. Nuclease मुफ्त पानी के 4 μL में Resuspend. -20 या -80 पर स्टोर डिग्री सेल्सियस या अगले चरण पर जारी है.
  3. इन विट्रो प्रतिलेखन में एक दौर (IVT):
    डबल असहाय सीडीएनए में शामिल T7 प्रमोटर से antisense शाही सेना synthesize.
    1. यह प्रतिक्रिया एक 20 μL प्रतिक्रिया के बजाय एक 10 μL के लिए बढ़ाया छोड़कर निर्माता के निर्देशों के अनुसार Ambion MEGAscript T7 किट का उपयोग किया जाता है 12. यह कमरे के तापमान पर इस प्रतिक्रिया को इकट्ठा करने के लिए जरूरी है और कमरे के तापमान पर विधानसभा के दौरान बफर रखने. आपूर्ति बफर डीएनए वेग अगर यह बर्फ का ठंडा है. जब उपयोग में नहीं बर्फ पर NTPs और एंजाइम मिश्रण रखें.
      • कमरे के तापमान पर
      • एक पतली दीवारों पीसीआर ट्यूब resuspended डबल असहाय सीडीएनए स्थानांतरण.
      • 4 μL एनटीपी मिश्रण (18.75 मिमी प्रत्येक) जोड़ें
      • 1 μL 10x प्रतिक्रिया बफर
      • 1 μL 10x एंजाइम मिश्रण
    2. 37 पर 14 घंटे सेते ° सी thermocycler में (बेहतर) या इनक्यूबेटर.
    3. यह प्रतिक्रिया साफ किया जा सकता है एक Speedvac या इथेनॉल वर्षण का उपयोग नमूना एकाग्रता के बाद दो अलग तरीकों का उपयोग कर. एक किट का उपयोग करने के लिए सफाई के लिए, विधि ए के लिए एक मानक phenol / क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण के साथ साफ करने के लिए आगे बढ़ना, विधि बी करने के लिए आगे बढ़ना
    4. एक विधि:
      1. 500 μL धोने के बजाय 750 μL के साथ 1 समय बफर के साथ 2 बार धो: साफ कुछ 13 संशोधनों के साथ निर्माता के निर्देशों के अनुसार AMBION Megaclear किट का उपयोग कर प्रतिक्रिया . Elution कदम के लिए, स्तंभ के बीच, 70 ° 10 मिनट के लिए सी में सेते nuclease मुफ्त पानी का 50 μL में जोड़ें. 1 मिनट के लिए 10,000 ग्राम में स्पिन. एक ताजा ट्यूब में दोहराएँ. Eluates कम्बाइन. 2-4 μL या इथेनॉल वर्षण द्वारा Speedvac का उपयोग करने के लिए नमूना ध्यान लगाओ.
      2. इथेनॉल वर्षा के लिए: अमोनियम एसीटेट इस मामले में सोडियम एसीटेट के स्थान पर प्रयोग किया जाता है क्योंकि यह न्यूक्लिक एसिड के साथ मुक्त nucleotides के सह वर्षा को रोकने में कुशल है. यह एनटीपी IVT प्रतिक्रिया है, जो बहाव प्रतिक्रियाओं को बाधित कर सकते हैं में प्रयोग किया जाता है की उच्च एकाग्रता की वजह से महत्वपूर्ण है.
        • 50 μL DEPC पानी जोड़ें
        • 2 μL ग्लाइकोजन (20 मिलीग्राम / एमएल)
        • 0.6 (37.2 μL) संस्करणों 5M अमोनियम एसीटेट
        • 2.5 संस्करणों (~ 180 μL) इथेनॉल ठंड
      3. -80 पर वेग ° C (30 हे / एन मिनट.) .*
      4. 4 में 20 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस
      5. निकालें सतह पर तैरनेवाला और 800 μL 70% इथेनॉल (nuclease मुफ्त पानी में) के साथ गोली धोने. के लिए पूरी तरह से गोली बेदखल करने के लिए अतिरिक्त नमक के सभी हटा यकीन है.
      6. 4 पर एक और 20 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस
      7. सतह पर तैरनेवाला और शुष्क हवा 15-20 मिनट निकालें.
      8. 4 μL nuclease मुफ्त पानी में Resuspend गोली.
    5. विधि बी:
      1. वैकल्पिक रूप से, ARNA एक मानक phenol / क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण के साथ साफ कर सकते हैं.
        • 50 μL DEPC पानी जोड़ें
        • 2 μL ग्लाइकोजन (20 मिलीग्राम / एमएल)
        • 0.6 संस्करणों (37.2 μL)5M अमोनियम एसीटेट
        • 1 मात्रा (98 μL) फिनोल: क्लोरोफॉर्म: isoamyl 25:24:1 शराब (पीएच 7.8-8.0 equilibrated)
      2. 15 सेकंड के लिए भंवर. 1.5 मिनट के लिए एक तालिका के शीर्ष microcentrifuge में आधा अधिक से अधिक गति से अपकेंद्रित्र. एक नए ठंडे इथेनॉल 2.5 मात्रा (245 μL) से युक्त ट्यूब शीर्ष जलीय परत स्थानांतरण.
      3. -80 पर वेग ° C (30 हे / N न्यूनतम).
      4. 4 में 20 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस
      5. 800 μL 70% इथेनॉल (nuclease मुफ्त पानी में) के साथ सतह पर तैरनेवाला धोने और गोली निकालें. के लिए पूरी तरह से गोली बेदखल करने के लिए अतिरिक्त नमक के सभी हटा यकीन है.
      6. 4 पर एक और 20 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस
      7. सतह पर तैरनेवाला और शुष्क हवा 15-20 मिनट निकालें.
      8. 4 μL nuclease मुफ्त पानी में Resuspend गोली.

        * नमूना इस तापमान पर रातोंरात incubations के दौरान स्थिर हो सकता है. यह दिखाया गया है कि यह वास्तव में nucleic एसिड की उपज में वृद्धि कर सकते हैं.
  4. दौर 2 पहले कतरा सीडीएनए संश्लेषण
      • बर्फ पर
      • 1 μL रैंडम प्राइमरों (0.05 मिलीग्राम / एमएल) * जोड़ें
    2. 70 में हीट ° सी 10 मिनट के लिए. तुरंत कम से कम 5 मिनट के लिए बर्फ पर जगह है.
      • 2 μL 5x पहले कतरा बफर जोड़ें
      • 1 μL डीटीटी (100 मिमी)
      • 0.5 μL dNTP (2.5 मिमी प्रत्येक)
      • 0.5 μL RNasin (40 यू / μL)
      • 1 μL सुपरस्क्रिप्ट III (200 यू μL /)
    4. Pipetting द्वारा अच्छी तरह मिक्स और संक्षेप में स्पिन. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बैठते हैं अनुमति दें. यह कदम पहले रिवर्स प्रतिलेखन प्रतिक्रिया किया जाता है कम यादृच्छिक प्राइमरों के विस्तार की अनुमति की आवश्यकता है.
    5. 42 पर 30 मिनट के लिए सेते डिग्री सेल्सियस
    6. हीट 95 पर 5 मिनट डिग्री सेल्सियस शाही सेना डीएनए / आरएनए संकर में denature. कम से कम 5 मिनट के लिए बर्फ पर रखें. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर या -80 डिग्री सेल्सियस या तुरंत अगले कदम पर जारी है.

      * यादृच्छिक प्राइमरों की एकाग्रता महत्वपूर्ण है. अगर एकाग्रता बहुत अधिक है, उत्पाद प्रवर्धन के प्रत्येक दौर के साथ और अधिक छोटा हो जाएगा.
  5. दौर 2 दूसरा कतरा सीडीएनए संश्लेषण
      • बर्फ पर
      • 2 μL T7 oligo (dT) (10 एनजी / μL) प्राइमर * जोड़ें
    2. 70 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए हीट तुरंत कम से कम 5 मिनट के लिए बर्फ पर जगह है. संक्षेप में स्पिन.
      • 43.5 μL nuclease मुफ्त पानी जोड़ें
      • 15 μL 5x दूसरा कतरा बफर
      • 1.5 μL dNTP मिश्रण (2.5 मिमी प्रत्येक)
      • 2 μL डीएनए पोलीमरेज़ मैं (10 यू / μL)
    4. Pipetting द्वारा अच्छी तरह मिक्स और संक्षेप में स्पिन. 16 पर 2 घंटे के लिए सेते ° सी.
    5. 2 μL टी -4 डीएनए पोलीमरेज़ (5 यू / μL) जोड़ें
    6. Pipetting द्वारा अच्छी तरह मिक्स और संक्षेप में स्पिन. 16 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट सेते
    7. प्रतिक्रिया धारा 6.2.3 में के रूप में Qiagen Minelute किट का उपयोग कर साफ़ करें.
    8. Speedvac या 6.2.8 के लिए 6.2.4 धारा में के रूप में इथेनॉल वर्षण के साथ 2-4 μL ध्यान लगाओ.

      * नोट T7 - ​​oligo के विभिन्न शेयर एकाग्रता (डीटी) पहले दौर दूसरा कतरा सीडीएनए संश्लेषण की तुलना में प्राइमर.
  6. इन विट्रो प्रतिलेखन में 2 दौर
    6.3 धारा में के रूप में प्रदर्शन.
    1. धारा 6,4 करने के लिए 6.6 समय की वांछित संख्या दोहराएँ. ध्यान दें कि कम ARNA उत्पादों में प्रवर्धन परिणामों के प्रत्येक बाद के दौर. प्रवर्धन के दौर की संख्या इस कारण के लिए सीमित होना चाहिए. आम तौर पर, प्रवर्धन के दो से तीन दौर के माइक्रोएरे विश्लेषण करने के लिए एक एकल कोशिका से काटा सामग्री बढ़ाना के लिए पर्याप्त हैं. माइक्रोएरे विश्लेषण के मामले में, तीसरे दौर IVT प्रतिक्रिया निर्माता के निर्देशों के अनुसार Illumina TotalPrep आरएनए प्रवर्धन किट का उपयोग किया जाता है. इस प्रक्रिया ARNA है कि तब एक माइक्रोएरे चिप पर पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है में बायोटिन - लेबल UTP शामिल हैं.
    2. तीसरे दौर ARNA नैनो शाही सेना किट के साथ एक Nanodrop या Agilent Bioanalyzer उपयोग कर की एकाग्रता उपाय.

7. प्रतिनिधि परिणाम

प्राथमिक neuronal संस्कृतियों से एक एकल कोशिका के सफल फसल कम से कम 2 मिनट में पूरा किया जा सकता है, योग्यता के आधार पर (चित्रा 1 देखें). हालांकि, फसल के लिए समय प्रणालियों के बीच और प्रयोगात्मक हेरफेर के बीच के साथ अलग अलग होंगे. ARNA प्रक्रिया एकल कक्ष subjecting (4A और 4B आंकड़े देखें) कुल प्रवर्धित ARNA के माइक्रोग्राम मात्रा में परिणाम और एक विशेषता व्यापक चोटी का उत्पादन जब एक bioanalyzer (चित्रा 3 देखें) के साथ विश्लेषण. तीन दौर तीन दिनों की एक न्यूनतम में पूरा किया जा सकता है, एकल कोशिका जीन अभिव्यक्ति के त्वरित विश्लेषण के लिए अनुमति देता है.

चित्रा 1
चित्रा 1 दिखाया गया है. एक अलग न्यूरॉन के एक सफल फसल का एक उदाहरण है. हम seleएक अपेक्षाकृत कम घनत्व क्षेत्र (ए) cted और इच्छित कक्ष (बी) की ओर विंदुक टिप उन्नत. तीसरे छवि (सी) से पता चलता है कि सेल के बाद देखने के क्षेत्र से काटा गया था. ध्यान दें कि आसपास प्रक्रियाओं coverslip पर रहते.

चित्रा 2
चित्रा 2 दिखाया गया है. विंदुक युक्तियाँ के दो छवियों, जो प्रभावी एकत्रित करने के लिए एक अनुचित आकार के होते हैं. अधूरा (ए) फसल और परिवेश (बी) क्रमशः आसपास की फसल के लिए इन युक्तियों का नेतृत्व करेंगे.

चित्रा 3
चित्रा 3 के बाद फसल और प्रवर्धन, विश्लेषण, एक bioanalyzer का उपयोग करने के लिए प्रवर्धित आरएनए का वितरण मात्रा की जांच की सिफारिश की है. एकल कक्ष की सामग्री से एक सफल प्रवर्धन कम micrograms में कुल मात्रा में उपज और एक वितरण है कि चिकनी और व्यापक है होगा.

चित्रा 4
4 आंकड़े. पहली दौर (ए) और (बी) ARNA प्रक्रिया के दूसरे दौर के Schematics दिखाए जाते हैं.

Discussion

नोट्स और समस्या निवारण

  • आप पहले और बाद में छवियों को दिखा रहा है कि लक्ष्य कक्ष को पृथक किया गया और शेष penumbra छोड़ दिया गया था अछूता रखना चाहते हो सकता है.
  • यदि बहुत ज्यादा समाधान विंदुक के रूप में आप कटाई कर रहे हैं प्रवेश कर रही है, तो आप 3 Luer - लॉक फिटिंग तरीका है और सिरिंज के लिए सवार टयूबिंग में सकारात्मक दबाव पकड़ का उपयोग कर सकते हैं. वांछित मात्रा प्रसंस्करण के प्रकार के साथ अलग अलग है लेकिन के लिए 5 μl सबसे अनुप्रयोगों के लिए ठीक होना चाहिए.

आणविक जैविक तकनीक पर जनरल युक्तियाँ

  • सभी शेयर ट्यूबों भंवर और एक प्रतिक्रिया को जोड़ने से पहले उन्हें नीचे स्पिन. एंजाइमों कभी भंवर.
  • एंजाइम करने के लिए सुनिश्चित करें कि बफर उचित एकाग्रता में है जोड़ने से पहले अच्छी तरह से प्रतिक्रियाओं का मिश्रण.
  • -20 डिग्री सेल्सियस पर यदि संभव हो तो एक stratacooler का उपयोग करके एंजाइम स्टॉक रखें. अन्यथा, का उपयोग करने से पहले सही निकालने के लिए, बर्फ पर रखने के लिए, और -20 डिग्री सेल्सियस को तुरंत वापस
  • हमेशा बनाने के लिए मास्टर घोला जा सकता है जब एक से अधिक प्रतिक्रिया pipetting त्रुटियों को कम करने की तैयारी. नमूनों की संख्या के आधार पर अपेक्षित मात्रा की गणना और 10-20% जोड़ें.
  • स्टोर आरएनए -80 डिग्री सेल्सियस मंदबुद्धि गिरावट. शाही सेना सबसे अधिक स्थिर है शाही सेना के मंदबुद्धि apurination कि अम्लीय परिस्थितियों में होता है के लिए बफर में संग्रहीत.

ARNA प्रक्रिया जनरल बाह्यरेखा

चित्रा 4A ARNA प्रक्रिया के पहले दौर को दिखाता है. पहली भूग्रस्त प्रतिक्रिया में, पाली टी T7 - ​​oligo प्राइमर (डीटी) के हिस्से Pólya पूंछ के लिए बाध्य mRNA प्रजातियों (लंबे सफेद आयत) का चयन करता है. कुछ microRNAs भी polyadenylated हैं और इस प्रक्रिया के द्वारा कब्जा कर लिया जाएगा. इससे भी महत्वपूर्ण बात, तथापि, सेल में सबसे प्रचुर मात्रा में RNAs, ribosomal RNAs, नहीं होगा. इस oligo रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस के लिए एक किताब के रूप में कार्य करता सीडीएनए के एक पूरक भूग्रस्त (लंबी धूसर आयत) synthesize एक टेम्पलेट के रूप में mRNA का उपयोग. T7 - oligo प्राइमर (डीटी) के T7 भाग T7 शाही सेना पोलीमरेज़ प्रमोटर अनुक्रम शुरू mRNA करने के लिए antisense के साथ फ्रेम में शामिल हैं. यह बाद में इन विट्रो प्रतिलेखन प्रतिक्रिया में प्रयोग किया जाता है.

अगले, पिछले चरण में बनाया संकर / mRNA डीएनए में mRNA RNase एच बनाने आरएनए "प्राइमरों" (छोटे सफेद आयत) Okazaki ठंड कतरा डीएनए संश्लेषण में बनाया टुकड़े करने के लिए इसी तरह के द्वारा आंशिक रूप से hydrolyzed है. डीएनए पोलीमरेज़ मैं प्रधानमंत्री डीएनए संश्लेषण का उपयोग एक टेम्पलेट के रूप में mRNA करने के लिए पूरक डीएनए शाही सेना के टुकड़े का उपयोग करता है. जब यह 3 से 'अगले आरएनए टुकड़ा, अपने 5 तक पहुँचता है nuclease गतिविधि ribonucleotides निकालता है और उन्हें deoxyribonucleotides के साथ बदलता है. डीएनए ligase के लिए किसी भी किस्में जहां प्रमुख कतरा के प्रतिस्थापन पूरा नहीं हुआ है ligate जोड़ा जाता है. टी -4 डीएनए पोलीमरेज़ क्षेत्रों में भरने जोड़ा जाता है जहां शाही सेना के टुकड़े मैं बनाने के डीएनए पोलीमरेज़ के लिए प्रारंभिक प्राइमरों के रूप में सेवा की एक कुंद समाप्त डबल सीडीएनए फंसे कि फिर IVT प्रतिक्रिया प्रदर्शन से पहले शुद्ध होता है.

IVT प्रतिक्रिया में, T7 शाही सेना पोलीमरेज़ T7 प्रमोटर डबल सीडीएनए असहाय और synthesizes antisense शाही सेना के अणुओं (लंबे काले आयत) एक टेम्पलेट के रूप में भावना कतरा का उपयोग में शामिल करने के लिए बांधता है. यह प्रवर्धन कदम है जो में antisense शाही सेना अणु के हजारों प्रत्येक डबल असहाय सीडीएनए अणु (चित्रा -4 ए) से उत्पादित कर रहे हैं के रूप में कार्य करता है.

दूसरे दौर में, 4B चित्र में दर्शाया गया है, एक रिवर्स प्रतिलेखन प्रतिक्रिया है कि शाही सेना को शुरू करने के बाद पहले दौर के उस से थोड़ा अलग है के साथ शुरू होता है antisense (ठोस काले आयत) और polyadenylated पूंछ है कि T7 - ​​oligo द्वारा लक्षित किया गया था का अभाव पहले दौर में प्राइमर (डीटी). इसलिए, इस प्रतिक्रिया यादृच्छिक प्राइमरों (छोटे धूसर आयत) और बाद में विकृत शाही सेना के साथ primed है. दूसरी कतरा प्रतिक्रिया तो T7 - ​​oligo (डीटी) प्राइमर है, जो भावना पूर्ववर्ती रिवर्स प्रतिलेखन प्रतिक्रिया में बनाई गई शाही सेना के 3 'के अंत में पाली - एक अनुक्रम को बांधता द्वारा primed है. अन्य IVT प्रतिक्रिया के रूप में पहले दौर में एक ही तरीके से किया जाता है. इस दूसरे दौर में आम तौर पर कम से कम एक बार दोहराया है एक एकल कोशिका से प्रवर्धन के तीन दौर को प्राप्त करने.

अनुप्रयोगों

तकनीक है कि हम इस लेख में प्रस्तुत किया है आवेदनों की एक बड़ी संख्या में अनुवाद किया जा सकता है है. एकल कक्ष अलगाव प्रोटोकॉल तीव्र स्लाइस में उपयोग के लिए संशोधित किया जा सकता है, 14 तकनीकी और अधिक चुनौतीपूर्ण हालांकि, एक ही सिद्धांतों इस वैकल्पिक तैयारी में लागू. इसके अतिरिक्त, अगर विंदुक के आकार थोड़ा निकाला जाता है, कोशिकाओं के शरीर क्रिया विज्ञान की रिकॉर्डिंग फसल शारीरिक outputs के पीछे आणविक तंत्र की एक अच्छी तरह से नियंत्रित जांच के लिए अनुमति देने से पहले बनाया जा सकता है. एक मामूली संशोधन के लिए सेल सोम से प्रक्रियाओं अलग है इस आवेदन के लिए 15. एक विंदुक के साथ सेल निकायों इकट्ठा और फिर एक ताजा विंदुक के साथ वापस जाओ और 100-300 पहचान dendrit इकट्ठाes या संग्रह ट्यूब प्रति axons 16.

एक बार कोशिकाओं को काटा गया है, mRNA abundances और रचनाओं की तुलना के बीच अलग है और एक ही सेल आबादी के भीतर भी बनाया जा सकता है है. Biotinylated UTP शामिल से तीसरे दौर ARNA में माइक्रोएरे के लिए इन सापेक्ष mRNA abundances निर्धारित विश्लेषण के लिए अनुमति देता है. मूल mRNA जनसंख्या का रचना भी ARNA प्रक्रिया का उपयोग कर अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के बाद निर्धारित किया जा सकता है. प्रवर्धित ARNA भी सेल phenotype रूपांतरण अध्ययन में जो एक कोशिका प्रकार से mRNAs का एक पूरा सेट एक अलग सेल प्रकार में ट्रांसफ़ेक्ट हैं क्रम में पूर्व में उत्तरार्द्ध सेल प्रकार के phenotype के संक्रमण पैदा की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, एक प्रक्रिया प्रयोगशाला द्वारा विकसित और TIPeR के रूप में जाना जाता है 17 इन अध्ययनों रोग राज्यों और सेल phenotypes और इस तरह के अध्ययन के अध्ययन के लिए विशेष रूप से उपयोगी होते हैं वर्तमान में प्रयोगशाला में चल रहे हैं. RT-पीसीआर या qPCR प्रवर्धित सामग्री पर प्रदर्शन किया जा सकता है सेल विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति की पुष्टि है. इसके अतिरिक्त, अभिकर्मक या पारगमन की दक्षता का मूल्यांकन एकल कोशिका के स्तर पर किया जा सकता है.

फायदे और सीमाएं

के रूप में सार में कहा गया है, विश्लेषण के लिए एकल कक्षों के अलगाव औसत विषम सेल आबादी के विश्लेषण के साथ देखा प्रभाव eliminates. ये औसतन प्रभाव एक एकल कोशिका के भीतर प्रचुर मात्रा में टेप पर प्रतिनिधित्व और बाहर औसत है और बहुत कम बहुतायत टेप का पता लगाने के को रोकने से mRNA abundances मिथ्या अर्थ लेना. प्रवाह cytometry व्यक्ति की कोशिकाओं को सॉर्ट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन इस विधि सेल विशिष्ट मार्करों और महंगे उपकरण के ज्ञान की आवश्यकता है 18 लेजर कब्जा microdissection यूवी या IR लेजर कब्जा microdissection सिस्टम के साथ या तो एकल कक्ष और भी subcellular पर कब्जा के लिए अनुमति देते हैं, लेकिन ब्याज की करने के लिए कोशिकाओं की आवश्यकता है. बहुत पतली वर्गों की सतह पर स्थित 19. cytometry प्रवाह की तरह, लेजर कब्जा microdissection भी महंगे उपकरण की आवश्यकता है.

एक मूल्यवान electrophysiological डेटा फसल से पहले ब्याज की कक्ष से प्राप्त किया जा सकता है, कार्यात्मक और transcriptome विश्लेषण के लिए अनुमति देने के लिए एक ही सेल पर प्रदर्शन किया इलेक्ट्रोड आधारित संग्रह तकनीक ऊपर वर्णित के प्रमुख लाभों की है कि 20 हमारी तकनीक का एक नकारात्मक पक्ष यह है. कि यह micromanipulators का उपयोग अनुभव की आवश्यकता होती है. Micromanipulators साथ परिचित जांचकर्ता इस तकनीक बहुत सहज मिल जाएगा, तथापि, ऐसी कोई अनुभव के साथ व्यक्तियों को ठीक आवश्यक आंदोलनों के साथ सहज हो गया है की आवश्यकता होगी.

किसी भी प्रवर्धन तकनीक में निहित आकार और nucleotide संरचना के आधार पर कुछ टेप के तरजीही प्रवर्धन 4,6,7 पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) रिवर्स प्रतिलेखन पोलीमरेज़ चेन प्रतिक्रिया (RT-पीसीआर) और सीडीएनए की तेजी प्रवर्धन के रूप में आधारित तकनीक है. समाप्त होता है में (रेस) टेप के घातीय प्रवर्धन परिणाम है, जबकि रैखिक प्रवर्धन में ARNA प्रवर्धन प्रक्रिया के परिणाम. इस प्रकार, ARNA प्रक्रिया का प्रमुख लाभ में से एक अपने बेहतर केवल रैखिक किसी भी त्रुटि या biases कि प्रवर्धन प्रक्रिया में होते हैं, के रूप में तेजी से amplifying विरोध amplifying द्वारा mRNA टेप के रिश्तेदार abundances की रक्षा करने की क्षमता में निहित त्रुटियों और biases कहा.

ARNA माइक्रोएरे विश्लेषण के साथ मिलकर प्रक्रिया समान या अलग आकारिकी, इलाज या अनुपचारित के एकल कक्षों के बीच mRNA abundances की तुलना के लिए अनुमति देता है. इसके अतिरिक्त, प्रवर्धित सामग्री अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए प्रस्तुत किया जा सकता है 5,8 हालांकि, देखभाल के बाद से, प्रक्रिया के लिए यादृच्छिक प्राइमरों का उपयोग करने के लिए इसके विपरीत में, oligo-dt primed प्रक्रिया के biases प्रवर्धन ऊपर वर्णित इस तरह के विश्लेषण में लिया होना चाहिए. 3 'mRNA और प्रत्येक दौर के साथ बाद प्रवर्धित सामग्री का थोड़ा छोटा करने में आम तौर पर परिणाम के समाप्त हो जाती है. देखभाल मानक तरीकों के साथ माइक्रोएरे परिणाम का विश्लेषण के रूप में कुछ झूठी अनुपस्थित कॉल थोड़ा छोटा प्रवर्धित सामग्री से उत्पन्न कर सकते हैं में लिया जाना चाहिए. इसके अलावा, जबकि अनुक्रमण परिणाम वास्तव में पूर्ण 5 प्रदान करेगा मूल mRNA की सबसे अनुक्रम 5 'कुछ mRNA के दृश्यों को याद हो सकता है. इन कारणों के लिए, amplifications के दौर की संख्या सीमित होना चाहिए.

Disclosures

डा. Eberwine ARNA पेटेंट कि एलबीएस प्रौद्योगिकियों जिसमें डा. Eberwine एक शेयर धारक के लिए लाइसेंस दिया गया है पर एक आविष्कारक है.

Acknowledgments

आप चढ़ाना और सेल संस्कृतियों को बनाए रखने के लिए केविन Miyashiro करने के लिए, इस दस्तावेज़ में शामिल चित्रों के लिए सेल संस्कृतियों को उपलब्ध कराने के लिए डा. Terri Schochet के लिए धन्यवाद. इसके अलावा, केविन Miyashiro, डॉ. पीटर बकले, और Tiina Pertiz ARNA प्रक्रिया पर इनपुट के लिए शुक्रिया. इस काम के लिए अनुदान एजिंग पर राष्ट्रीय संस्थान, राष्ट्रीय मानसिक स्वास्थ्य और पेन्सिलवेनिया के राष्ट्रमंडल से मानव संसाधन तथ्य खोजक धन पर संस्थान से किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Spiegelgas coverslips Carolina Biological 63-3029
Nunc 35x10 mm culture dishes Fisher Scientific 12-565-90
Water for cell culture Lonza Inc. 17-724Q For making solutions used for cell culture and rinsing coverslips
Poly-D-Lysine MW70-150K Sigma-Aldrich 6407
Laminin, ultrapure BD Biosciences 354239
Boric acid Sigma-Aldrich B0252
MEM with Earle’s salts and glutamax Invitrogen 41090-101 For plating cells
D-glucose Sigma-Aldrich G8769
Penicillin-streptomycin Invitrogen 15140-122
Horse serum Invitrogen 16050
Cytosine beta-D-arabinofuranoside Sigma-Aldrich C1768
MEM with Earle’s salts and L-glutamine Invitrogen 11095-098 For growing cells
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P2256
B27 serum-free supplement Invitrogen 17504-044
Borosilicate glass capillary tubes (1.5mm O.D, 100mm length) Kimble Chase 34500 99 Any borosilicate glass pipette will work as long as the proper bore size is attained.
HBSS Invitrogen 14175 Any solution will work as long as the components won’t interfere with any future processing (i.e. no Ca2+ or Mg2+)
1ml syringe BD Biosciences 309628
Needle BD Biosciences Gauge depends on the diameter of the pipettes
dNTP mix Amersham 28-4065-51
dt-T7 oligo Custom Midland Certified
Second strand buffer (5x) Invitrogen Y01129
DTT Supplied with second strand buffer
E.coli DNA Ligase Invitrogen 100002324
DNA polymerase I Invitrogen 100004926
Rnase H Invitrogen 18021-071
Megascript T7 kit Ambion AM1334
Random primers BMB 11034731001
Superscript III Reverse Transcriptase Invitrogen 56575 in kit (18080-044) comes with first strand buffer (Y02321) and DTT
MEGAclear Kit Ambion 1908
MinElute Reaction Cleanup Kit Qiagen 28206
T4 DNA polymerase Invitrogen 100004994
Rnasin Promega Corp. N251B
Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit Ambion AMIL1791
Flaming/Brown micropipette puller Sutter Instrument Co. P-87 Sutter has many other models, many are discussed in the cookbook
Micromanipulator Olympus Corporation Many other micromanipulators will work such as the newer Eppendorf models
Pipette Holder Warner Instruments MP-S15A Will vary with micromanipulator and pipette O.D.
Bioanalyzer RNA 6000 Nano Kit Agilent Technologies 5067-1511

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References

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Tags

तंत्रिका विज्ञान 50 अंक एकल कक्ष transcriptome ARNA प्रवर्धन RT-पीसीआर आण्विक जीव विज्ञान जीन अभिव्यक्ति

Erratum

Formal Correction: Erratum: Transcriptome Analysis of Single Cells
Posted by JoVE Editors on 11/18/2011. Citeable Link.

A correction was made to Transcriptome Analysis of Single Cells. There were errors in the volumes used in the aRNA Amplification section. The volumes were changed from:

  • 6.2.1 7.5 μL 5x Second strand buffer
  • 6.2.4 Add 29 μL DEPC water
    2 μL glycogen (5 mg/mL) 1/10 volume (3 μL) 3M Sodium acetate
    2.5 volumes (~250 μL) cold 100% ethanol
  • 6.2.7 Remove the supernatant and air dry for 15-20 minutes.
  • 6.3.4.2 Add 50 μL DEPC water
    2 μL glycogen (20 mg/mL)
    0.6 volumes (37.2 μL) 5M Ammonium acetate
    2.5 volumes (~180 μL) cold ethanol
  • 6.3.4.7 Remove supernatant and airy dry 15-20 minutes.
  • 6.3.5.1 Add 50 μL DEPC water
    2 μL glycogen (20 mg/mL)
    0.6 volumes (37.2 μL) 5M Ammonium acetate
    1 volume (98 μL) phenol:chlorofom:isoamyl alcohol 25:24:1 (equilibrated to pH 7.8-8.0)
  • 6.3.5.7 Remove supernatant and air dry 15-20 minutes.

to

  • 6.2.1 5.6 μL 5x Second strand buffer
  • 6.2.4 Add 40 μL DEPC water
    1 μL glycogen (5 mg/mL) 1/10 volume (5 μL) 3M Sodium acetate
    2.5 volumes (~125 μL) cold 100% ethanol
  • 6.2.7 Remove the supernatant and air dry for 15-20 minutes.
  • 6.3.4.2 Add 50 μL DEPC water
    2 μL glycogen (5 mg/mL)
    0.1 volumes (10 μL) 5M Ammonium acetate
    2.5 volumes (~275 μL) cold ethanol
  • 6.3.4.7 Remove supernatant and air dry 15-20 minutes.
  • 6.3.5.1 Add 90 μL DEPC water
    2 μL glycogen (5 mg/mL)
    0.1 volumes (10 μL) 5M Ammonium acetate
    1 volume (100 μL) phenol:chlorofom:isoamyl alcohol 25:24:1 (equilibrated to pH 7.8-8.0)
  • 6.3.5.7 Remove supernatant and air dry 15-20 minutes.
एकल कक्ष की transcriptome विश्लेषण
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Morris, J., Singh, J. M., Eberwine,… More

Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H. Transcriptome Analysis of Single Cells. J. Vis. Exp. (50), e2634, doi:10.3791/2634 (2011).

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