Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Транскриптома Анализ отдельных клеток

Published: April 25, 2011 doi: 10.3791/2634
Automatic Translation
*1, *1, 1,2
1Department of Pharmacology, University of Pennsylvania, 2The Penn Genome Frontiers Institute, University of Pennsylvania
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

В этой статье мы расскажем простой метод уборки отдельных клеток от первичных нейронов крысы культур и последующего анализа транскриптома использованием Арна усиления. Этот подход обобщению любого типа клеток.

Abstract

Многие методы анализа экспрессии генов зависят от материала изолированы из гетерогенных популяций клеток из ткани или гомогената клеток в культуре. 1,2,3 В случае с мозгом, такие регионы, как гиппокамп содержат комплекс расположение различных типов клеток, каждый из которых различных профилей мРНК. Способность урожая отдельных клеток позволяет более глубоко расследование молекулярные различия между странами и внутри клеточных популяций. Мы опишем простой и быстрый метод для уборки клетки для дальнейшей обработки. Пипетки часто используется в электрофизиологии используются для изоляции (с помощью аспирации) ячейки интерес и удобно поместить его в пробирку Эппендорфа для дальнейшей обработки с любым количеством методов молекулярной биологии. Наш протокол может быть модифицирован для урожая дендритов из культуры клеток или даже отдельные клетки от острого ломтиками.

Мы также опишем метод Арна усиления в качестве основного вниз по течению применение единых выделения клеток. Этот метод был разработан ранее в нашей лаборатории в качестве альтернативы другим экспрессии генов методов анализа, таких как обратный транскрипции или в режиме реального времени полимеразной цепной реакции (ПЦР). 4,5,6,7,8 Эта технология обеспечивает линейное усиление полиаденилированной РНК, начиная с только femtograms материала и в результате количество микрограмм антисмысловой РНК. Линейно усиленный материал обеспечивает более точную оценку, чем ПЦР экспоненциальной амплификации относительное обилие компонентов транскриптома из изолированных клеток. Основная процедура состоит из двух туров усиления. Короче говоря, Т7 РНК-полимеразы промоутер сайт включен в двухцепочечной кДНК, созданные из мРНК транскриптов. На ночь в пробирке транскрипции (ИВТ) реакции Затем проводится в котором Т7 РНК-полимеразы производит много стенограмм антисмысловых из двухцепочечной кДНК. Второй тур повторяет этот процесс, но с некоторыми техническими различиями поскольку исходный материал антисмысловых РНК. Это стандартная повторить второй тур, в результате чего три раунда амплификации. Часто, третий раунд в пробирке реакция транскрипции осуществляется с использованием биотинилированного нуклеозидтрифосфаты так, что антисмысловой РНК производства может быть гибридизированных и обнаруженных на микрочипов. 7,8

Protocol

1. Культуре клеток

Наша лаборатория использует первичных нейронов гиппокампа крыс культур для экспериментов ниже. Ниже описаны изменения Banker протокол о том, как эти клеточные культуры создаются и поддерживаются. 9 Есть, конечно, исчерпывающее количество перестановок из этих методов культивирования клеток и любой общепризнанный метод с учетом конкретных потребностей конкретной лаборатории, которая обеспечивает последовательно здорового питания клеток была бы подходящей заменой.

  1. Пять автоклавного, круглый, 12 мм покровные размещены в 35 мм блюдо и покрыты 80 мкг / мл Poly-D-лизин (МВт 70-150,000) в боратном буфере O / N, промывают водой (степень клеточной культуре), то покрытием с 1 мкг / мл Ламинин в боратном буфере O / N затем промыть еще раз водой. Н. Г. средств массовой информации (MEM с солями Эрла и GlutaMAX с глюкозой (0,6% м / о), пенициллин (100 ЕД / мл), стрептомицин (100 мкг / мл), лошадиной сыворотки (10% об. / об)) добавляется и блюда хранятся в инкубаторе (5% CO 2 при 37 ° С). PDL150/laminin выступает в качестве субстрата для изолированных нейронов расти на как монослой. Покровные стекла могут быть покрыты до двух недель до обшивки.
  2. В день посева, первичные нейроны из эмбриональных 18 день крыса гиппокампе высевают в НГ СМИ, добавляя 1,5 мл 100 000 клеток / мл суспензии. От четырех до шести часов после покрытия, каждый 35 мм блюдо обрабатывается 0,75 мкл 5 мМ цитозин бета-D-арабинофуранозида (Ara-C) для предотвращения роста любого загрязнения глиальных клеток. Двадцать четыре часа спустя, покрытие СМИ меняется на MEM с солями Эрла и L-глютамин дополнить 0,6% м / о глюкозы, 1 мМ пирувата натрия, и B27. Клетки имеют право расти в течение по крайней мере за две недели до использования в каких-либо экспериментов, чтобы завершить разработку процессов.

2. Подготовка Пипетки

Обратите внимание на РНКаз: кожа, слюна, и даже дыхание являются основными источниками РНКазы, ферменты, которые разрушают РНК. Крайне важно, чтобы РНКазы без техники наблюдается с этого момента в протокол, так что образец не подвергнуться заражению РНКазы, а затем снижается. Это включает в себя всегда носить перчатки при работе с образцами и реагентами, никогда не говорите по образцам или реагентов, и используя новые ящики стерилизовать наконечники и труб. Часто, пипетки, которые создаются исключительно для работы РНК обеззаражены, протирая их с решением РНКазы лечения, такие как РНКазы AWAY (Molecular биопродуктов). Тем не менее, эти решения будут препятствовать любому течению ферментативных реакций так важно также, чтобы не допустить загрязнения ваши образцы с этими препаратами.

  1. Автоклав 1,5 мм Внешний диаметр (OD) Пипетки стекла.
  2. Использование съемника микропипетки, потяните пипетки до диаметра подходит для электрофизиологических записей, которые могут различаться в зависимости от съемника, нити, и пипеток. 10 диаметр отверстия не слишком важно, поскольку наконечник будет нарушено до ячейки коллекции.
  3. Тщательно хранить пипетки в пыли среде, где советы останутся без изменений (в идеале использовать микропипетки банку хранения).
  4. Чтобы сломать наконечник в управляемом режиме, удерживая kimwipe тугой между пальцами в одной руке и очень мягко кисти кончик пипетки по бумаге от 1 до 2 раз. Открытие должно быть примерно 75-100% от размера клетки-мишени. Отрегулируйте этот шаг, пока не достигнете желаемого результата.

3. Подготовка культуры, трубы и микроскопа

  1. Подготовка необходимое количество 1,7 мл труб Эппендорф. Добавьте 2 мкл PBS, первый буфер нить, если материал будет использоваться для одного амплификации ячейку, или любое другое решение для хранения растительного материала.
  2. Для уборки, вам необходимо световой микроскоп с 40х цель оснащен микроманипулятора. Используйте пипетку держателя с гибкой трубкой ведущей от держателя. Прикрепите трубку к устойчивой поверхности, чтобы предотвратить нежелательное движение пипеткой во время сбора. В конце трубки, вставьте иглу так, чтобы 1 мл шприц Луер-Лок связи может быть присоединена и изменен в между пользователями.
  3. При использовании покровных, работать с одним покровным за один раз. При необходимости передачи одного покровное к новым 35 мм блюдо *, содержащий PBS или средств по выбору. Чем дольше клетки из инкубатора, более нездоровыми, они станут и тем более их профилях мРНК будет отклоняться от этой здоровой клетки. Очень важно сохранить здоровье клеток на другие покровные, держа их в инкубатор, когда они не работают с ними. Работа как можно быстрее с клетками вне инкубатора.

* В нашей установке необходимо использовать крышку 35 мм блюдо с стены фактической блюдо слишком высоки, чтобы обеспечить должное продвижение микропипетки к coversliстр.

4. Сбор Клетки

  1. Безопасные микропипетки в держателе микропипетки. Прикрепите держатель для микропипетки вставки на микроманипуляторами. Установить 40x цели.
  2. Место блюдо на столик микроскопа и найти область клетки подходят для сбора урожая. В случае первичных нейронов культур, клетка должна быть относительно изолированным от своих соседей, чтобы предотвратить урожай окружающих клеток и / или процессов. Население мРНК стенограммы между сомой и процессы меняются, поэтому, если заинтересованы в соматических мРНК исключительно, следует проявлять осторожность, чтобы предотвратить загрязнение сома с процессами. Место ячейке, которую вы хотите собрать в центре поля зрения.
  3. Использование микроманипулятора для продвижения микропипетки на решение в блюдо на свет путем. Нижняя пипетки в раствор. Применение положительного давления с этого момента, взрывая слегка через шприц. Посмотрите в окуляр. Пипетки должны появиться, как тень в поле зрения. Ну выше плоскости клетки, отрегулируйте положение кончика пипетки, пока он находится в поле зрения и сосредоточиться на кончике пипетки использованием грубой фокусировки ручки. На данный момент, она должна быть оценена, если размер отверстия пипетки слишком большой или слишком маленькой. Практика уборки предоставит возможность определить, является ли правильным диаметр отверстия был достигнут в этой точке.
  4. Теперь, заранее пипетки к плоскости клетки. Важно, чтобы наконечник не продвинулись слишком поспешно, заставляя его перерыв в регионе, из которого вы хотите собирать. Чтобы избежать этого, используйте грубый фокус на заранее фокальной плоскости, прежде чем перейти к пипетки клеток с использованием микроманипуляторами. Когда вы находитесь рядом с клетками, использования точной фокусировки, пока обе клетки и кончиком пипетки находятся в фокусе. Стоп применения положительного давления, прежде чем достичь плоскости клетки, чтобы предотвратить дует их прочь покровное.
  5. Используйте микроманипуляторами в положение кончика пипетки, чтобы он трогательно ячейки сомы вы хотите урожая.
  6. Использование шприцев, применять нежные всасывания в рот, пока клетка вступает пипетки. Если ячейка не входящих пипетки, осторожно переместите наконечник ближе к клетке и вниз, пока он поднимает с покровным.

5. Сохранение сотовый

  1. Использование микроманипулятора немедленно двигаться пипетки и из раствора.
  2. Удалите пипетки из держателя.
  3. Держите 1,7 мл Eppendorf трубка в одной руке и нежно перерыв кончика пипетки на стороне трубки ко дну. (Стремитесь к 0,1 мл знак.)
  4. С сломанный наконечник центру внутри трубки, вставьте иглу в шприц 1-3 мл в верхнее отверстие пипетки. Быстро нажмите поршень заставляя раствора в пипетку, чтобы распылить из в трубку. Ячейки должны оставаться в самый кончик пипетки, и это должно быть достаточно для правильной изгнать клетки. Будьте осторожны и не прикасайтесь кончиком любой жидкости по бокам трубки, как капиллярного действия принесут жидкости обратно в пипетку.
  5. Быстро спином вниз содержимое пробирки с помощью настольного микроцентрифужную и немедленно заморозить (хранить при -80 ° C) или места на льду для дальнейшей обработки (предпочтительно).

6. Арна Усиление

  1. Раунд 1 Первую цепь кДНК синтеза:
    Создать мРНК / кДНК гибридов.
    1. За каждые 5 мкл одного тома коллекции клетки, добавить 1x из следующих действий для коллекции трубки (на льду). Реакция может быть расширен для увеличения объемов сбора (2x в течение 10 мкл коллекции и т.д.). Создание главной смеси путем умножения следующие реагенты по количеству коллекции трубы плюс 10-20% к ответственности за пипетирования ошибки. Сделайте это для каждой последующей реакции в порядке, ampification Арна.
      • НА ЛЬДУ
      • 1,2 мкл дНТФ в (2,5 мм каждая)
      • 2,4 мкл 5x первых буфера прядь
      • 0,3 мкл T7-олиго (дТ) грунтовка (100 нг / мкл)
      • 1,2 мкл DTT (100 мм)
    2. Довести объем до 10,25 мкл водой нуклеазы бесплатно. Внесите смешивать и спина кратко использованием отцентрифугировать.
    3. Инкубировать в течение 5 минут при 70 ° С для денатурации любой вторичной структуры мРНК. Сразу же место на льду в течение не менее 5 минут.
    4. Добавить (еще раз, используя мастер микс):
      • 0,3 мкл RNasin (40 ед / мкл)
      • 0,45 мкл Надстрочный III (200 ед / мкл)
      • 1 мкл нуклеазы свободной воды
    5. Внесите смешивать и спина кратко. Инкубировать 1 час при 42 ° C.
    6. Инкубировать при 70 ° С в течение 15 минут для инактивации Надстрочный. Продолжите к следующему шагу.
  2. 1 тур Второй цепи кДНК синтеза
    Создать РНК праймеров от мРНК часть мРНК / ДНК гибридные, чтобы помочь в синтезе ое двухцепочечной кДНК.
      • НА ЛЬДУ
      • Для 12 мкл первая реакция пряди, добавьте:
      • 8 мкл нуклеазы свободной воды
      • 7,5 мкл 5x вторых буфера прядь
      • 0,75 мкл смеси дНТФ (2,5 мм каждая)
      • 0,25 мкл ДНК-лигазы (10 ед / мкл)
      • 1 мкл ДНК-полимеразы I (10 ед / мкл)
      • 0,25 мкл РНКазы H (2 ед / мкл)
      Тщательно перемешать с помощью пипетки и спин кратко. Инкубируйте в течение 2 часов при 16 ° C.
    2. Добавить: 1 мкл T4 ДНК-полимеразы (5 ед / мкл). Смешать с помощью пипетки и спин кратко. Инкубировать 10 минут при 16 ° C.
    3. Очистка реакции с помощью Qiagen MinElute комплект в соответствии с инструкциями изготовителя с небольшими изменениями: 11 мыть 2 раза по 500 мкл промывочного буфера, а не 1 раз в 750 мкл. Элюируются в нуклеазы свободной воды.
    4. Концентрат до 2-4 мкл использованием Speedvac или осаждением этанолом. Для осаждения этанолом, гликогена действует как нуклеиновые кислоты и носителя используется при осаждении небольшого количества ДНК или РНК. Натрия из ацетата натрия помогает нейтрализовать отрицательный заряд ДНК позвоночника, помогая в осадках. Это не обязательно, чтобы мастер микс для рутинной осадков.
      • Добавить 29 мкл DEPC воды
      • 2 мкл гликогена (5mg/mL)
      • 1 / 10 объема (3 мкл) 3М ацетата натрия
      • 2,5 объема (~ 250 мкл) холодного 100% этанола
      Хорошо перемешайте. Осадка при температуре -80 ° С (30 мин. Для O / N).
    5. Центрифуга в течение 20 минут при 4 ° C.
    6. Удалить супернатант и мыть гранул с 800 мкл 70% этанола. Будьте уверены, чтобы полностью вытеснить гранул либо с помощью пипетки или вортексе, чтобы помочь в удалении избытка соли.
    7. Центрифуга в течение еще 20 минут при 4 ° C. Удалить супернатант и сухой воздух в течение 15-20 минут.
    8. Ресуспендируют в 4 мкл воды нуклеазы бесплатно. Хранить при -20 или -80 ° С или переходить к следующему шагу.
  3. Раунд 1 в пробирке транскрипции (ИВТ):
    Обобщить антисмысловых РНК из промоутер T7 включены в двухцепочечной кДНК.
    1. Эта реакция осуществляется с использованием Амбион MEGAscript T7 комплект в соответствии с инструкциями изготовителя, кроме приведенной к 10 мкл вместо 20 мкл реакции 12. Крайне важно, чтобы собрать эту реакцию при комнатной температуре и сохранить буфер при комнатной температуре в процессе сборки. Поставляется буфер осадок ДНК, если она ледяным холодом. Держите НПТ и фермент смесь на лед, когда он не используется.
      • AT ТЕМПЕРАТУРЫ
      • Передача ресуспендировали двухцепочечной кДНК тонкостенные трубки ПЦР.
      • Добавьте 4 мкл смеси NTP (18,75 мм каждая)
      • 1 мкл 10х буфера реакции
      • 1 мкл 10x смесь ферментов
    2. Инкубируйте 14 часов при температуре 37 ° С в амплификаторе (предпочтительно) или инкубатора.
    3. Эта реакция может быть очищен с помощью двух различных методов последующей концентрации образца с помощью Speedvac или этанол осадков. Для очистки с помощью набора, перейдите к способу А. Для очистки со стандартным фенол / хлороформ добычи, перейдите к способу Б.
    4. Метод:
      1. Очистка реакции с помощью Ambion Megaclear комплект в соответствии с инструкциями изготовителя с некоторыми изменениями 13: Вымойте 2 раза по 500 мкл промывочного буфера, а не 1 раз в 750 мкл. Для элюирования шаг, добавить 50 мкл нуклеазы свободной воды к центру колонны, инкубировать при температуре 70 ° С в течение 10 минут. Спиновые в 10000 г на 1 мин. Повторите в новую пробирку. Комбинат элюатов. Концентрат образца до 2-4 мкл использованием Speedvac ИЛИ осаждением этанолом.
      2. Для осаждения этанолом: аммония ацетат используется вместо ацетата натрия в этом случае, поскольку он является эффективным для предотвращения соосаждения свободных нуклеотидов с нуклеиновой кислотой. Это важно из-за высокой концентрации NTP используется в реакции IVT, которая может препятствовать течению реакции.
        • Добавить 50 мкл DEPC воды
        • 2 мкл гликогена (20 мг / мл)
        • 0,6 объемах (37,2 мкл) 5М ацетата аммония
        • 2,5 объема (~ 180 мкл) холодного этанола
      3. Осадка при температуре -80 ° С (30 мин. Для O / N) .*
      4. Центрифуга в течение 20 минут при 4 ° C.
      5. Удалить супернатант и мыть гранул с 800 мкл 70% этанола (в воде нуклеазы бесплатно). Будьте уверены, чтобы полностью вытеснить шарик, чтобы удалить всю лишнюю соль.
      6. Центрифуга в течение еще 20 минут при 4 ° C.
      7. Удалить супернатант и сухой воздух 15-20 минут.
      8. Ресуспендируют окатышей в 4 мкл нуклеазы свободной воды.
    5. Метод В:
      1. Кроме того, Арна могут быть очищены со стандартным фенол / хлороформ добычи.
        • Добавить 50 мкл DEPC воды
        • 2 мкл гликогена (20 мг / мл)
        • 0,6 объемах (37,2 мкл)5М ацетата аммония
        • 1 объем (98 мкл) фенол: хлороформ: изоамиловый спирт 25:24:1 (доведены до рН 7.8-8.0)
      2. Vortex на 15 секунд. Центрифуга для 1,5 минут на половине максимальной скорости в микроцентрифужных столешницей. Передача верхнего водного слоя в новую пробирку, содержащую 2,5 объемах (245 мкл) холодного этанола.
      3. Осадка при температуре -80 ° С (30 мин. Для O / N).
      4. Центрифуга в течение 20 минут при 4 ° C.
      5. Удалить супернатант и мыть гранул с 800 мкл 70% этанола (в воде нуклеазы бесплатно). Будьте уверены, чтобы полностью вытеснить шарик, чтобы удалить всю лишнюю соль.
      6. Центрифуга в течение еще 20 минут при 4 ° C.
      7. Удалить супернатант и сухой воздух 15-20 минут.
      8. Ресуспендируют окатышей в 4 мкл нуклеазы свободной воды.

        * Пример может замерзнуть при этой температуре в течение ночи инкубации. Было показано, что это может реально увеличить выход нуклеиновых кислот.
  4. Раунд 2 Первую цепь кДНК синтеза
      • НА ЛЬДУ
      • Добавить 1 мкл случайных праймеров (0,05 мг / мл) *
    2. Тепло при 70 ° С в течение 10 минут. Сразу же место на льду в течение не менее 5 минут.
      • Добавьте 2 мкл 5x первых буфера прядь
      • 1 мкл DTT (100 мм)
      • 0,5 мкл дНТФ в (2,5 мм каждая)
      • 0,5 мкл RNasin (40 ед / мкл)
      • 1 мкл Надстрочный III (200 ед / мкл)
    4. Тщательно перемешать с помощью пипетки и спин кратко. Разрешить сидеть при комнатной температуре в течение 10 минут. Этот шаг необходим, чтобы расширение коротких случайных праймеров перед обратной реакции транскрипции не выполняется.
    5. Инкубировать 30 минут при 42 ° C.
    6. Тепло 5 минут при 95 ° С для денатурации РНК в ДНК / РНК гибридов. Место на льду в течение не менее 5 минут. Хранить при -20 ° С или -80 ° С или сразу переходите к следующему шагу.

      * Концентрация случайными праймерами имеет важное значение. Если концентрация слишком высока, продукт будет более усеченный с каждым раундом усиления.
  5. Раунд 2 Вторая цепь кДНК синтеза
      • НА ЛЬДУ
      • Добавьте 2 мкл T7-олиго (дТ) грунтовка (10 нг / мкл) *
    2. Тепло в течение 5 минут при температуре 70 ° C. Сразу же место на льду в течение не менее 5 минут. Спиновые кратко.
      • Добавить 43,5 мкл воды без нуклеаз
      • 15 мкл 5x вторых буфера прядь
      • 1,5 мкл смеси дНТФ (2,5 мм каждая)
      • 2 мкл ДНК-полимеразы I (10 ед / мкл)
    4. Тщательно перемешать с помощью пипетки и спин кратко. Инкубируйте в течение 2 часов при 16 ° C.
    5. Добавьте 2 мкл T4 ДНК-полимеразы (5 ед / мкл)
    6. Тщательно перемешать с помощью пипетки и спин кратко. Инкубировать 10 минут при 16 ° C.
    7. Очистка реакции с помощью Qiagen Minelute комплект, как в п. 6.2.3.
    8. Концентрат до 2-4 мкл с Speedvac или этанол осадков, в разделах 6.2.4 до 6.2.8.

      * Примечание различной концентрацией запасов T7-олиго (дТ) Грунтовка по сравнению с первого тура второй цепи кДНК синтеза.
  6. Раунд 2 В транскрипции пробирке
    Выполните как в разделе 6.3.
    1. Повторите разделы 6,4 до 6,6 нужное количество раз. Обратите внимание, что каждый последующий раунд усиления результатов в более короткие продуктов Арна. Количество раундов усиления должны быть ограничены по этой причине. Как правило, от двух до трех раундов усиления достаточно, чтобы усилить материал собран из одной ячейки для выполнения микрочипов анализа. В случае анализа микрочипов, третий раунд реакции IVT выполняется с помощью Illumina TotalPrep РНК Усиление комплект в соответствии с инструкциями производителя. Эта процедура включает в себя меченных биотином UTP в Арна, который затем используется для обнаружения на микрочипов чип.
    2. Измерить концентрацию третьих Арна круглый использованием Nanodrop или Agilent Bioanalyzer с Nano РНК комплект.

7. Представитель Результаты

Успешный урожай одной клетки из первичного нейрональных культурах может быть завершена менее чем за 2 минуты, в зависимости от способностей (см. Рисунок 1). Тем не менее, время для сбора будет варьироваться между системами и с промежуточными экспериментальных манипуляций. Подвергая одной ячейки в порядке, Арна (см. рис 4А и 4В) приводит к мкг количество от общего числа усиливается Арна и издает характерный широкий пик, когда анализируется с bioanalyzer (см. Рисунок 3). Три раунда может быть завершена в не менее трех дней, что позволяет для быстрого анализа экспрессии генов одной клетке.

Рисунок 1
Рисунок 1. Показан пример успешного урожай изолированного нейрона. Мы СелеИДКТК относительно низкой плотности области () и передовых пипетки на нужную ячейку (B). Третье изображение (С) показывает поле зрения после того, ячейки были собраны. Обратите внимание, что окружающие процессы остаются на покровное.

Рисунок 2
Рисунок 2. Показаны два изображения наконечники для пипеток, которые являются неуместными размер для эффективного сбора урожая. Эти советы помогут привести к неполному урожая () и урожай окружающей среды (B) соответственно.

Рисунок 3
Рисунок 3. После сбора урожая и усиление, анализ с использованием bioanalyzer рекомендуется изучить распределение и количество усиливается РНК. Успешное усиления от одного клеточного материала даст общую сумму в низком микрограмм и будет иметь распределение, гладкой и широкой.

Рисунок 4
На рисунках 4. Схемы первом раунде () и второй (Б) процедура Арна показаны.

Discussion

Замечания и устранение неисправностей

  • Вы можете взять до и после изображения, показывающие, что клетки-мишени был изолирован и что остальные полутени остался нетронутым.
  • Если слишком много решение вступает пипетки, как вы уборка урожая, вы можете использовать три способа Луер-Лок арматуры и поршень для шприца провести положительного давления в трубопроводе. Желаемую громкость будет меняться в зависимости от типа обработки, но до 5 мкл должно быть прекрасно для большинства приложений.

Общие советы по молекулярно-биологических методов

  • Vortex весь запас труб и спина их, прежде чем добавлять к реакции. НИКОГДА вихрь ферментов.
  • Тщательно перемешайте реакции перед добавлением ферментов, чтобы буфер при соответствующей концентрации.
  • Держите фермента запасов при температуре -20 ° С, если можно, используя stratacooler. В противном случае удалите перед использованием, держать на льду, и немедленно вернуться до -20 ° C.
  • Всегда убедитесь, мастер смешивает при подготовке более чем одной реакции на снижение пипетирования ошибок. Рассчитать объем, необходимый в зависимости от количества образцов и добавить 10-20%.
  • Магазин РНК при -80 ° С до деградации ретард. РНК является наиболее стабильным, хранящиеся в буфере для замедления apurination РНК, которая происходит в кислой среде.

Общая схема процедуры Арна

Рисунок 4а показывает первый раунд процедуры Арна. В первой реакции пряди, поли-Т часть T7-олиго (дТ) грунтовка выбирает для мРНК видов (длинный белый прямоугольник), связываясь с полиА хвосты. Некоторые микроРНК также полиаденилированной и будет захвачен этой процедуры. Более важно, однако, наиболее распространенными РНК в клетке, рибосомальной РНК, не будет. Это олиго выступает в качестве грунта для обратной транскриптазы для синтеза комплементарной цепи кДНК (длинный серый прямоугольник) с использованием РНК в качестве шаблона. Часть Т7 Т7-олиго (дТ) грунтовка включает полимеразы Т7 РНК-промоутер в рамке с последовательностью антисмысловых в исходное мРНК. Это используется в конце реакции в пробирке транскрипции.

Далее, мРНК в РНК / ДНК гибридных созданный в предыдущем шаге частично гидролизуется РНКазы Н создания РНК "праймеров" (небольшие белые прямоугольники), аналогичные фрагменты Оказаки создан в отстающих синтеза ДНК. ДНК-полимераза I использует РНК фрагменты ДНК премьер синтеза с использованием ДНК дополняет мРНК в качестве шаблона. Когда она достигает следующий фрагмент РНК, его 5 'к 3' нуклеазы деятельности удаляет рибонуклеотидов и заменяет их дезоксирибонуклеотидов. ДНК-лигазы добавляется лигировать любые нити, где замена ведущих прядь не является полным. T4 ДНК-полимеразы добавляется для заполнения областей, в которых РНК фрагменты служили начальные праймеров для ДНК-полимеразы I создании тупыми концами двухцепочечной кДНК, который затем очищается перед выполнением реакции IVT.

В реакции IVT, Т7 РНК-полимераза связывается с промотором Т7 включены в двухцепочечной кДНК и синтезирует антисмысловых молекул РНК (длинные черные прямоугольники), используя смысловой нити в качестве шаблона. Это служит усиление шаг, в котором тысячи антисмысловых молекул РНК производится из каждой двухцепочечной молекулы кДНК (рис. 4А).

Второй тур, как показано на рисунке 4В, начинается с обратной реакции транскрипции, который немного отличается от первого тура с начала РНК антисмысловых (твердый черный прямоугольник) и не хватает полиаденилированной хвост, который был мишенью T7-олиго (DT) грунтовки в первом туре. Таким образом, эта реакция загрунтовать случайными праймерами (маленькие прямоугольники серый) и РНК впоследствии денатурированный. Вторая реакция нить затем загрунтовать по T7-олиго (дТ) грунт, который связывается с поли-последовательности в конце 3 'смысле РНК, созданного в предыдущем обратной реакции транскрипции. Другая реакция IVT осуществляется таким же образом, как и в первом туре. Это второй тур, как правило, не реже одного раза для достижения трех раундов усиления из одной ячейки.

Применения

Методы, которые мы представили в настоящей статье, может быть переведен на большое количество приложений. Единый протокол изолятор может быть модифицирована для использования в остром ломтиками. 14 Хотя технически более сложным, те же принципы применяются в этой альтернативной подготовки. Кроме того, если размер пипетки немного скорректированы, записи физиологии клетки могут быть сделаны до сбора урожая позволяет хорошо контролируемые исследования молекулярных механизмов, стоящих за физиологических выходов. Другая небольшая модификация для изоляции процессов из клетки сомы. 15 Для этого приложения, собирать клеточных тел с одной пипеткой, а затем вернуться с новым пипетки и собирать 100-300 определены dendritэс или аксонов в пробирку 16.

Как только клетки были собраны, сравнения мРНК содержания и композиции могут быть сделаны между разными и даже в пределах одной популяции клеток. Включение биотинилированного-UTP в третий раунд Арна позволяет микрочипов анализа для определения этих относительного содержания мРНК. Состав исходной популяции мРНК может быть определена после процедуры Арна использованием следующей последовательности поколения. Усиливается Арна также может быть использован для подтверждения клеточный фенотип преобразования исследований, в которых полный набор мРНК из одной ячейки типа трансфицировали в различных типа клеток, чтобы вызвать переход фенотип последний тип клетки в том, что из первого, Процедура разработана лабораторией и известной как TIPeR 17. Эти исследования особенно полезны для изучения болезненных состояний и клеточные фенотипы и такие исследования в настоящее время в лаборатории. RT-PCR или КПЦР может быть выполнена на усиленный материал для подтверждения выражение клеточной конкретных генов. Кроме того, оценка эффективности трансфекции или трансдукции могут быть сделаны на одном уровне клетки.

Преимущества и ограничения

Как указано в аннотации, изоляции отдельных клеток для анализа устраняет среднем эффекты, наблюдаемые при анализе гетерогенных популяций клеток. Эти эффектов усреднения искажать содержания мРНК в пределах одной клетки от чрезмерного представляющих обильные стенограммы и усреднения и предотвращения обнаружения многих странах с низким обилием транскриптов. Проточная цитометрия может быть использована для сортировки отдельных клеток, но этот метод требует знания клеточных маркеров и дорогостоящее оборудование. 18 Лазерная захвата микродиссекции либо с УФ-или ИК-лазерных систем захвата микродиссекции позволяют одной клетки и даже субклеточном захвата, но требует клетки, представляющие интерес для быть расположены на поверхности очень тонких срезов. 19 Как и в проточной цитометрии, лазерная захвата микродиссекции также требует дорогостоящего оборудования.

Одно из главных преимуществ электрода техника выполнения описанных выше коллекции является то, что ценные электрофизиологические данные могут быть получены из клетки интереса до сбора урожая, что позволяет функциональных и транскриптом анализа, который будет выполняться на той же клетке. 20 Недостатком нашей техники что это требует опыта, используя микроманипуляторами. Следователи знакомы с микроманипуляторами найдете эту технику очень интуитивным, однако, люди с такого опыта не придется привыкнуть тонких движений требуется.

Неотъемлемой частью любого усиления техника преимущественного усиления определенных стенограммы в зависимости от размера и нуклеотидного состава. 4,6,7 полимеразной цепной реакции (ПЦР) на основе методики, такие как обратный транскрипции полимеразной цепной реакции (ПЦР) и быстрой амплификации кДНК концами (RACE) приводит к экспоненциальному усилению стенограммы, в то время как усиление Арна процедура приводит линейного усиления. Так, одним из основных преимуществ процедуры Арна заключается в его способности лучше сохранить относительное содержание мРНК стенограммы только линейно усиливать любые ошибки или предубеждения, которые возникают в процессе усиления, а не экспоненциально усиливает сказал ошибок и предрассудков.

Процедура Арна в сочетании с анализом микрочипов позволяет сравнивать мРНК содержания между отдельными клетками одинаковых или разных морфологии, обработанных и необработанных. Кроме того, усиленный материал может быть представлен на следующей последовательности поколений. 5,8 Тем не менее, следует проявлять осторожность в таких анализов, поскольку, в отличие от использования случайных праймеров для процедуры, олиго-дТ загрунтовать процедуре, описанной выше предубеждения усиления 3 'концы мРНК и обычно приводит к незначительному сокращению последующих усиленный материал с каждым раундом. Следует проявлять осторожность при анализе микрочипов результатов со стандартными методами, как некоторые ложные отсутствуют звонки могут возникнуть в результате слегка укороченные усиленный материал. Кроме того, в то время как результаты секвенирования действительно обеспечивают полную 5 'последовательность большинство оригинальных мРНК, 5' последовательности некоторых мРНК может быть упущен. По этим причинам, количество раундов амплификации должно быть ограничено.

Disclosures

Доктор Eberwine является изобретателем на патент Арна, который был лицензирован для LBS-технологии, в которой доктор Eberwine является держателем акций.

Acknowledgments

Спасибо Кевину Мияширо для гальванических и поддержания клеточных культур, доктору Терри Schochet для обеспечения клеточных культур для фотографии, включенные в этот документ. Кроме того, спасибо Кевину Мияширо, д-р Питер Бакли, и Тийна Pertiz для входа на процедуру Арна. Финансирование этой работы из Национального института по проблемам старения, Национальный институт по охране психического здоровья и прав Факт ресурсов Finder средств из штата Пенсильвания.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Spiegelgas coverslips Carolina Biological 63-3029
Nunc 35x10 mm culture dishes Fisher Scientific 12-565-90
Water for cell culture Lonza Inc. 17-724Q For making solutions used for cell culture and rinsing coverslips
Poly-D-Lysine MW70-150K Sigma-Aldrich 6407
Laminin, ultrapure BD Biosciences 354239
Boric acid Sigma-Aldrich B0252
MEM with Earle’s salts and glutamax Invitrogen 41090-101 For plating cells
D-glucose Sigma-Aldrich G8769
Penicillin-streptomycin Invitrogen 15140-122
Horse serum Invitrogen 16050
Cytosine beta-D-arabinofuranoside Sigma-Aldrich C1768
MEM with Earle’s salts and L-glutamine Invitrogen 11095-098 For growing cells
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P2256
B27 serum-free supplement Invitrogen 17504-044
Borosilicate glass capillary tubes (1.5mm O.D, 100mm length) Kimble Chase 34500 99 Any borosilicate glass pipette will work as long as the proper bore size is attained.
HBSS Invitrogen 14175 Any solution will work as long as the components won’t interfere with any future processing (i.e. no Ca2+ or Mg2+)
1ml syringe BD Biosciences 309628
Needle BD Biosciences Gauge depends on the diameter of the pipettes
dNTP mix Amersham 28-4065-51
dt-T7 oligo Custom Midland Certified
Second strand buffer (5x) Invitrogen Y01129
DTT Supplied with second strand buffer
E.coli DNA Ligase Invitrogen 100002324
DNA polymerase I Invitrogen 100004926
Rnase H Invitrogen 18021-071
Megascript T7 kit Ambion AM1334
Random primers BMB 11034731001
Superscript III Reverse Transcriptase Invitrogen 56575 in kit (18080-044) comes with first strand buffer (Y02321) and DTT
MEGAclear Kit Ambion 1908
MinElute Reaction Cleanup Kit Qiagen 28206
T4 DNA polymerase Invitrogen 100004994
Rnasin Promega Corp. N251B
Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit Ambion AMIL1791
Flaming/Brown micropipette puller Sutter Instrument Co. P-87 Sutter has many other models, many are discussed in the cookbook
Micromanipulator Olympus Corporation Many other micromanipulators will work such as the newer Eppendorf models
Pipette Holder Warner Instruments MP-S15A Will vary with micromanipulator and pipette O.D.
Bioanalyzer RNA 6000 Nano Kit Agilent Technologies 5067-1511

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Davis, J. E., Eberwine, J. H., Hinkle, D. A., Marciano, P. G., Meaney, D. F., McIntonsh, T. K. Methodological considerations regarding single-cell gene expression profiling for brain injury. Neurochemical Research. 29, 1113-1121 (2004).
  2. Eberwine, J. Single-cell molecular biology. Nature Neuroscience. 4, 1155-1156 (2001).
  3. Kamme, F., Salunga, R., Yu, J., Tran, D., Zhu, J., Luo, J., Bittner, A., Guo, H., Miller, N., Wan, J., Erlander, M. Single-cell microarray analysis in hippocampus CA1: Demonstration and Validation of Cellular Heterogeneity. The Journal of Neuroscience. 23, 3607-3607 (2003).
  4. Hinkle, D., Glanzer, J., Sarabi, A., Pajunen, T., Zielinski, J., Belt, B., Miyashiro, K., McIntosh, T., Eberwine, J. Single neurons as experimental systems in molecular biology. Progress in Neurobiology. 72, 129-142 (2004).
  5. Ginsberg, S. D., Elarova, I., Ruben, M., Tan, F., Counts, S. E., Eberwine, J. H., Trojanowski, J. Q., Hemby, S. E., Mufson, E. J., Che, S. Single-cell gene expression analysis: Implications for Neurodegenerative and Neuropsychiatric Disorders. Neeurochemical Research. 29, 1053-1064 (2004).
  6. Eberwine, J., Spencer, K., Miyashirto, K., Mackler, S., Finnell, R. Complementary DNA synthesis in situ: methods and applications. Methods Enxymol. 216, 80-100 (1992).
  7. Eberwine, J., Yeh, H., Miyashiro, K., Cao, Y., Nair, S., Finnell, R., Zettel, M., Coleman, P. Analysis of gene expression in single live neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89, 3010-3014 (1992).
  8. Kelz, M. B., Dent, G. W., Therianos, S., Marciano, P. G., McIntosh, T. K., Coleman, P. D., Eberwine, J. H. Single-cell antisense RNA amplification and microarray analysis as a tool for studying neurological degeneration and restoration. Sci. Aging Knowledge Eviron. 1, re1-re1 (2002).
  9. Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Research. 126, 397-425 (1977).
  10. P-1000 & P-97 Pipette Cookbook. , rev. F, Sutter Instrument. (2010).
  11. MinElute Handbook For MinElute Reaction Cleanup Kit. , Qiagen. 28-29 (2004).
  12. Megascript kit. , Ambion. 7-8 Forthcoming.
  13. MEGAclear kit. , Applied Biosystems. 4-5 Forthcoming.
  14. Eberwine, J., Kacharmina, J. E., Andrews, C., Miyashiro, K., McIntosh, T., Becker, K., Barrett, T., Hinkle, D., Dent, G., Marciano, P. mRNA expression analysis of tissue sections and single cells. The Journal of Neuroscience. 21, 8310-8314 (2001).
  15. Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., Yool, A., Dement, W. C., Barchas, J. D., Eberwine, J. H. Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87, 1663-1667 (1990).
  16. Miyashiro, K., Dichter, M., Eberwine, J. On the nature and differential distribution of mRNAs in hippocampal neuritis: Implications for neuronal functioning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 10800-10804 (1994).
  17. Sul, J., Wo, C. K., Zeng, F., Jochems, J., Lee, M. T., Kim, T. K., Peritz, T., Buckley, P., Cappelleri, D. J., Maronski, M., Kim, M., Kumar, V., Meaney, D., Kim, J., Eberwine, J. Transcriptional transfer produces a predictable cellular phenotype. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 7624-7629 (2009).
  18. Sow, F. B., Gallup, J. M., Sacco, R. E., Ackerman, M. R. Laser capture microdissection revisited as a tool for transcriptomic analysis: Application of an excel-based qPCR preparation software (PREXCEL-Q). Int. J. Biomed. Sci. 5, (2010).
  19. Vandewoestyne, M., Deforce, D. Laser capture microdissection in forensic research: a review. Int J Legal Med. 124, (2010).
  20. Eberwine, J., Bartfai, T. Single cell transcriptomics of hypothalamic warm sensitive neurons that control core body temperature and fever response Signaling asymmetry and an extension of chemical neuroanatomy. Pharmacol. Ther. , (2010).

Tags

Neuroscience выпуск 50 одноклеточные транскриптом Арна усиления RT-PCR молекулярной биологии генной экспрессии

Erratum

Formal Correction: Erratum: Transcriptome Analysis of Single Cells
Posted by JoVE Editors on 11/18/2011. Citeable Link.

A correction was made to Transcriptome Analysis of Single Cells. There were errors in the volumes used in the aRNA Amplification section. The volumes were changed from:

  • 6.2.1 7.5 μL 5x Second strand buffer
  • 6.2.4 Add 29 μL DEPC water
    2 μL glycogen (5 mg/mL) 1/10 volume (3 μL) 3M Sodium acetate
    2.5 volumes (~250 μL) cold 100% ethanol
  • 6.2.7 Remove the supernatant and air dry for 15-20 minutes.
  • 6.3.4.2 Add 50 μL DEPC water
    2 μL glycogen (20 mg/mL)
    0.6 volumes (37.2 μL) 5M Ammonium acetate
    2.5 volumes (~180 μL) cold ethanol
  • 6.3.4.7 Remove supernatant and airy dry 15-20 minutes.
  • 6.3.5.1 Add 50 μL DEPC water
    2 μL glycogen (20 mg/mL)
    0.6 volumes (37.2 μL) 5M Ammonium acetate
    1 volume (98 μL) phenol:chlorofom:isoamyl alcohol 25:24:1 (equilibrated to pH 7.8-8.0)
  • 6.3.5.7 Remove supernatant and air dry 15-20 minutes.

to

  • 6.2.1 5.6 μL 5x Second strand buffer
  • 6.2.4 Add 40 μL DEPC water
    1 μL glycogen (5 mg/mL) 1/10 volume (5 μL) 3M Sodium acetate
    2.5 volumes (~125 μL) cold 100% ethanol
  • 6.2.7 Remove the supernatant and air dry for 15-20 minutes.
  • 6.3.4.2 Add 50 μL DEPC water
    2 μL glycogen (5 mg/mL)
    0.1 volumes (10 μL) 5M Ammonium acetate
    2.5 volumes (~275 μL) cold ethanol
  • 6.3.4.7 Remove supernatant and air dry 15-20 minutes.
  • 6.3.5.1 Add 90 μL DEPC water
    2 μL glycogen (5 mg/mL)
    0.1 volumes (10 μL) 5M Ammonium acetate
    1 volume (100 μL) phenol:chlorofom:isoamyl alcohol 25:24:1 (equilibrated to pH 7.8-8.0)
  • 6.3.5.7 Remove supernatant and air dry 15-20 minutes.
Транскриптома Анализ отдельных клеток
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Morris, J., Singh, J. M., Eberwine,… More

Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H. Transcriptome Analysis of Single Cells. J. Vis. Exp. (50), e2634, doi:10.3791/2634 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter