Fabricage van micropatterned Hydrogelen voor Neurale Cultuur Systems met behulp van Dynamic Mask Projectie Fotolithografie

Summary

Eenvoudige technieken worden beschreven voor de snelle productie van microfabricated neurale cultuur systemen met behulp van een digitale microspiegeltjes voor dynamische masker projectie lithografie op regelmatige celcultuur substraten. Deze cultuur systemen kunnen meer representatief zijn voor natuurlijke biologische architectuur, en de beschreven technieken kan worden aangepast voor tal van toepassingen.

Abstract

In toenemende mate zijn patroon celcultuur-omgevingen steeds een relevante techniek om cellulaire kenmerken studie, en veel onderzoekers geloven in de noodzaak voor 3D-omgevingen te vertegenwoordigen in vitro experimenten die beter na te bootsen in vivo kwaliteiten ^1-3. Studies op terreinen zoals onderzoek naar kanker ^4, neurale techniek ^5, hartfysiologie ^6, en cel-matrix interacties ^7,8 hebben aangetoond cel gedrag verschilt aanzienlijk tussen de traditionele monolaagculturen en 3D-constructies.

Hydrogels worden gebruikt als 3D-omgevingen vanwege hun verscheidenheid, veelzijdigheid en het vermogen om op maat moleculaire samenstelling door functionalisering ^9-12. Tal van technieken bestaan ​​voor de oprichting van constructies als cel-ondersteunende matrices, waaronder electrospinning ^13, elastomeer postzegels ^14, inkjet printen ^15, additief photopatterning ^16, statische fotomasker projectie-lithografie ¹⁷ en dynamische masker microstereolithography ^18. Helaas, deze methoden omvatten meerdere productie stappen en / of apparatuur die niet gemakkelijk aan te passen aan de conventionele cel-en weefselkweek methoden. De techniek die in dit protocol past de laatste twee methoden, met behulp van een digitaal apparaat Micromirror (DMD) om dynamische fotomaskers voor de verknoping geometrisch bepaalde poly-(ethyleen glycol) (PEG) hydrogels, geïnduceerd door de UV-geïnitieerde polymerisatie van vrije radicalen te creëren. De resulterende "2.5D" structuren zorgen voor een beperkte 3D-omgeving voor neurale groei. We maken gebruik van een dual-hydrogel aanpak, waarbij PEG fungeert als een cel-restrictieve regio leveren structuur aan een anders vormeloze, maar cel-tolerante zelfassemblerende gel gemaakt van een Puramatrix of agarose. Het proces is een snelle eenvoudige stap fabricage die zeer reproduceerbaar en gemakkelijk aangepast voor gebruik met conventionele celcultuurmethoden en substraten.

Hele weefsel explantaten, zoals embryonale achterwortelganglia (DRG), kunnen worden opgenomen in de dubbele hydrogel bouwt voor experimentele testen zoals neurietuitgroei. Bovendien kan gescheiden cellen worden ingekapseld in de fotoverknoopbare of zelf polymeriseren hydrogel, of selectief gehandeld op grond van de doorlaatbare membraan te ondersteunen met behulp van cel-restrictieve photopatterning. Met behulp van de DMD, creëerden we hydrogel constructies tot ~ 1 mm dik, maar dunne film (<200 pm) PEG structuren werden beperkt door zuurstof doven van de vrije radicalen polymerisatiereactie. We vervolgens ontwikkelde een techniek gebruik te maken van een laagje olie boven de polymerisatie vloeistof die dunne PEG-structuur polymerisatie toegestaan.

In dit protocol beschrijven we de snelle creatie van 3D-hydrogel-systemen voor de productie van microfabricated neurale cel-en weefselculturen. De dubbele aangetoond hydrogel bouwt hierin vertegenwoordigen veelzijdig in vitro modellen die nuttig kan zijn voor studies in de neurowetenschappen met betrekking tot overleving van de cel, migratie, en / of neurieten groei en begeleiding. Bovendien, als het protocol kan werken voor vele soorten van hydrogels en cellen, de mogelijke toepassingen zijn zowel gevarieerd en uitgebreid.

Protocol

1. DMD Setup

1. De DMD raad van bestuur, UV-licht gids (met collimator) en 4x objectief zijn allemaal verticaal gemonteerd op een trillingsisolerende tafel.
2. Het UV-licht gids moet zodanig worden ingesteld dat het licht de spiegel reeks hits op een hoek van 45 ° ten opzichte van het vlak van de spiegels, en 24 ° onder het vlak van de spiegels (figuur 1).
3. Het objectief is gemonteerd, zodat de afstand van de DMD aan de doelstelling lens komt overeen met de brandpuntsafstand in verband met de lens.
4. Een omgekeerde microscoop bevindt zich onder het objectief, zodanig dat het gericht licht wordt weerkaatst door de DMD kan worden gevisualiseerd door de microscoop. De afstand van de doelstelling lens om de polymerisatie oppervlakte moet ongeveer overeenkomen met de werkafstand van de lens. Het podium op de microscoop kan dan gebruikt worden om deze afstand aan te passen aan fijn scherp op het beeld. Deze afstand kan variëren afhankelijk van de gekozen polymerisatie oppervlak.

2. Dual Hydrogel Constructen voor Tissue explantatie Culturen

A. DRG explantatie hechting

1. Smeer de wanden van de 6-well collageen gecoate celkweek inserts (Corning) met Rain-X, en zorg ervoor dat het membraan zelf te voorkomen. (Als alternatief kan een hydrofobe barrière pen worden gebruikt.)
2. Hydrate inserts 's nachts met 1,5 ml van de hechting medium in een incubator bij 37 ° C en 5% CO _2. Adhesie medium is neurobasal medium met 10% foetaal runderserum, 1% penicilline / streptomycine, 0,5 mm L-glutamine, en 20 ug / ml NGF.
3. Oogst embryonale achterwortelganglia (DRG) van de E-15 ratten pups. DRG moet worden uitgeplaat op collageen gecoate 6-well inserts, maar liefst vier per voegen.
4. Incubeer inserts voor 2 uur, zodat voor de DRG de naleving van het membraan.

B. Dynamische masker fotopolymerisatie

Een digitaal Micromirror apparaat (DMD) is een 1024 x 768 reeks van individuele spiegels, vergelijkbaar met die in de projectie televisies, die selectief licht reflecteert op basis van spiegel positie. Voor ons doel is de DMD gebruikt voor het patroon ultraviolet (UV) licht op fotoverknoopbare hydrogels, het creëren van bepaalbare hydrogel geometrieën in een eenvoudige en snelle manier. Figuur 1 toont de inrichting van het DMD-en UV-licht pad. Hoewel onze DMD is een zelfstandige eenheid, kan het apparaat ook worden geïntegreerd voor gebruik met veel bestaande microscopen.

1. Verwijder alle overtollige vloeistof uit te voegen, en voeg 500 ul van polymerisatie medium binnen het in te voegen. Polymerisatie medium bevat 10% PEG (MW 1000) en 0,5% Irgacure 2959 opgelost in neurobasal medium aangevuld met 20 ug / ml NGF en 1% Pen / Strep.
2. Leg het element onder het DMD apparaat op een Rain-X behandeld glasplaatje.
3. Laad het juiste zwart-wit beeld om te worden gebruikt als een "fotomasker" op de DMD, door het gebruik van de meegeleverde ALP-3 basic GUI-programma. Voor onze doeleinden, is een bifurcating vorm gekozen om voor de uitvoering van neurieten geleidingssystemen.
4. Met behulp van een omgekeerde microscoop voor visualisatie, lijnt het weefsel explantaten met de juiste locatie op de fotomasker met behulp van een zichtbare lichtbron weerkaatst de DMD.
5. Schakel het zichtbare licht bron voor de UV-lichtbron, en verlichten van de PEG-oplossing totdat verknoping is voldoende. (Voor de voorwaarden gegeven en 5,0 Watt / cm ² incident op de DMD, verknoping kan worden voltooid in slechts 55 seconden.) Herhaal dit voor alle vier de DRG op de insert.
6. Was elke insert drie keer met steriele DPBS en 1% Pen-Strep.
7. Voeg 1,5 ml groeimedium onder de celkweek inserts, en laat in een incubator equilibreren gedurende 30 minuten. Groeimedium is neurobasal medium dat 2% B-27, 1% Pen / Strep, 0,5 mm L-glutamine, en 20 ug / ml NGF.

C. Secundaire hydrogel

Puramatrix

1. Voor de neuronale toepassingen, is 1% Puramatrix verdund volgens de instructies van de fabrikant tot 0,15% in een steriele H ₂ O en aangevuld met 1 ug / ml oplosbaar laminine.
2. Alle overtollige media moeten worden verwijderd uit de PEG vides, die de DRG explantaten bevatten, met behulp van een steriel wattenstaafje applicator, Kimwipe of micropipet.
3. Puramatrix wordt toegevoegd aan de PEG vides met een micropipet om de lege ruimte op te vullen, kan uitzetten. Afhankelijk van het dode volume, meestal ~ 1 ui wordt gebruikt per bouwen.
4. Puramatrix begint onmiddellijk het proces van zelf-assemblage na contact met een fysiologische zoutoplossing, dat wil zeggen de gezwollen PEG, maar 1,5 ml groeimedium toegevoegd onder de insert en geplaatst in de incubator gedurende een uur aan de totale gelering te verzekeren.
5. In eerste instantie Puramatrix is ​​licht zuur, zodat veranderingen in de media na een uur om de pH van het evenwicht.
6. Media veranderingen nodig ongeveer elke 48 uur. Wees voorzichtig dat alle media istoegevoegd onder de insert, om de integriteit van mechanisch zwakke Puramatrix te beschermen.

Agarose

1. Voor de neuronale toepassingen wordt agarose verdund tot een 1% oplossing in groeimedium en geplaatst in een 60 ° C waterbad tot de agarose volledig oplost (~ 1 uur). De oplossing wordt dan aangevuld met 1 ug / ml oplosbaar laminine.
2. Alle overtollige media moeten worden verwijderd uit de PEG vides.
3. Agarose wordt toegevoegd aan de PEG holtes in om de lege ruimte op te vullen, kan uitzetten. Afhankelijk van het volume van de leegte, meestal ~ 1 ui wordt gebruikt per bouwen.
4. 1,5 ml groeimedium is vooraf gekoeld (8 ° C) in een 6-wells plaat, en de agarose met inserts worden overgebracht naar de gekoelde media en onderhouden in een koelkast bij 8 ° C gedurende ten minste drie minuten agarose laten gel.
5. Ten slotte worden de inserts overgebracht naar 1,5 ml voorverwarmde groeimedium (37 ° C) en gehandhaafd in de incubator bij 37 ° C, met de media veranderingen nodig zijn om de 48 uur.

3. Dual Hydrogel 3D Cell Encapsulation

Dual hydrogel inkapseling is geschikt wanneer het gebruik van een zelf-assemblage gel. De fotoverknoopbare gel, in dit geval PEG, fungeert als een structurele ondersteuning voor de geometrische presentatie van de zelf-assemblage gel, bijvoorbeeld Puramatrix of agarose. Sommige van de methoden, met name de aard van de gel en de keuze van fotomasker, zal afhangen van de specifieke gewenste toepassing.

1. Laad een geschikt masker op de DMD. Voor onze toepassing, overleving van de cel, we simpelweg gekozen voor een cilindrische presentatie van Puramatrix om te helpen bij de beeldvorming van cellen. Onderzoekers bestuderen van cell signaling geïnteresseerd zou zijn in een compartimentele geometrie te zorgen voor de verspreiding van chemotactische moleculen. Daarnaast werd een ruwe benadering van een slagader aangetoond dat het mogelijke toepassing te vertegenwoordigen bloedvat onderzoek.
2. Behandel de wanden van een polyester celkweek insert met Rain-X, en plaats onder DMD op Rain-X gecoate glijbaan.
3. Voeg 500 ul van polymerisatie medium om het in te voegen. Induceren PEG verknoping door blootstelling aan UV-licht voor 55 seconden.
4. Was driemaal uit met steriel DPBS en 1% Pen-Strep.
5. Verwijder al het overtollige papier uit de PEG vides.
6. Spin down-cellen op de gewenste dichtheid in een pellet. Zorg moet worden genomen om alle medium te verwijderen uit de celpellet voorafgaand aan de mixen, zoals Puramatrix begint self-assembly onmiddellijk na contact met een zoutoplossing. Hang de cellen binnen 0,15% Puramatrix verdund in een steriele H ₂ O aangevuld met 10% sucrose.
7. Injecteer de Puramatrix / cel / sucrose mengsel in holtes in de PEG.
8. Voeg 1,5 mL van de groei medium onder de insert, en laat de gel in incubator gedurende een uur.
9. Verandering media na een uur, en ~ om de 48 uur daarna.

4. Single Hydrogel 3D Cell Encapsulation

Een hydrogel inkapseling geschikt zou zijn voor iedere situatie waarin de cellen binnen kan worden onderzocht van een fotoverknoopbare hydrogel.

1. Laad een geschikt masker op de DMD. Voor de overleving van de cel studies hebben we opnieuw gekozen voor een basic cirkelvormig masker om een ​​cilinder te vertegenwoordigen. Maskers vergelijkbaar met die getoond in de methode 4 weer kon worden toegepast voor het juiste gebied van onderzoek.
2. Behandel een polyester celkweek insert met Rain-X, en plaats onder DMD op Rain-X gecoate glijbaan.
3. Cellen op elke gewenste concentratie kan direct worden toegevoegd aan de 10% PEG-oplossing, mengen goed om een ​​homogene verdeling te garanderen.
4. Voeg 500 ul van polymerisatie medium om het in te voegen. Induceren PEG verknoping door blootstelling aan UV-licht voor 55 seconden.
5. Was driemaal uit met steriel DPBS en 1% Pen-Strep.
6. Vul met groeimedium zowel onder als op de top van de insert, veranderende elke ~ 2 dagen.

5. Thin Film Hydrogel Polymerisatie

1. Laad een geschikt masker op de DMD.
2. Behandel een collageen gecoat polyester celkweek insert met Rain-X, en plaats op Rain-X gecoate glijbaan.
3. Voeg voldoende polymerisatie medium tot net onder de bodem van de insert (~ 250-300 ul voor 6-wells plaat inserts). Laat de media om de insert membraan doordringen gedurende 30-45 minuten bij kamertemperatuur.
4. Verwijder overtollige polymerisatie medium van de insert met een micropipet of Kimwipe. Voeg een voldoende hoeveelheid UV-transparante olie volledig te bedekken de bodem van de insert. Laat de insert om voor 15-30 minuten zitten bij kamertemperatuur, lang genoeg voor de olie tot een aparte laag boven de polymerisatie medium het verzadigen van de insert membraan te vormen.
5. Plaats het inzetstuk en schuif onder de DMD. Induceren PEG verknoping door blootstelling aan UV-licht. Vanwege de geringe dikte van de PEG laag, kan verknopen worden afgerond in slechts 15 seconden bij 5,0 Watt / cm ² incident op de DMD.
6. Bewaar de insert in een 6-well weefselkweek plaat. Voeg groeimedium aan gesuspendeerd cellen, in de gewenste concentratie, en pipet een voldoende volume van de celsuspensie in de cel cultuur te plaatsen om de gewenste cel dichtheid te verkrijgen. Vervolgens voeg genoeg groeimedium onder de insert volledig behouden levensvatbaarheid van de cellen (~ 1,5 ml).
7. Na 48 uur zijn verstreken, was de inzet drie keer met steriele DPBS en 1% Pen-Strep aan een unadhered cellen los te maken. Verandering media ongeveer een keer per 48 uur.

6. Representatieve resultaten

Voorbeelden van dubbele hydrogel constructen die DRG explantaten zijn weergegeven in figuur 2. Merk op dat cellulaire migratie en neurieten uitbreiding is beperkt tot de cel tolerante streek van de dubbele hydrogel bouwen. Figuur 3 toont gescheiden cellen op dezelfde ingekapseld in de dubbele hydrogel constructen. Vanwege het dynamische karakter van het DMD fotomasker, is de geometrie beschikbaar is voor inkapseling alleen beperkt door de afmetingen en resolutie van de optiek. Cel inkapseling was het ook mogelijk in een enkel fotopolymeriseerbare hydrogel, PEG, en een live / dode levensvatbaarheid test werd uitgevoerd, zoals blijkt in figuur 4. Inkapseling in PEG is alleen bedoeld als een voorbeeld, evenals PEG niet een ideale omgeving voor neurale cellen vertegenwoordigen. Daarom is de levensvatbaarheid van de cellen gerealiseerd in onze PEG construeert is begrijpelijk laag. Tot slot, zijn voorbeelden van het gebruik van dunne films PEG als een gedessineerde beperkend laag voor cel-adhesie op celkweek inserts weergegeven in figuur 5. Daarnaast zijn voorbeelden van mogelijke "slechte" resultaten aangeboden in Figuur 6.

De resultaten vormen slechts een klein deel van de mogelijke toepassingen van de ontwikkelde methoden in ons lab. Ze zijn bedoeld om het gemak, veelzijdigheid en de levensvatbaarheid van onze aanpak aan te tonen, en kan worden behandeld als 'proof of principle "voor onderzoekers om hun eigen mogelijke aanpassingen te ontwikkelen.

Figuur 1. Schematische weergave van het lichtpad wordt gebruikt voor fotolithografie. Inzet: De UV-licht verlicht de DMD onder een hoek van 45 ° en 24 ° onder het vlak van de spiegel array.

Figuur 2. Gelabelde de groei en proliferatie in DRG met dual hydrogel constructen. AD) Afbeeldingen portretteren gepolymeriseerde PEG constructen (grijs) met neurieten gemerkt met Beta III tubuline (groen), DAPI gekleurde celkernen (blauw). De DRG explantaten zijn opgenomen in Puramatrix en gelegen in de circulaire regio's van de patroon, met neurieten groeien naar de splitsing (s).

Figuur 3. Dual hydrogel constructen die cellen gelabeld met calceïne AM, een levende cel marker, na 48 uur in groeimedium. AD) Verschillende PEG vormen, gevuld met Puramatrix met gedissocieerde DRG neuronen (~ 5x10 ³ cellen / ml).

Figuur 4. Single hydrogel construct bevattende levende cellen gemerkt met Calceïne AM (groen) en dode cellen gelabeld met ethidium homodimeer-1 (rood) na 24 uur in groeimedium (5x10 ³ cellen / ml).

Figuur 5. Cell beperkende PEG gepolymeriseerd als een dunne film met behulp van een "test patroon" selectief gedissocieerde cellen zich aan het collageen gecoate membraan van doorlatend ondersteunt. A, B) Levende cellen zijn gelabeld na 48 uur met Calceïne AM (groen), terwijl de dode cellen zijn voorzien van ethidium homodimeer-1 (rood). Minimale celadhesie vindt plaats in het gebied met de dunne PEG film.

Figuur 6. Vertegenwoordiger beelden van ongewenste resultaten. A) Gedeeltelijke polymerisatie van PEG, wat leidt tot een onbruikbaar PEG te bouwen. Onjuiste polymerisatie kan worden beïnvloed door de aanwezigheid van een meniscus in de pre-polymeer medium, onvoldoende hoeveelheden van de polymerisatie medium, onvoldoende UV-blootstelling of oneigenlijk focus van de optiek plaatsvinden. B) Image portretteren gepolymeriseerde PEG constructen (grijs) met neurieten gemerkt met Beta III tubuline (groen), DAPI gekleurde celkernen (blauw). De neurieten waren in staat om te groeien buiten het patroon PEG-kanalen. Dit gebeurt vaak in de voorwaarde dat Puramatrix overflows op de top van de PEG deel tijdens de injectie.

Discussion

De methode die hierin beschreven kunnen worden gebruikt door een onderzoeker op zoek naar eenvoudige en reproduceerbare celkweek systemen. Theoretisch, als gevolg van de grote verscheidenheid aan fotopolymeriseerbare hydrogels beschikbaar is, kan de omgeving worden afgestemd, zodat voor gebruik met elke cel type, waaronder hele weefsel explantaten. Daarnaast is de dual hydrogel systeem maakt het mogelijk voor een verbeterde ruimtelijke controle bij de presentatie van zelf-polymeriseren hydrogels, die de neiging hebben om amorfe vormen op hun eigen vorm. De resulterende "2.5D" micropatterned hydrogel construeert een 3D-matrix voor neurale groei gepresenteerd in een 2D-configuratie die handige microscopische evaluatie mogelijk maakt. De ondergrond waarop de gels worden gepolymeriseerd kan ook worden gevarieerd, waardoor meer controle in de experimentele design. Onze methoden zijn geoptimaliseerd voor gebruik met celkweek doorlaatbaar ondersteunt, zoals we hebben verbeterd levensvatbaarheid (figuur 4) gezien in vergelijking met de polymerisatie op glasplaatjes (gegevens niet getoond). Kunnen echter ook andere polymerisatie oppervlakken meer van toepassing zijn voor verschillende toepassingen: fabricage op glas slides gebruikt in microfluidics experimenten of mobiele aggregaat formaties, bijvoorbeeld.

Onze ervaring met deze cultuur systemen heeft geleid tot de identificatie van mogelijke gebieden van problemen. Ten eerste zijn voorzichtig technieken die nodig zijn om de steriliteit van de constructen te behouden. Vanwege het volumineuze karakter van het DMD setup, is het moeilijk om polymerisatie stappen te opereren onder steriele omstandigheden. Ter bestrijding van dit probleem, de spoeling stap beschreven in de methoden is nuttig, en antibiotica moeten worden gebruikt in alle media. Daarnaast is de uiteindelijke dikte en de vorm van de gepolymeriseerde constructie is sterk afhankelijk van de vloeistof gedrag van de pre-polymeer mengsel, en de aanwezigheid van een meniscus kan resulteren in een gel constructies die te dun zijn of niet volledig gepolymeriseerd (Figuur 6). Twee stappen kunnen worden genomen om de vorming van een meniscus in de cel cultuur inserts te minimaliseren. Voor dikke hydrogels (> 200 m), een eenvoudige coating van Rain-X rond de binnenwand van de insert voldoende is. Echter, kort zoals hierboven beschreven, voor dunne constructen (<200 micrometer), is een olielaag nodig om zowel het minimaliseren van de meniscus en zuurstof afschrikken van de vrije radicalen polymerisatie te ontkrachten. Resolutie bleek te zijn afhankelijk van de dikte, met een daling in functie grootte gerealiseerd met steeds dikkere gels. De resolutie ook gevarieerd, afhankelijk van de vraag of de functie een positieve of negatieve reliëf vertegenwoordigd in de hydrogel. Toch behaalden we een voldoende resolutie voor de constructen met minimale functie maten op de schaal van ~ 100 micrometer met alleen microscoop doelstellingen focussen optiek.

Onze experimenten hebben aangetoond dat de dual hydrogel construeert hier beschreven een uitstekende basis voor de vorming van basic in-vitro-modellen van neurieten groei en begeleiding te geven. De gebruikte techniek is micropatterning een aanpassing van de bestaande methoden ^18,19, maar onze set-up benadrukte een eenvoudig te implementeren en ontwerpen was geoptimaliseerd voor de productie van dubbele hydrogel constructen op celkweek inserts; celkweek inserts zijn van vitaal belang voor het verbeteren van levensvatbaarheid van de cellen en als crosslinking rond eerder aanhangende weefsels explantaten. De omvang van de getoonde resultaten wordt beperkt door de belangen van ons lab, maar we geloven dat de methoden beschreven in deze publicatie nuttig zal blijken voor onderzoekers op zoek naar een relatief goedkoop, snel en gemakkelijk te gebruiken methode voor het vervaardigen van 3D-celkweek modellen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Digital Micromirror Device	Texas Instruments	DLPD4X00KIT
Collagen Coated Transwell Permeable Support	Corning	3491	Also referred to as Cell Culture Insert in manuscript
Polyester Transwell Permable Support	Corning	3412	Also referred to as Cell Culture Insert in manuscript
Neurobasal Medium	Invitrogen	21103-049
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	16000-036
L-glutamine	Invitrogen	25030-164
Nerve Growth Factor	Invitrogen	13257-019
Pen/Strep	Invitrogen	15140-122
B-27 Supplement	Invitrogen	17504-044
DPBS	Invitrogen	14190-250
Puramatrix	BD Biosciences	354250
PEG 1000	Polysciences, Inc.	15178
Irgacure 2959	Ciba Specialty Chemicals	0298913AB
Oil	Have used both canola oil and silicon oil		Needs to be UV transparent, and minimize +/- meniscus formation
OmniCure Series 1000	EXFO
Rain-X