המצאה של הידרוג micropatterned למערכות התרבות עצבית באמצעות photolithography דינמי הקרנה מסכת

Summary

טכניקות פשוטות מתוארים לייצור מהיר של microfabricated מערכות תרבות עצביים באמצעות מכשיר micromirror דיגיטלי ליתוגרפיה הקרנת דינמי מסכה על מצעים תרבות קבוע התא. אלה מערכות תרבות יכול להיות נציג נוסף של ארכיטקטורה ביולוגי טבעי, ואת הטכניקות המתוארות יכול להיות מותאם עבור יישומים רבים.

Abstract

יותר ויותר, תרבות בדוגמת סביבות התא נעשים בטכניקה רלוונטי ללמוד מאפיינים הסלולר, וחוקרים רבים מאמינים בצורך 3D סביבות לייצג בניסויים במבחנה אשר עדיף לחקות תכונות vivo ב ^1-3. מחקרים בתחומים כגון סרטן מחקר ^4, ההנדסה העצבית ^5, לב ופיזיולוגיה ^6, תא-matrix אינטראקציה ^7,8 הראו התנהגות התא שונה באופן משמעותי בין תרבויות monolayer מסורתיים בונה 3D.

הידרוג משמשים 3D סביבות בגלל הרבגוניות שלהם, במגוון ואת היכולת להתאים את ההרכב המולקולרי באמצעות functionalization ^9-12. טכניקות רבות קיימות עבור יצירה של מבנים כמו תאים תומכים מטריצות, כולל electrospinning ^13, אלסטומר ¹⁴ בולים, דיו להדפסה ^15, photopatterning כתוסף ^16, photomask סטטי הקרנת-ליתוגרפיה ^17, microstereolithography מסכה דינמי ^18. למרבה הצער, שיטות אלה כוללות מדרגות ייצור מרובים ו / או ציוד לא להתאמה בקלות לתא קונבנציונאלי ותרבות שיטות רקמות. הטכניקה המועסקים פרוטוקול זה מתאים את שני האחרונים, באמצעות מכשיר micromirror הדיגיטלי (DMD) כדי ליצור photomasks דינמי מסוים גאומטרית crosslinking פולי (אתילן גליקול) (PEG) הידרוג, הנגרמת באמצעות פילמור UV יזם רדיקלים חופשיים. כתוצאה מכך "2.5D" מבנים לספק סביבת 3D מוגבל לצמיחה עצבית. אנו מעסיקים גישה כפול הידרוג'ל, שם PEG משמש מבנה התא מגבילים אזור באספקת ג'ל הרכבה עצמית צורה אחרת אבל התא מתירני עשוי גם Puramatrix או agarose. התהליך הוא ייצור מהיר פשוט צעד אחד אשר לשעתקו מאוד להתאים בקלות לשימוש עם שיטות קונבנציונליות תרבות התא מצעים.

Explants רקמות שלמות, כמו הגרעינים עובריים השורש הגבי (DRG), יכול להיות משולב בתוך המבנים הידרוג כפול עבור מבחני ניסיוניים כגון תולדה neurite. בנוסף, התאים ניתק ניתן הגלום הידרוג polymerizing photocrosslinkable או עצמית, או דבק סלקטיבי קרום חדיר תמיכה באמצעות תאים מגבילים photopatterning. שימוש DMD, יצרנו הידרוג בונה עד ~ 1mm עבה, אבל סרט דק (<200 מיקרומטר) מבנים PEG היו מוגבלים על ידי מרווה חמצן התגובה פילמור חינם הרדיקלי. אנו מכן פיתח טכניקה ניצול שכבה של שמן מעל הנוזל פילמור אשר אפשרה פילמור דק מבנה PEG.

בפרוטוקול זה, אנו מתארים את הבריאה מהירה של מערכות הידרוג 3D עבור ייצור של תאים עצביים microfabricated ותרבויות רקמות. בונה הידרוג כפול הפגינו בזאת מייצגים צדדי במודלים חוץ גופית שעשוי להיות שימושי עבור מחקרים במדעי המוח מעורבים הישרדות התא, הגירה, ו / או צמיחה הדרכה neurite ו. יתר על כן, כפרוטוקול יכול לעבוד עבור סוגים רבים של תאים הידרוג, יישומים אפשריים הן מגוון עצום.

Protocol

1. DMD ההתקנה

1. הלוח DMD, מדריך אור UV (עם collimator) ואת העדשה אובייקטיבי 4x מורכבים כל אנכית על השולחן בידוד רעידות.
2. המדריך אור UV צריך להיות מותאם כך האור פוגע מערך המראה בזווית של 45 מעלות ביחס למישור של מראות, ° 24 מתחת למטוס המראות (איור 1).
3. העדשה מטרת מותקן כך המרחק בין DMD אל העדשה אובייקטיבי המתאים אורך המוקד הקשורים העדשה.
4. מיקרוסקופ הפוך ממוקמת מתחת העדשה אובייקטיבי, כך שהאור המוחזר מן ממוקד DMD ניתן דמיינו מבעד למיקרוסקופ. המרחק בין העדשה המטרה אל פני השטח פילמור יש כ מתאימות מרחק העבודה של העדשה. השלב על המיקרוסקופ לאחר מכן ניתן להשתמש כדי לכוון את המרחק עד דק למקד את התמונה. מרחק זה עשוי להשתנות בהתאם על פני השטח פילמור הנבחר.

2. Hydrogel בונה כפול עבור תרבויות Explant רקמות

א DRG הידבקות explant

1. מעיל קירות מצופים היטב 6-קולגן תא מוסיף תרבות (קורנינג) עם ה-X גשם, מקפיד להימנע קרום עצמו. (לחלופין, עט חיץ הידרופובי ניתן להשתמש.)
2. מוסיף מימה לילה עם 1.5 מ"ל של מדיום הידבקות באינקובטור ב 37 ° C ו 5% CO _2. המדיום הוא מדיום הדבקה neurobasal עם סרום 10% שור עוברית, 1% פניצילין / סטרפטומיצין, 0.5mm L-גלוטמין ו -20 מיקרוגרם / מ"ל ​​NGF.
3. הגב עובריים קציר שורש הגרעינים (DRG) מ E-15 גורי חולדה. DRG אמור להיות מצופה על מצופה קולגן 6-מוסיף גם, כמה שיותר ארבעה לכל הכנס.
4. דגירה מוסיף למשך 2 שעות, כדי לאפשר DRG דבקות הממברנה.

ב Dynamic photopolymerization מסכה

מכשיר micromirror הדיגיטלי (DMD) היא 1024 x 768 מערך של מראות בודדים, דומה לזה של טלוויזיות הקרנה, אשר משקף באופן סלקטיבי אור מבוסס על עמדה במראה. לענייננו, DMD משמש אור אולטרה סגול (UV) על גבי תבנית הידרוג photocrosslinkable, יצירת גאומטריות הידרוג specifiable בצורה פשוטה ומהירה. איור 1 מתאר את ההתקנה של נתיב האור DMD ו-UV. למרות DMD שלנו היא יחידה עצמאית, המכשיר יכול גם להיות משולבת לשימוש עם מיקרוסקופים רבים הקיימים.

1. הסר את כל נוזל עודף להוסיף, ולהוסיף 500 μL של המדיום פילמור בתוך להכניס את. פילמור PEG בינוני מכיל 10% (1,000 מגה וואט) ו Irgacure 0.5% 2959 מומס בינוני neurobasal בתוספת 20 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו - NGF פן 1% / סטרפטוקוקוס.
2. מניחים את הכנס מתחת למכשיר DMD בשקופית Rain-X כוס טיפול.
3. טען את התמונה בשחור לבן מתאים לשמש "photomask" על DMD, באמצעות התוכנית כללה GUI ALP-3 בסיסית. לענייננו, בצורת מתפצל נבחר כדי לאפשר יישום של מערכות neurite הדרכה.
4. באמצעות מיקרוסקופ הפוך להדמיה, ליישר את explants רקמה עם המיקום המתאים על photomask באמצעות מקור האור הנראה המשקף את DMD.
5. החלף את מקור האור הנראה את מקור האור האולטרה סגול, ולהאיר את הפתרון PEG עד crosslinking מספיק. (לקבלת התנאים נתון 5.0 ווטס / ² ס"מ על התקרית DMD, crosslinking ניתן להשלים קטנה כמו 55 שניות.) חזור על הפעולה עבור כל ארבעת DRG על להכניס את.
6. לשטוף כל להכניס שלוש פעמים עם DPBS סטרילית 1% עט סטרפטוקוקוס.
7. הוסף בינוני צמיחה 1.5mL מתחת מוסיף תרבית תאים, ומאפשרים לאזן באינקובטור במשך 30 דקות. בינוני צמיחה בינוני neurobasal המכיל 27 B-2%, פן 1% / סטרפטוקוקוס, 0.5mm-L-גלוטמין ו -20 מיקרוגרם / מ"ל ​​NGF.

ג משניים הידרוג

Puramatrix

1. עבור יישומים העצבית, Puramatrix 1% היא מדוללת על פי הוראות היצרן% 0.15 ב סטרילי H ₂ O שיושלם עם laminin מיקרוגרם / מ"ל 1 מסיסים.
2. התקשורת כל עודף יש להסיר מן החללים PEG, אשר מכילים את explants DRG, בעזרת צמר גפן סטרילי קצה המוליך, Kimwipe, או micropipette.
3. Puramatrix מתווסף חללים PEG עם micropipette על מנת למלא את החלל ללא גדותיו. בהתאם נפח חלל, בדרך כלל ~ 1 μL משמש לכל לבנות.
4. Puramatrix מתחיל תהליך של הרכבה עצמית מיד במגע עם תמיסת מלח פיזיולוגית, כלומר PEG נפוח, אבל 1.5 מ"ל של מדיום גידול נוסף מתחת להכניס את והניח בחממה במשך שעה אחת כדי להבטיח gelation מוחלט.
5. בתחילה, Puramatrix הוא חומצי מעט, כדי לשנות את התקשורת אחרי שעה אחת על מנת לאפשר pH כדי לאזן.
6. שינויים מדיה נדרשים בערך כל 48 שעות. היזהר כי התקשורת היא כלנוסף מתחת להכניס את, על מנת להגן על היושרה של Puramatrix חלש מכנית.

Agarose

1. עבור יישומים העצבית, agarose הוא מדולל לפתרון 1% בטווח הבינוני הצמיחה להציב אמבט מים 60 מעלות צלזיוס עד agarose נמס לגמרי (~ 1 שעות). הפתרון הוא השלים אז עם מיקרוגרם 1 / laminin מסיסים מ"ל.
2. התקשורת כל עודף יש להסיר מן החללים PEG.
3. Agarose מתווסף חללים PEG על מנת למלא את החלל ללא גדותיו. תלוי בנפח של חלל, בדרך כלל ~ 1 μL משמש לכל לבנות.
4. 1.5 מ"ל של מדיום הגידול מראש מצונן (8 ° C) בצלחת 6-היטב, ואת מוסיף agarose המכיל מועברים בתקשורת צונן ומתוחזק במקרר ב 8 מעלות צלזיוס לפחות במשך שלוש דקות כדי לאפשר agarose ג'ל.
5. לבסוף, מוסיף את מועברים 1.5 מ"ל של מדיום מראש חימם צמיחה (37 ° C) ומתוחזק בחממה ב -37 מעלות צלזיוס, עם שינויים התקשורת נדרש כל 48 שעות.

3. Hydrogel Dual 3D תא Encapsulation

אנקפסולציה הידרוג כפול מתאים בעת שימוש כלשהו ג'ל הרכבה עצמית. ג'ל photocrosslinkable, ב PEG במקרה זה, משמשת תמיכה מבנית להצגת הגיאומטרי של ג'ל הרכבה עצמית, למשל Puramatrix או agarose. חלק מהשיטות, במיוחד סוג של ג'ל ובחירת photomask, יהיה תלוי ביישום המבוקש בפרט.

1. טען מסיכת המתאים DMD. עבור יישום קיומנו התא, אנחנו פשוט בחרו מצגת גלילי של Puramatrix לסייע הדמיה של תאים. חוקרים לומדים איתות התא עשוי להיות מעוניין הגיאומטריה compartmental כדי לאפשר דיפוזיה של מולקולות chemotactic. בנוסף, קירוב גס של עורק הוצגה לייצג את היישום ניתן מחקר כלי דם.
2. פנקו את קירות התא להכניס תרבות פוליאסטר עם גשם-X, מקום תחת DMD בשקופית גשם X-מצופה.
3. הוספת 500 μL של המדיום פילמור להכניס את. להשרות crosslinking PEG על ידי חשיפה לאור UV במשך 55 שניות.
4. לשטוף שלוש פעמים עם DPBS סטרילית 1% עט סטרפטוקוקוס.
5. הסר את כל התקשורת העולה מן החללים PEG.
6. ספין למטה תאים בצפיפות הרצויה לתוך גלולה. יש להקפיד להסיר את כל אמצעי מן גלולה התא לפני ערבוב, כמו Puramatrix מתחיל הרכבה עצמית מיד במגע עם תמיסת מלח. להשעות את התאים בתוך Puramatrix 0.15% בדילול מלא סטרילי H ₂ O בתוספת 10% סוכרוז.
7. להזריק את Puramatrix / תא / סוכרוז התערובת בתוך חללים PEG.
8. הוסף 1.5 מ"ל של מדיום הגידול מתחת להכניס את, ולאפשר ג'ל בתוך אינקובטור במשך שעה אחת.
9. שינוי התקשורת לאחר שעה אחת, ו ~ כל 48 שעות לאחר מכן.

4. Hydrogel יחיד 3D תא Encapsulation

אנקפסולציה הידרוג אחד יהיה מתאים לכל מצב שבו תאים ניתן לבדוק בתוך הידרוג photocrosslinkable.

1. טען מסיכת המתאים DMD. עבור מחקרים הישרדות התא, אנחנו שוב בחרה מסכה מעגלי בסיסי כדי לייצג גליל. מסכות דומות לאלו המוצגות שיטה 4 יכול להיות מיושם שוב לשדה המחקר המתאים.
2. התייחס תא פוליאסטר תרבות להכניס עם גשם-X, מקום תחת DMD בשקופית גשם X-מצופה.
3. תאים בריכוז כל הרצוי ניתן להוסיף ישירות לפתרון PEG 10%, מערבבים היטב כדי להבטיח חלוקה הומוגנית.
4. הוספת 500 μL של המדיום פילמור להכניס את. להשרות crosslinking PEG על ידי חשיפה לאור UV במשך 55 שניות.
5. לשטוף שלוש פעמים עם DPBS סטרילית 1% עט סטרפטוקוקוס.
6. בינוני מלא עם צמיחה הן מתחת ומעל להוסיף, לשנות כל ~ 2 ימים.

5. סרט דק Hydrogel פילמור

1. טען מסיכת המתאים DMD.
2. לטפל קולגן מצופה פוליאסטר תא תרבות להכניס עם ה-X גשם, ובמקום בשקופית גשם X-מצופה.
3. הוסף בינוני פילמור מספיק כדי לכסות רק את החלק התחתון של להכניס (~ 250-300 μL עבור 6-מוסיף גם צלחת). אפשר התקשורת לחדור את הממברנה להכניס עבור 30-45 דקות בטמפרטורת החדר.
4. הסר בינוני פילמור עודף להכניס את עם micropipette או Kimwipe. הוספת כמות מספקת של נפט UV שקוף כדי לכסות לחלוטין את תחתית להכניס את. אפשר להכניס את לשבת 15-30 דקות בטמפרטורת החדר, זמן מספיק שמן כדי ליצור שכבה ברורה מעל להרוות פילמור המדיום קרום להוסיף.
5. מניחים את הכנס והחלק תחת DMD. להשרות crosslinking PEG על ידי חשיפה לאור UV. בגלל הרזון של השכבה PEG, crosslinking ניתן להשלים קטנה כמו 15 שניות על 5.0 ואט / ² ס"מ על התקרית DMD.
6. חנות להוסיף צלחת 6-גם בתרבית רקמה. הוסף בינוני צמיחה לתאי מושעה, בריכוז הרצוי טפטפת נפח מספיק של ההשעיה בתוך התא להוסיף את התרבות התא כדי להשיג את צפיפות התאים הרצויים. לאחר מכן, להוסיף בינוני צמיחה מספיק למטה להכניס את לחלוטין לשמור על כדאיות התא (~ 1.5 מ"ל).
7. לאחר 48 שעות חלפו, לשטוף להכניס שלוש פעמים עם DPBS סטרילית 1% עט סטרפטוקוקוס כדי לסלק את כל התאים unadhered. שינוי התקשורת כ 48 שעות כל פעם.

6. נציג תוצאות

דוגמאות הידרוג כפול המכיל בונה explants DRG מוצגות באיור 2. שימו לב כי הגירה הסלולר הרחבה neurite מוגבל לאזור תא מתירנית של הידרוג כפול לבנות. איור 3 מתאר תאים ניתק במארז דומה בתוך המבנים הידרוג כפול. בשל אופייה הדינמי של photomask DMD, הגיאומטריה זמין אנקפסולציה מוגבל רק על ידי הממדים ברזולוציה של אופטיקה. אנקפסולציה Cell היה גם אפשרי בתוך הידרוג photopolymerizable יחיד, PEG, ומבחן חי / מת הכדאיות בוצעה כפי באיור 4. Encapsulation ב PEG נועד רק כדוגמה, כמו PEG אינו מהווה סביבה אידיאלית עבור תאים עצביים. לכן, הכדאיות תא מתממש בונה PEG שלנו נמוכה. לבסוף, דוגמאות של ניצול סרטים PEG דק כשכבת כובל בדוגמת עבור הידבקות התא מוסיף על תרבית תאים מוצגים באיור 5. בנוסף, דוגמאות של התוצאות אפשרי "רע" מוצעות באיור 6.

התוצאות מייצגות רק חלק קטן של השימושים האפשריים של שיטות שפותחו במעבדה שלנו. הם אמורים להדגים, קלות צדדיות ואת הכדאיות של הגישה שלנו, והוא יכול להתייחס אליהם כאל "הוכחה של עקרון" לחוקרים לפתח התאמות אפשרי שלהם.

באיור 1. איור סכמטי של נתיב האור המשמש photolithography. הבלעה: אור אולטרה סגול מאיר את DMD בזווית של 45 מעלות, ו - ° 24 מתחת למטוס של המערך במראה.

איור 2. הצמיחה תווית ושגשוגם של DRG המכיל בונה הידרוג כפול. לספירה) תמונות המתארות polymerized בונה PEG (אפור) עם neurites שכותרתו עם בטא טובולין III (ירוק), גרעינים DAPI תא צבעונית (כחול). Explants DRG הכלולים Puramatrix והוא ממוקם באזורים מעגלי של הדפוס, עם neurites הגוברת כלפי הסתעפות (ים).

איור 3. בונה הידרוג כפול המכיל תאים שכותרתו עם calcein בבוקר, סמן תא חי, לאחר 48 שעות במדיום הגידול. לספירה) צורות PEG שונים, מלא Puramatrix המכיל ניתק נוירונים DRG (~ 5x10 ³ תאים / מ"ל).

איור 4. הידרוג יחיד לבנות המכיל תאים חיים שכותרתו עם Calcein AM (ירוק) ו - תאים מתים שכותרתו עם ethidium homodimer-1 (אדום) לאחר 24 שעות במדיום הגידול (5x10 ³ תאים / מ"ל).

איור 5. PEG Cell מגבילים polymerized כמו סרט דק באמצעות "דפוס מבחן" באופן סלקטיבי תאים לדבוק ניתק את קרום קולגן מצופה של תומך חדיר. A, B) תאים חיים מסומנים לאחר 48 שעות עם Calcein AM (ירוק), ואילו התאים המתים מסומנים עם ethidium homodimer-1 (אדום). הידבקות תא מינימלי מתרחשת באזור המכיל את הסרט PEG דק.

איור 6. תמונות הנציג של תוצאות לא רצויות. א) פילמור חלקית של PEG, המוביל PEG שמיש לבנות. פילמור לא נכון יכול להתרחש בשל נוכחותם של המניסקוס במדיום מראש הפולימר, כמויות מספיקות של המדיום פילמור, חשיפה UV מספיק להתמקד או לא תקין של אופטיקה. ב) תמונה המתארת ​​polymerized בונה PEG (אפור) עם neurites שכותרתו עם בטא טובולין III (ירוק), גרעינים DAPI תא מוכתם (כחול). Neurites הצליחו לגדול מחוץ ערוצי PEG בדוגמת. זה מתרחש לעיתים קרובות במצב זה Puramatrix גולש על גבי החלק PEG במהלך ההזרקה.

Discussion

השיטה המתוארת לעיל יכול לשמש חוקר כל המבקשים פשוטה לשחזור התרבות מערכות התא. תיאורטית, בשל המגוון הרחב של הידרוג photopolymerizable זמין, הסביבה יכולה להיות מותאם כדי לאפשר להשתמש בכל סוג תא, כולל explants רקמה שלמה. בנוסף, מערכת הידרוג כפולה מאפשרת שליטה מרחבית משופרת במצגת של העצמי polymerizing הידרוג, אשר נוטים ליצור צורות אמורפיות בכוחות עצמם. כתוצאה מכך "2.5D" בונה micropatterned הידרוג לספק מטריצה ​​3D לצמיחה עצבית הציג בתצורת 2D, המאפשרת הערכה מיקרוסקופית נוח. המצע שעליו ג'לים polymerized הם יכולים גם להיות מגוונות, ומאפשר שליטה רבה יותר בתכנון הניסוי. השיטות שלנו הן מותאמות לשימוש עם התרבות תומך התא חדיר, כפי שראינו הכדאיות משופרת (איור 4) לעומת פילמור בשקופיות זכוכית (מידע לא מוצג). עם זאת, משטחים פילמור אחרים עשויים לחול יותר עבור יישומים שונים: ייצור על שקופיות הזכוכית המשמשים בניסויים מיקרופלואידיקה או במצטבר תצורות התא, למשל.

הניסיון שלנו עם מערכות אלה תרבות הוביל לזיהוי של אזורים פוטנציאליים של קושי. ראשית, טכניקות זהירות נדרשים כדי לשמור על סטריליות של מבנים. בשל אופייה מגושם של ההתקנה DMD, קשה להפעיל צעדים פילמור בתנאים סטריליים. כדי להתמודד עם בעיה זו, הצעד לשטוף המתואר השיטות מועיל, ואנטיביוטיקה יש להשתמש בתקשורת בכלל. בנוסף, עובי הצורה הסופית של לבנות את polymerized תלויה מאוד על התנהגות נוזלים של תערובת טרום הפולימר, ואת הנוכחות של המניסקוס עלול לגרום בונה ג'ל כי הם רזה מדי או polymerized חלקית (איור 6). שני צעדים שניתן לנקוט כדי לצמצם את היווצרות של המניסקוס הפנימי מוסיף תרבית תאים. עבור הידרוג עבה (> 200 מיקרומטר), ציפוי פשוט של X-Rain סביב הקיר הפנימי של להכניס את די. עם זאת, כפי שתואר בקצרה לעיל, בונה דק (<200 מיקרומטר), שכבת שמן נדרש גם למזער את המניסקוס ולשלול מרווה חמצן פילמור של הרדיקלים החופשיים. החלטה נמצא כי תלוי בעובי, עם ירידה בגודל תכונת הבינה עם ג'ל סמיך יותר ויותר. ההחלטה מגוונות גם תלוי אם התכונה ייצג הקלה חיובי או שלילי הידרוג. עם זאת, השגנו החלטה די בונה עם גדלים תכונה מינימום בקנה מידה של ~ 100 מיקרומטר באמצעות מיקרוסקופ מטרות רק התמקדות אופטיקה.

הניסויים שלנו הראו כי בונה הידרוג כפול המתואר כאן מהווים בסיס מצוין ליצירת חוץ גופית הדגמים הבסיסיים של צמיחה הדרכה neurite ו. הטכניקה micropatterning המועסקים הוא עיבוד של השיטות הקיימות ^18,19, אך הגדרת שלנו הדגיש פשוט ליישם העיצוב היה מותאם במיוחד הייצור של בונה הידרוג כפול מוסיף על התרבות התא; תרבות מוסיף התא היו חיוניים לשיפור כדאיות התא, כמו גם כמו crosslinking סביב explants רקמות חסיד בעבר. היקף התוצאות הראו מוגבל על ידי האינטרסים של המעבדה שלנו, אולם אנו מאמינים כי שיטות המתוארים בפרסום זה יוכיח שימושי החוקרים מחפשים שיטה, זול יחסית, מהיר וקל לשימוש עבור ייצור של תרבית תאים 3D מודלים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Digital Micromirror Device	Texas Instruments	DLPD4X00KIT
Collagen Coated Transwell Permeable Support	Corning	3491	Also referred to as Cell Culture Insert in manuscript
Polyester Transwell Permable Support	Corning	3412	Also referred to as Cell Culture Insert in manuscript
Neurobasal Medium	Invitrogen	21103-049
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	16000-036
L-glutamine	Invitrogen	25030-164
Nerve Growth Factor	Invitrogen	13257-019
Pen/Strep	Invitrogen	15140-122
B-27 Supplement	Invitrogen	17504-044
DPBS	Invitrogen	14190-250
Puramatrix	BD Biosciences	354250
PEG 1000	Polysciences, Inc.	15178
Irgacure 2959	Ciba Specialty Chemicals	0298913AB
Oil	Have used both canola oil and silicon oil		Needs to be UV transparent, and minimize +/- meniscus formation
OmniCure Series 1000	EXFO
Rain-X