Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

iCLIP - транскриптома всей карты белка-РНК взаимодействия с отдельными нуклеотидных Резолюцию

Published: April 30, 2011 doi: 10.3791/2638
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 1, 3, 4, 2, 1
1Laboratory of Molecular Biology, Medical Research Council - MRC, 2European Bioinformatics Institute, EMBL Heidelberg, 3Computer and Information Science, University of Ljubljana, 4Wellcome Trust Genome Campus, Wellcome Trust Sanger Institute

ERRATUM NOTICE

Summary

Пространственное расположение РНК-связывающими белками на стенограммы ключевым фактором, определяющим пост-транскрипционной регуляции. Поэтому мы разработали индивидуальный нуклеотидов разрешение сшивание УФ и иммунопреципитации (iCLIP), что позволяет точно генома отображение сайтов связывания РНК-связывающий белок.

Abstract

Уникальный состав и пространственное расположение РНК-связывающими белками (ОДП) на стенограмму руководство различные аспекты пост-транскрипционной регуляции 1. Таким образом, важным шагом на пути к пониманию стенограмму регулирования на молекулярном уровне является получение информации о положении на местах связывания ОДП 2.

Белково-РНК взаимодействия могут быть изучены с помощью биохимических методов, но эти подходы не решают связывание РНК в его родной сотовой связи. Первые попытки изучения белка-РНК комплексов в их клеточной среде занятых очисткой близость или иммунопреципитации комбинированные с дисплеем дифференциальных или микрочипов анализа (RIP-CHIP) 3-5. Эти подходы были склонны к определению косвенного или не-физиологических взаимодействий 6. В целях повышения специфичности и позиционные резолюцию, стратегия называется CLIP (УФ сшивания и иммунопреципитации) был введен 7,8. CLIP сочетает УФ сшивки белков и молекул РНК со строгой схемы очистки, включая денатурирующих электрофореза в полиакриламидном геле. В сочетании с высокой пропускной способностью технологии секвенирования, CLIP доказала, как мощный инструмент для изучения белок-РНК взаимодействий на геном масштабе (именуемые HITS-CLIP или CLIP-далее) 9,10. В последнее время PAR-CLIP была введена который использует фотореакционноспособных аналогов рибонуклеозид для сшивания 11,12.

Несмотря на высокую специфичность полученных данных, CLIP эксперименты часто генерируют библиотек кДНК ограниченной сложности последовательности. Отчасти это связано с ограниченным количеством совместно очищенной РНК и два неэффективных лигирования РНК реакций, необходимых для подготовки библиотеки. Кроме того, анализы удлинения праймера показали, что многие кДНК усечение преждевременно в сшитый нуклеотидных 13. Такие усеченные кДНК теряются во время стандартного протокола библиотеки подготовки CLIP. Недавно мы разработали iCLIP (индивидуальные нуклеотидов разрешение CLIP), которая захватывает усеченной кДНК путем замены одного из неэффективных шагов межмолекулярного лигирования РНК с более эффективным внутримолекулярной кДНК рассылке (рис. 1) 14. Важно отметить, что секвенирование кДНК усеченной дает представление о положении перекрестные ссылки на сайт нуклеотидных разрешения. Мы успешно применяются для изучения iCLIP hnRNP С частица организации по геному масштабе и оценить ее роль в регуляции сплайсинга 14.

Protocol

1. УФ сшивания тканей культуре клеток

  1. Выньте материал и добавить 6 мл ледяной PBS для клеток, выращенных в 10 см плита (достаточно для трех экспериментов).
  2. Удалите крышку и поставьте на лед. Радиация сразу с 150 мДж / см 2 при 254 нм.
  3. Урожай клетки путем соскабливания с сотовым Колмар.
  4. Передача 2 мл клеточной суспензии для каждой из трех пробирок. Спиновые на максимальной скорости в течение 10 сек при 4 ° С для осаждения клеток, затем удалите супернатант.
  5. Snap-заморозить ячейки гранул на сухом льду и хранить при температуре -80 ° С до использования.

2. Бусы подготовки

  1. Добавить 100 мкл белка Dynabeads (Dynal, 100,02) в эксперименте по свежим микропробирок (Используйте белка G Dynabeads для мыши или козьего антитела).
  2. Вымойте бисером 2x с лизирующего буфера (50 мМ Трис-HCl, рН 7,4, 100 мМ NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS, 0,5% натрия дезоксихолата; 1 / 100 ингибитор протеазы коктейль III, Calbiochem).
  3. Ресуспендируют бисером в 100 мкл буфера для лизиса с 2-10 мкг антител.
  4. Поворот трубы при комнатной температуре в течение 30-60 мин.
  5. Вымойте 3x с 900 мкл буфера для лизиса и оставить в последние мыть пока готов перейти к шагу 4.1.

3. Лизису клеток и частичного расщепления РНК

  1. Ресуспендируют осадок клеток в 1 мл буфера для лизиса и передачи до 1,5 мл пробирок.
  2. Подготовка 1 / 500 разбавление РНКазы I (Амбион, AM2295). Добавьте 10 мкл РНКазы я разведения, а также 2 мкл Turbo ДНКазы для Клеточный лизат (1 / 500 РНКазы я разведения [с низким РНКазы] используются для подготовки библиотеки; 1 / 50 разведений [высокая РНКазы] являются необходимыми для осуществления контроля на наличие антител специфичность) .
  3. Инкубируйте образцы ровно 3 мин при 37 ° С, качая на 1100 оборотах в минуту. Сразу же передачи в лед.
  4. Спиновые при 4 ° С и 22 000 г в течение 20 минут, чтобы очистить лизат. Осторожно собрать супернатант (оставьте примерно 50 мкл лизата с гранул).

4. Иммунопреципитация

  1. Удалите промывочный буфер из бисера (с шагом 2,5), затем добавить Клеточный лизат (с шагом 3,4).
  2. Поворот образцов в течение 2 ч при 4 ° C.
  3. Удалите супернатант и мыть бисером 2x с 900 мкл высокого соль буфера (50 мМ Трис-HCl, рН 7,4, 1 М NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1% NP-40, 0,1% SDS, 0,5% натрия дезоксихолата).
  4. Вымойте 2x с 900 мкл промывочного буфера (20 мМ Трис-HCl, рН 7,4, 10 мМ MgCl 2, 0,2% Твин-20).

5. Дефосфорилирования РНК 3'ends

  1. Удалите супернатант и ресуспендируйте бисером в 20 мкл смеси PNK (15 мкл воды, 4 мкл 5x рН 6,5 PNK буфера [350mMTris-HCl, рН 6,5; 50mMMgCl 2 25mMdithiothreitol]; 0,5 мкл фермента ПНК; 0,5 мкл RNasin [Promega]).
  2. Инкубируйте в течение 20 минут при температуре 37 ° C.
  3. Добавить 500 мкл промывочного буфера и мыть 1x с высокой соли буфера.
  4. Вымойте 2x промывочным буфером.

6. Компоновщик лигирования РНК 3 'концах

  1. Осторожно удалите супернатант и ресуспендируйте бисером в 20 мкл смеси лигирования (9 мкл воды, 4 мкл 4х буфер лигирования [200 mMTris-HCl, 40 ММ GCL 2, 40 мМ дитиотреитол]; 1 мкл РНК-лигазы [NEB]; 0,5 мкл RNasin [Promega]; 1,5 мкл предварительно adenylated линкера L3 [20 мкМ]; 4 мкл PEG400 [81170, Sigma]).
  2. Выдержите в течение ночи при 16 ° С.
  3. Добавить 500 мкл промывочного буфера и затем промыть 2 раза с 1 мл высокого соль буфера.
  4. Вымойте 2x с 1 мл промывочного буфера и оставить в 1 мл второй стирки.

7. Конец РНК 5 'маркировки

  1. Удалить супернатант и ресуспендируйте бусины 8 мкл горячей смеси PNK (0,4 мкл PNK [NEB]; 0,8 мкл 32 Р-γ-АТФ; 0,8 мкл 10х буфера PNK [NEB]; 6 мкл воды).
  2. Инкубировать в течение 5 мин при 37 ° C.
  3. Удалить горячей смеси ПНК и ресуспендируйте бисером в 20 мкл Nupage 1x загрузки буфера (Invitrogen).
  4. Инкубировать на thermomixer при 70 ° С в течение 10 мин.
  5. Сразу же место на магнит для осаждения пустой бисером и нагрузки супернатант на геле (см. шаг 8).

8. SDS-PAGE и мембранных передачи

  1. Нагрузка образцов на 4-12% NuPAGE Bis-Tris гель (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя. Используйте 0,5 л 1x MOPS работает буфер (Invitrogen). Кроме того, нагрузка 5 мкл предварительно окрашенные белки размер маркера (например СТРАНИЦА правителя плюс, Fermentas, SM1811).
  2. Выполнить геля в течение 50 минут при 180 В.
  3. Удаление геля перед и отбросить, как твердые отходы (содержит свободные радиоактивные АТФ).
  4. Передача белка-РНК комплексов из геля на нитроцеллюлозные мембраны использованием Novex мокрых аппаратов передачи в соответствии с инструкциями производителя (Invitrogen, передача 1 ч при 30 В).
  5. После передачи, промойте мембрану в буфере PBS, затем заверните его в Саран пленку и подвергать его фильм Fuji при -80 ° C (место флуоресцентные наклейки рядом с мембраной позже выровнять тОн пленкой и мембраной; выполнять экспозиции в течение 30 мин, 1 час и в течение ночи).

9. РНК изоляции

  1. Изолят белка-РНК комплексов из низких РНКазы эксперимент с использованием авторадиограмма с шагом 8.5, как маска. Вырезать этот кусок мембраны на несколько маленьких кусочков и положите их в 1,5 мл микропробирок.
  2. Добавьте 200 мкл буфера для ПК (100 мМ Трис-HCl, рН 7,4, 50 мМ NaCl, 10 мМ ЭДТА) и 10 мкл протеиназы К (Roche, +03115828001), чтобы мембрана штук. Инкубируйте встряхивании при 1100 оборотов в минуту в течение 20 мин при 37 ° C.
  3. Добавить 200 мкл PKurea буфера (100 мМ Трис-HCl, рН 7,4, 50 мМ NaCl, 10 мМ ЭДТА, 7 M мочевины) и инкубировать в течение 20 мин при 37 ° C.
  4. Сбор решение и добавить его вместе с 400 мкл РНК фенол / хлороформ (Амбион, 9722) до 2 мл ФАПЧ Гель Тяжелые трубы (713-2536, VWR).
  5. Инкубировать в течение 5 мин при 30 ° С, качая на 1100 оборотах в минуту. Отдельные фазы, крутя в течение 5 мин при 13000 оборотов в минуту при комнатной температуре.
  6. Передача водный слой в новую трубу (будьте осторожны, не прикасайтесь к гель с пипеткой). Добавить 0,5 мкл glycoblue (Амбион, 9510) и 40 мкл 3 М ацетата натрия рН 5,5 и перемешать. Затем добавить 1 мл 100% этанола, снова перемешать и выпадают в осадок в течение ночи при температуре -20 ° C.

10. Обратная транскрипция

  1. Спиновые течение 20 мин при 15000 оборотах в минуту и ​​4 ° C. Удалить супернатант и мыть гранул с 0,5 мл 80% этанола.
  2. Ресуспендируют пеллет в 7,25 мкл РНК / грунтовки смеси (6,25 мкл воды, 0,5 мкл праймера Rclip [0.5pmol/μl]; 0,5 мкл дНТФ смеси [10 мМ]). Для каждого эксперимента или тиражировать, использовать различные грунтовки Rclip содержащие отдельные последовательности штрих-кодов (см. 14).
  3. Инкубировать в течение 5 мин при 70 ° С до охлаждения до 25 ° C.
  4. Добавить 2,75 мкл RT смесь (2 мкл 5х буфера РТ; 0,5 мкл 0,1 М ДТТ; 0,25 мкл Надстрочный III обратной транскриптазы [Invitrogen]).
  5. Инкубировать 5 мин при 25 ° C, 20 мин при 42 ° С, 40 мин при 50 ° С и 5 мин при 80 ° C до охлаждения до 4 ° C.
  6. Добавить 90 мкл ТЕ-буфера, 0,5 мкл glycoblue и 10 мкл раствора ацетата натрия рН 5,5 и перемешать. Затем добавьте 250 мкл 100% этанола, снова перемешать и выпадают в осадок в течение ночи при температуре -20 ° C.

11. Гель очистки кДНК

  1. Спином вниз и мыть образцов (см. 10.1), то ресуспендирования гранул в 6 мкл воды.
  2. Добавить 6 мкл 2x КЭ-мочевины загрузки буфера (Invitrogen). Тепло образцов до 80 ° С в течение 3 мин непосредственно перед загрузкой.
  3. Нагрузка на образцы сборных 6% КЭ-мочевины гель (Invitrogen) и запустить в течение 40 мин при 180 В, как описано производителем. Кроме того, нагрузка низкой маркер молекулярного веса для последующей резки (см. ниже).
  4. Отрежьте три полосы при 120-200 нт (высокий), 85-120 нт (средний) и 70-85 нт (низкий). Используйте theupper красителя и следы на пластиковых поддержку гель для руководства иссечение (см. Рисунок 3). Обратите внимание, что грунтовка Rclip и последовательность L3 в совокупности приходится 52 нт из CLIP последовательности.
  5. Добавить 400 мкл ТЕ-и раздавить геля на мелкие части, используя 1 мл шприца. Инкубируйте встряхивании при 1100 оборотов в минуту в течение 2 ч при 37 ° C.
  6. Поместите два 1 см стекло предварительные фильтры (Whatman, 1823010) в колонке Costar SpinX (Corning Incorporated, 8161). Передача жидкой части образца к колонке. Спиновые в течение 1 мин при 13000 оборотов в минуту в 1,5 мл трубки.
  7. Добавить 0,5 мкл glycoblue и 40 мкл раствора ацетата натрия рН 5,5, затем смешайте образца. Добавьте 1 мл 100% этанола, снова перемешать и выпадают в осадок в течение ночи при температуре -20 ° C.

12. Лигирование грунтовке 5'end из кДНК

  1. Спином вниз и мыть образцов (см. 10.1), то ресуспендирования гранул в 8 мкл смеси лигирования (6,5 мкл воды, 0,8 мкл 10х буфера CircLigase II, 0,4 мкл 50 мМ MnCl 2; 0,3 мкл; Circligase II [Эпицентр]) и инкубировать в течение 1 часа при температуре 60 ° C.
  2. Добавить 30 мкл олиго отжига смеси (26 мкл воды, 3 мкл буфера FastDigest [Fermentas]; 1 мкл cut_oligo [10 мкМ]). Инкубируйте в течение 1 мин при 95 ° C. Затем уменьшите температуру каждые 20 сек на 1 ° С до 25 ° С были достигнуты.
  3. Добавить 2 мкл BamHI (Fast Fermentas) и инкубировать 30 минут при температуре 37 ° C.
  4. Добавить 50 мкл ТЕ-и 0,5 мкл glycoblue и перемешать. Добавьте 10 мкл рН раствора ацетата натрия 5,5 и перемешать, затем добавить 250 мкл 100% этанола. Смешайте снова и осадок в течение ночи при температуре -20 ° C.

13. ПЦР-амплификации

  1. Спином вниз и мыть образцов (см. 10.1), то ресуспендирования гранул в 19 мкл воды.
  2. Подготовьте смесь ПЦР (19 мкл кДНК; 1 мкл смеси грунтовка P5/P3 solexa, 10 мкм каждая, 20 мкл Accuprime Supermix 1 фермента [Invitrogen]).
  3. Выполните следующую программу ПЦР: 94 ° С в течение 2 мин, [94 ° С в течение 15 сек, 65 ° С в течение 30 сек, 68 ° С в течение 30 сек] 25-35 циклов, 68 ° С в течение 3 мин, 4 ° C навсегда.
  4. Смешать 8 мкл продукта ПЦР с 2 мкл 5х буфера загрузки КЭ и нагрузки на сборные 6% гель КЭ (InvitРоген). Пятно гель с Sybrgreen I (Invitrogen) и проанализировать с помощью геля тепловизор.
  5. Штрих-код в Rclip грунтовки позволяют мультиплекс различных образцов, прежде чем представить на высокой пропускной последовательности. Отправить 15 мкл библиотеки для секвенирования и хранить покой.

14. Компоновщика и грунтовки последовательностей

Компоновщик Предварительно adenylated 3 'ДНК:

[Мы заказываем ДНК адаптер от IDT, а затем сделать аликвоты 20 мкм.]

ДНК

15. Представитель Результаты:

До секвенирование библиотеки iCLIP, успех эксперимента может осуществляться на два этапа: авторадиограмма белка-РНК комплекса после мембраны передачи (шаг 8.5) и гель образ продуктов ПЦР (шаг 13.4). В авторадиограмма низко-РНКазы образцы, диффузный радиоактивности следует рассматривать выше молекулярная масса белка (рис. 2, пример 4). Для получения высокого РНКазы образцов, эта радиоактивность сосредоточена ближе к молекулярным весом белка (рис. 2, образец 3). При отсутствии антител используется в иммунопреципитации, сигнал не должен быть обнаружен (рис. 2, образцов 1 и 2). Другие важные элементы управления для специфики иммунопреципитации либо опустить УФ-облучения или использование клеток, которые не выражают белок 14.

Гель образ продуктов ПЦР (шаг 13.4) должны показать диапазон размеров, который соответствует кДНК фракции (высокая, средняя или низкая) очищали в шаге 11,4 (рис. 4, дорожки 4-6). Обратите внимание, что ПЦР праймеры P3Solexa и P5Solexa ввести дополнительные 76 нт, чтобы размер кДНК. При отсутствии антител используется при иммунопреципитации, не соответствующих продуктов ПЦР должен быть обнаружен (рис. 4, дорожки 1-3). Продукт Primer димера может появиться около 140 нт.

Для представителя результаты высокой пропускной последовательности и последующее биоинформатики анализов см. 14.

Рисунок 1
Рисунок 1. Схематическое изображение протокол iCLIP. Белково-РНК комплексов ковалентно сшитых в естественных условиях с помощью УФ облучения (шаг 1). Белок очищается вместе со связанными РНК (шаги 2-5). Для обеспечения последовательности конкретных грунтования обратной транскрипции, адаптер РНК лигируют с 3 'конца РНК, в то время как 5' конец радиоактивно меченый (шаги 6 и 7). Сшитые белка-РНК комплексы очищают от свободной РНК с помощью SDS-PAGE и мембранных передачи (шаг 8). РНК выделяют из мембраны путем переваривания белка с протеиназы К оставляя полипептид, остающейся в поперечной связи нуклеотида (шаг 9). Обратной транскрипции (RT) усекает на остальных полипептида и вводит два расщепляемого регионах адаптер и штрих-код последовательностями (шаг 10). Размер выбора удаляет свободные грунтовки РТ до рассылке. Следующие линеаризации генерирует подходящие шаблоны для ПЦР (шаги 11-15). Наконец, высокой пропускной последовательности генерирует читает, в котором штрих-код последовательности сразу после последнего нуклеотида кДНК (шаг 16). Так как это нуклеотидных находит одну позицию вверх по течению от сшитого нуклеотид, сайт связывания может быть выведена с высоким разрешением.

Рисунок 2
Рисунок 2. Авторадиограмма сшитого hnRNP C-РНК комплексов с использованием денатурирующих гель-электрофореза и мембранных передачи. hnRNP C-РНК комплексов иммуно-очищается от клеточных экстрактов использованием антител против hnRNP C (α hnRNP С, образцы 3 и 4). РНК частично переваренной использования низких (+) или высокого (+ +) концентрация РНКазы. Комплексы сдвиг вверх от размера белка (40 кДа) можно наблюдать (образец 4). Сдвиг менее выраженным, когда высокие концентрации РНКазы были использованы (образец 3). Радиоактивный сигнал исчезает, когда нет антител был использован в иммунопреципитации (образцы 1 и 2).

Рисунок 3
Рисунок 3. Схема 6% КЭ-мочевины гель (Invitrogen) для руководства иссечение iCLIP кДНК продукции. Гель работать в течение 40 мин при 180 В, ведущих к воспроизводимой картины миграции кДНК и красителей (светло и темно-синий) в гель. Используйте лезвие, чтобы сократить (красная линия) высокой (H), средний (M), и низкого (L) кДНК фракций. Для начала резки в середине голубой краситель и непосредственно над отпечаток на пластиковые кассеты геля. Разделите средних и низких фракций и отделка высокой долей около 1 см выше голубой краситель. Используйте вертикальные разрезы руководствоваться карманы и красителей для разделения различных полос (в данном примере 1-4). Маркер полосы (м) могут быть окрашены и отображаемого для контроляразмеров после резки. Фрагмент размеры указаны справа.

Рисунок 4
Рисунок 4. Анализ ПЦР-усиливается iCLIP кДНК библиотек с использованием гель-электрофореза. РНК оправился от мембраны (рис. 1) была обратной транскрипции и размер-очищали с использованием денатурирующих гель-электрофореза (рис. 2). Три размера доли кДНК (высокий [H]: 120-200 NT, среды [M]: 85-120 нт и низкой [L]: 70-85 нт) были восстановлены, circularized, повторно линеаризованной и ПЦР-усиливаются. ПЦР-продукты разных размер дистрибутива можно наблюдать в результате различных размеров входного фракций. Так как грунтовка ПЦР вводит 76 нт к кДНК, размеры должны составлять от 196-276 нт для высоких, 161-196 нт для средних и 146-161 нт для низких фракций размера. ПЦР-продукты отсутствуют при отсутствии антител был использован для иммунопреципитации (полосы 1-3).

Discussion

С iCLIP протокол содержит широкий спектр ферментативных реакций и стадии очистки, это не всегда легко определить проблемы, когда эксперимент не удается. В целях контроля за специфичности выявленных РНК перекрестные ссылки сайтов, один или несколько отрицательных контролей следует поддерживать в течение полного опыта и последующего вычислительного анализа. Эти элементы управления могут быть не-антитело образца, не-сшитого клеток, или иммунопреципитации из нокаутом клеток или тканей. В идеале, эти контрольные опыты не должны очистить любой белок-РНК комплексов, и поэтому должны подавать сигнал на SDS-PAGE гель, и не обнаружить продукты после ПЦР. Высокая пропускная способность последовательности этих управляющих библиотеки должны вернуться немногих уникальных последовательностей. Нокдаун клетки не рекомендуется, поскольку последовательное управление, так как в результате последовательности все еще соответствуют перекрестные ссылки сайтов одного и того же белка, который очищается от нокдауна клеток в меньших количествах.

Меры предосторожности должны быть приняты, чтобы избежать загрязнения продуктов ПЦР из предыдущих экспериментов. Лучший способ минимизации этой проблемы заключается в пространственно разделенных пред-и пост-ПЦР шагов. В идеале, анализ продуктов ПЦР и все последующие шаги должны выполняться в отдельной комнате. Более того, каждый член лаборатория должна использовать свой собственный набор буферов и других реагентов. Таким образом, источники загрязнения может быть легче идентифицировать.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Авторы выражают благодарность всем членам Уле, Ласкомб и Зупан лабораторий для обсуждения и экспериментальной помощи. Мы благодарим Джеймс Хэдфилд и Ник Мэтьюз для высокопроизводительного секвенирования. Мы хотели бы отметить, что метод iCLIP описанные здесь разделяет несколько шагов с оригинального протокола CLIP, разработанный Кирк Йенсен и JU в лаборатории Роберт Дарнелл. Работа выполнена при поддержке Европейского исследовательского совета грант 206726-CLIP для JU и долгосрочных гуманитарных наук границ программы стипендий для JK

Materials

Name Company Catalog Number Comments
For gel electrophoresis and membrane transfer we recommend t he use of XCell SureLock® Mini-Cell and XCell IIâ Blot Module Kit CE Mark (Invitrogen, EI0002), which is compatible with the use of the different precast minigels that are specified throughout the protocol. The brand and order number of all materials used is mentioned during the protocol. The list of enzymes used in the protocol is shown in the table below.
Protein A Dynabeads Invitrogen 10001D use protein G for mouse or goat antibody
RNase I Ambion AM2295 activity can change from batch to batch
T4 RNA ligase I New England Biolabs M0204S
PNK New England Biolabs M0201S
proteinase K Roche Group 03115828001
Superscript III reverse transcriptase Invitrogen 18080044
Circligase II Epicentre Biotechnologies CL9021K
FastDigest® BamHI Fermentas FD0054
AccuPrime™ SuperMix I Invitrogen 12342010 this PCR mix gives the best results in our hands

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Keene, J. D. RNA regulons: coordination of post-transcriptional events. Nat Rev Genet. 8, 533-543 (2007).
  2. Wang, Z., Burge, C. B. Splicing regulation: from a parts list of regulatory elements to an integrated splicing code. RNA. 14, 802-813 (2008).
  3. Trifillis, P., Day, N., Kiledjian, M. Finding the right RNA: identification of cellular mRNA substrates for RNA-binding proteins. RNA. 5, 1071-1082 (1999).
  4. Brooks, S. A., Rigby, W. F. Characterization of the mRNA ligands bound by the RNA binding protein hnRNP A2 utilizing a novel in vivo technique. Nucleic Acids Res. 28, E49-E49 (2000).
  5. Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Lager, P. J., Keene, J. D. Identifying mRNA subsets in messenger ribonucleoprotein complexes by using cDNA arrays. Proc Natl Acad Sci. 97, 14085-14090 (2000).
  6. Mili, S., Steitz, J. A. Evidence for reassociation of RNA-binding proteins after cell lysis: implications for the interpretation of immunoprecipitation analyses. RNA. 10, 1692-1694 (2004).
  7. Ule, J. CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain. Science. 302, 1212-1215 (2003).
  8. Ule, J., Jensen, K., Mele, A., Darnell, R. B. CLIP: A method for identifying protein-RNA interaction sites in living cells. Methods. 37, 376-386 (2005).
  9. Licatalosi, D. D. HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing. Nature. 456, 464-469 (2008).
  10. Yeo, G. W. An RNA code for the FOX2 splicing regulator revealed by mapping RNA-protein interactions in stem cells. Nat Struct Mol Biol. 16, 130-137 (2009).
  11. Urlaub, H., Hartmuth, K., Lührmann, R. A two-tracked approach to analyze RNA-protein crosslinking sites in native, nonlabeled small nuclear ribonucleoprotein particles. Methods. 26, 170-181 (2002).
  12. König, J. iCLIP reveals the function of hnRNP particles in splicing at individual nucleotide resolution. Nat Struct Mol Biol. 17, 909-915 (2010).

Tags

Клеточной биологии выпуск 50 РНК биохимия транскриптом системная биология РНК-связывающий белок

Erratum

Formal Correction: Erratum: iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution
Posted by JoVE Editors on 07/14/2011. Citeable Link.

A correction was made to iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution. There was an error in part 2 of step 3. One of the characters had the incorrect symbol and was corrected to:

"...as well as 2 μl Turbo DNase..."

instead of:

"...as well as 2 ml Turbo DNase..."

iCLIP - транскриптома всей карты белка-РНК взаимодействия с отдельными нуклеотидных Резолюцию
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Konig, J., Zarnack, K., Rot, G.,… More

Konig, J., Zarnack, K., Rot, G., Curk, T., Kayikci, M., Zupan, B., Turner, D. J., Luscombe, N. M., Ule, J. iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution. J. Vis. Exp. (50), e2638, doi:10.3791/2638 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter