iClip - transcriptome à l'échelle de cartographie des protéines-ARN Interactions avec résolution nucléotides individuels

Summary

L'arrangement spatial des protéines liant l'ARN sur une transcription est un déterminant clé de la régulation post-transcriptionnelle. Par conséquent, nous avons développé différents nucléotides réticulation UV résolution et immunoprécipitation (iClip) qui permet précisément l'échelle du génome de cartographie des sites de liaison d'une protéine liant l'ARN.

Abstract

La composition unique et la disposition spatiale des protéines liant l'ARN (pratiques commerciales restrictives) sur une transcription guider les divers aspects de la régulation post-transcriptionnelle ^1. Par conséquent, une étape essentielle vers la compréhension règlement transcription au niveau moléculaire est d'obtenir des informations de position sur les sites de liaison des pratiques commerciales restrictives ^2.

Interactions protéines-ARN peut être étudiée par des méthodes biochimiques, mais ces approches ne tiennent pas compte liaison à l'ARN dans son contexte cellulaire native. Les premières tentatives pour étudier des protéines-ARN complexes dans leur environnement cellulaire employée purification par affinité ou immunoprécipitation combinée avec l'affichage différentiel ou de l'analyse des microréseaux (RIP-CHIP) ^3-5. Ces approches ont été enclins à identifier les interactions indirectes ou non physiologiques ^6. Afin d'accroître la spécificité et la résolution de position, une stratégie appelée CLIP (UV réticulation et immunoprécipitation) a été introduit ^7,8. CLIP combine réticulation UV des protéines et des molécules d'ARN avec des schémas de purification rigoureux, y compris l'électrophorèse en gel de polyacrylamide dénaturant. En combinaison avec les technologies de séquençage à haut débit, CLIP a prouvé qu'il était un outil puissant pour étudier les interactions protéines-ARN à l'échelle du génome entier (dénommé HITS-CLIP ou CLIP-seq) ^9,10. Récemment, PAR-CLIP a été introduit qui utilise des analogues ribonucléoside photoréactif pour la réticulation ^11,12.

Malgré la grande spécificité des données obtenues, des expériences CLIP génèrent souvent des banques d'ADNc de la complexité de séquence limitée. Ceci est partiellement dû à la quantité limitée de co-ARN purifié et les deux inefficaces réactions de ligature ARN nécessaires à la préparation de la bibliothèque. En outre, les analyses d'extension d'amorces ont indiqué que de nombreux ADNc tronquent prématurément à l'réticulé ¹³ nucléotides. Ces ADNc tronqués sont perdus pendant le protocole de préparation CLIP bibliothèque standard. Nous avons récemment développé iClip (CLIP résolution individuelle de nucléotides), qui capte l'ADNc tronqués en remplaçant l'une des étapes intermoléculaires inefficaces ligature d'ARN avec une circularisation plus efficace ADNc intramoléculaire (figure 1) ^14. Surtout, le séquençage des ADNc tronqués fournit un aperçu de la position du site de liaison croisée avec une résolution de nucléotides. Nous appliquée avec succès pour étudier l'organisation iClip hnRNP particules C sur une échelle du génome entier et d'évaluer son rôle dans la régulation ¹⁴ d'épissage.

Protocol

1. UV réticulation des cellules de culture tissulaire

1. Retirez le papier et ajouter 6 ml PBS glacé aux cellules cultivées dans une plaque de 10 cm (pour trois expériences).
2. Retirer le couvercle et placer sur la glace. Irradier une fois avec 150 mJ / cm ² à 254 nm.
3. Récolter les cellules en grattant avec un lifter cellule.
4. Transfert 2 ml de suspension cellulaire à chacun des trois microtubes. Spin à toute vitesse pendant 10 secondes à 4 ° C pour sédimenter les cellules, puis retirer le surnageant.
5. Snap-geler les culots cellulaires sur la glace sèche et conserver à -80 ° C jusqu'à utilisation.

2. La préparation de billes

1. Ajouter 100 ul de la protéine A Dynabeads (Dynal, 100,02) par expérience pour un microtube frais (Utilisez la protéine G Dynabeads pour une souris ou d'anticorps de chèvre).
2. Lavez perles 2x avec un tampon de lyse (50 mM Tris-HCI, pH 7,4, 100 mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS; désoxycholate de sodium à 0,5%; 1 / 100 inhibiteur de protéase cocktail III, Calbiochem).
3. Remettre les billes dans 100 ul de tampon de lyse avec 2-10 anticorps ug.
4. Rotation des tubes à température ambiante pendant 30-60 min.
5. Laver 3x avec 900 ul de tampon de lyse et laisser dans le dernier lavage avant d'être prêt à passer à l'étape 4.1.

3. Lyse cellulaire et digestion partielle ARN

1. Reprendre le culot cellulaire dans du tampon de lyse 1 ml et transférer à microtubes de 1,5 ml.
2. Préparer une dilution 1 / 500 de la RNase I (Ambion, AM2295). Ajouter 10 ul RNase I dilution ainsi que 2 pl Turbo DNase au lysat cellulaire (1 / 500 RNase dilutions I [faible RNase] sont utilisées pour la préparation de la bibliothèque; 1 / 50 dilutions [haute RNase] sont nécessaires pour contrôler la spécificité des anticorps) .
3. Incuber les échantillons pendant exactement 3 minutes à 37 ° C, en agitant à 1100 rpm. Immédiatement transfert à glace.
4. Centrifuger à 4 ° C et 22 000 g pendant 20 min pour effacer le lysat. Recueillir soigneusement le surnageant (laisser environ 50 ul de lysat avec le culot).

4. Immunoprécipitation

1. Retirez le tampon de lavage des billes (de l'étape 2.5), puis ajouter le lysat cellulaire (de l'étape 3.4).
2. Tournez les échantillons pendant 2 h à 4 ° C.
3. Jeter le surnageant et laver les billes de 2x avec 900 pi de haut-sel tampon (50 mM Tris-HCI, pH 7,4, 1 M de NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 0,1% SDS, 0,5% de désoxycholate).
4. Laver 2x avec 900 ul de tampon de lavage (20 mM Tris-HCI, pH 7,4, 10 mM MgCl _2, 0,2% de Tween-20).

5. La déphosphorylation des extrémités 3 'ARN

1. Jeter le surnageant et remettre les billes en 20 PNK mélangez ul (15 ul d'eau; 4 pl pH 6,5 5x PNK buffer [350mMTris-HCl, pH 6,5; 50mMMgCl ₂ 25mMdithiothreitol]; 0,5 ul enzyme PNK; 0,5 ul RNasine [Promega]).
2. Incuber pendant 20 min à 37 ° C.
3. Ajouter 500 ul de tampon de lavage et laver 1x avec forte teneur en sel tampon.
4. Laver 2x avec un tampon de lavage.

6. Ligature Linker à l'ARN extrémités 3 '

1. Retirez délicatement le surnageant et remettre les billes en 20 mélange de ligature ul (9 ul d'eau, 4 pi de tampon ligature 4x [200 mMTris-HCl; MM 40m GCL _2; 40 mM de dithiothréitol]; 1 pl ARN ligase [ONE]; 0,5 RNasine ul [Promega]; 1,5 ul pré-adenylated linker L3 [20 uM]; 4 pl PEG400 [81170, Sigma]).
2. Incuber une nuit à 16 ° C.
3. Ajouter 500 ul de tampon de lavage, puis lavez 2x avec 1 ml de haute sel tampon.
4. Laver 2x avec 1 ml de tampon de lavage et laisser dans 1 ml de la deuxième lavage.

7. Étiquetage fin ARN 5 '

1. Retirer le surnageant et remettre les billes en 8 ul du PNK mélange à chaud (0,4 pi PNK [ONE]; 0,8 ul ³² P-γ-ATP, 0,8 ul de tampon 10x PNK [ONE]; eau 6 pi).
2. Incuber pendant 5 min à 37 ° C.
3. Retirer le mélange PNK chaud et remettre en suspension les perles dans 20 tampon 1x chargement ul NuPAGE (Invitrogen).
4. Incuber sur un thermomixer à 70 ° C pendant 10 min.
5. Immédiatement placer sur un aimant pour précipiter les perles vide et charger le surnageant sur le gel (voir étape 8).

8. SDS-PAGE et transfert sur membrane

1. Charger les échantillons sur un NuPAGE 4-12% de Bis-Tris gel (Invitrogen) selon les instructions du fabricant. Utiliser 0,5 L de 1x MOPS courir tampon (Invitrogen). Également charger 5 pi d'un marqueur pré-teint protéine de taille (par exemple la règle PAGE plus, Fermentas, SM1811).
2. Exécutez le gel pendant 50 min à 180 V.
3. Retirer le gel de l'avant et jeter les déchets solides (contient gratuitement ATP radioactif).
4. Transfert des complexes protéines-ARN à partir du gel d'une membrane de nitrocellulose en utilisant l'appareil de transfert Novex humide selon les instructions du fabricant (Invitrogen, transférer 1 h à 30 V).
5. Après le transfert, rincer la membrane dans du tampon PBS, puis l'envelopper dans du Saran Wrap et de l'exposer à un film Fuji à -80 ° C (placer un autocollant fluorescent à côté de la membrane pour l'aligner tqu'il film et la membrane; effectuer des expositions pendant 30 min, 1h et plus la nuit).

9. Isolement de l'ARN

1. Isoler les complexes protéines-ARN à partir de l'expérience à faible RNase en utilisant l'autoradiographie de l'étape 8.5 comme un masque. Couper ce morceau de membrane en plusieurs petites tranches et les placer dans un microtube de 1,5 ml.
2. Ajouter 200 ul de tampon PK (100 mM Tris-HCl pH 7,4, 50 mM de NaCl, 10 mM d'EDTA) et 10 pl protéinase K (Roche, 03115828001) pour les morceaux de membrane. Incuber en agitant à 1100 rpm pendant 20 min à 37 ° C.
3. Ajouter 200 pl de tampon PKurea (100 mM Tris-HCl pH 7,4, 50 mM de NaCl, 10 mM EDTA, 7 M d'urée) et incuber pendant 20 min à 37 ° C.
4. Recueillir la solution et l'ajouter avec 400 pi de phénol / chloroforme (Ambion, 9722) à une phase 2 ml de gel de verrouillage du tube lourd (713 à 2536, VWR) ARN.
5. Incuber pendant 5 min à 30 ° C, en agitant à 1100 rpm. Séparer les phases en faisant tourner pendant 5 min à 13000 rpm à température ambiante.
6. Transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube (attention à ne pas toucher le gel avec la pipette). Ajouter 0,5 ul glycoblue (Ambion, 9510) et 40 pi 3 M pH acétate de sodium 5,5 et mélanger. Puis ajoutez 1 ml d'éthanol à 100%, mélanger à nouveau et le précipité pendant la nuit à -20 ° C.

10. La transcription inverse

1. Spin pendant 20 min à 15000 rpm et 4 ° C. Enlever le surnageant et laver le culot avec 0,5 ml d'éthanol à 80%.
2. Reprendre le culot dans 7,25 ARN ul / mélange d'amorces (6,25 pi d'eau, 0,5 apprêt Rclip ul [0.5pmol/μl]; 0,5 ul de dNTP mix [10 mm]). Pour chaque expérience ou de reproduire, utiliser un apprêt Rclip différents contenant des séquences de codes à barres individuel (voir 14).
3. Incuber pendant 5 min à 70 ° C avant de refroidir à 25 ° C.
4. Ajouter 2,75 ul RT mélange (2 ul de tampon 5x RT; 0,5 ul DTT 0,1 M; 0,25 ul Exposant III de la transcriptase inverse [Invitrogen]).
5. Incuber 5 min à 25 ° C, 20 min à 42 ° C, 40 min à 50 ° C et 5 min à 80 ° C avant de refroidir à 4 ° C.
6. Ajouter 90 ul de tampon TE, 0,5 glycoblue ul et 10 ul d'acétate de sodium pH 5,5 et mélanger. Puis ajouter 250 ul d'éthanol à 100%, mélanger à nouveau et le précipité pendant la nuit à -20 ° C.

11. Purification sur gel d'ADNc

1. Isoler et laver les échantillons (voir 10.1), puis remettre en suspension les boulettes dans 6 pl d'eau.
2. Ajouter 6 ul de tampon de chargement 2x TBE-urée (Invitrogen). Échantillons de chaleur à 80 ° C pendant 3 min avant de le charger directement.
3. Charger les échantillons sur un préfabriqué 6% TBE-urée gel (Invitrogen) et courir pendant 40 min à 180 V comme décrit par le fabricant. Également charger un marqueur de faible poids moléculaire pour le découpage ultérieur (voir ci-dessous).
4. Couper trois bandes à 120-200 NT (élevé), de 85 à 120 nt (moyen) et 70 à 85 nt (basse). Utilisez theupper colorant et les marques sur le support de gel de plastique afin de guider l'excision (voir Figure 3). Notez que l'amorce et la séquence Rclip L3 représentent ensemble 52 nt de la séquence de CLIP.
5. Ajouter 400 ul de TE et écraser la tranche de gel en petits morceaux à l'aide d'un piston de seringue 1 ml. Incuber en agitant à 1100 rpm pendant 2 h à 37 ° C.
6. Placer deux de 1 cm de verre pré-filtres (Whatman, 1.823.010) dans une colonne Costar SpinX (Corning Incorporated, 8161). Transfert de la partie liquide de l'échantillon à la colonne. Spin pendant 1 min à 13000 rpm dans un tube de 1,5 ml.
7. Ajouter 0,5 glycoblue ul et 40 ul d'acétate de sodium pH 5,5, puis mélanger l'échantillon. Ajouter 1 ml d'éthanol à 100%, mélanger à nouveau et le précipité pendant la nuit à -20 ° C.

12. Ligature d'apprêt à l'extrémité 5 'de l'ADNc

1. Isoler et laver les échantillons (voir 10.1), puis remettre en suspension les boulettes dans huit mélange de ligature ul (6,5 ul d'eau, 0,8 ul de tampon 10x CircLigase II; 0,4 pi 50 _mM MnCl2; 0,3 ul; Circligase II [Epicentre]) et incuber pendant 1 h à 60 ° C.
2. Ajouter 30 ul mélange d'oligo recuit (26 ul d'eau, 3 tampons FastDigest ul [Fermentas]; 1 pl cut_oligo [10 pM]). Incuber 1 min à 95 ° C. Puis baisser la température toutes les 20 sec de 1 ° C jusqu'à 25 ° C sont atteints.
3. Ajouter 2 ul BamHI (Fast Fermentas) et incuber pendant 30 min à 37 ° C.
4. Ajouter 50 ul de TE et 0,5 glycoblue ul et mélanger. Ajouter 10 ul d'acétate de sodium pH 5,5 et mélanger, puis ajouter 250 ul d'éthanol à 100%. Mélanger à nouveau et le précipité pendant la nuit à -20 ° C.

13. L'amplification par PCR

1. Isoler et laver les échantillons (voir 10.1), puis remise en suspension le culot dans 19 ul d'eau.
2. Préparer le mélange de PCR (19 ul d'ADNc; 1 pl apprêt mélangez P5/P3 Solexa, 10 uM de chacun; 20 Accuprime ul Supermix une enzyme [Invitrogen]).
3. Exécutez le programme PCR suivant: 94 ° C pendant 2 min, [94 ° C pendant 15 sec, 65 ° C pendant 30 sec, 68 ° C pendant 30 sec] _{25-35 cycles,} 68 ° C pendant 3 min, 4 ° C pour toujours.
4. Mélanger 8 produit ul PCR avec 2 pi de tampon TBE chargement 5x et charge sur un gel de TBE préfabriqué 6% (InvitRogen). Tache le gel avec SybrGreen I (Invitrogen) et d'analyser avec un imageur de gel.
5. Le code-barres dans les amorces Rclip permettent à des échantillons de différents multiplex avant de soumettre pour le séquençage à haut débit. Soumettez 15 ul de la bibliothèque pour le séquençage et de stocker le reste.

14. Des séquences de liaison et de l'amorce

ADN lieur Pré-adenylated 3 ':

[Nous commandons l'adaptateur d'ADN de IDT et ensuite faire des aliquotes de 20μM.]

15. Les résultats représentatifs:

Avant de séquençage de la bibliothèque iClip, le succès de l'expérience peuvent être surveillés à deux étapes: l'autoradiographie du complexe protéine-ARN, après transfert sur membrane (étape 8.5) et l'image du gel des produits de PCR (étape 13.4). Dans l'autoradiographie des échantillons à faible RNase, la radioactivité diffuse doit être considéré au-dessus du poids moléculaire de la protéine (figure 2, l'échantillon 4). Pour haute RNase échantillons, cette radioactivité est concentrée près de la masse moléculaire de la protéine (figure 2, l'échantillon 3). Si aucun anticorps n'est utilisé dans l'immunoprécipitation, aucun signal doit être détecté (figure 2, les échantillons 1 et 2). D'autres commandes importantes pour la spécificité de l'immunoprécipitation omettez d'irradiation UV ou les cellules utilisent qui n'expriment pas la protéine d'intérêt ^14.

L'image du gel des produits de PCR (étape 13.4) devrait montrer une gamme de taille qui correspond à la fraction d'ADNc (haute, moyenne ou faible) purifié à l'étape 11.4 (Figure 4, voies 4-6). Notez que les amorces PCR P3Solexa et P5Solexa introduire un supplémentaire 76 nt à la taille de l'ADNc. Si aucun anticorps n'est utilisé pendant l'immunoprécipitation, aucun produit correspondant PCR devrait être détectés (figure 4, pistes 1-3). Produit dimère Primer peut apparaître à environ 140 nt.

Pour obtenir des résultats représentatifs de séquençage à haut débit et des analyses ultérieures bioinformatiques voir ^14.

Figure 1. Représentation schématique du protocole de iClip. Protéines-ARN sont des complexes de liaisons croisées covalentes in vivo en utilisant l'irradiation UV (étape 1). La protéine d'intérêt est purifié avec l'ARN lié (étapes 2-5). Afin de permettre une séquence-spécifique d'amorçage de la transcription inverse, un adaptateur ARN est ligaturé à l'extrémité 3 'de l'ARN, tandis que l'extrémité 5' est marquée radioactivement (étapes 6 et 7). Réticulé complexes protéine-ARN sont purifiés à partir d'ARN gratuitement en utilisant SDS-PAGE et transfert sur membrane (étape 8). L'ARN est récupéré à partir de la membrane en digérant les protéines à la protéinase K laissant un polypeptide restant à la réticulation de nucléotides (étape 9). La transcription inverse (RT) tronque le polypeptide restant et introduit deux régions adaptateur clivables et des séquences de codes à barres (étape 10). Sélection taille supprime sans apprêt RT avant circularisation. La linéarisation suivante génère des modèles appropriés pour l'amplification par PCR (étapes 11-15). Enfin, séquençage à haut débit génère lit dans lequel les séquences de codes à barres sont immédiatement suivis par le dernier nucléotide de l'ADNc (étape 16). Depuis ce nucléotide localise une position en amont du nucléotide réticulé, le site de liaison peut être déduite à haute résolution.

Figure 2. Autoradiographie d'réticulé hnRNP C-ARN complexes en utilisant l'électrophorèse sur gel dénaturant et transfert sur ​​membrane. hnRNP C-ARN étaient complexes immuno-purifié à partir d'extraits cellulaires utilisant un anticorps contre hnRNP C (α hnRNP C, les échantillons 3 et 4). L'ARN a été partiellement digéré avec faible (+) ou haute (+ +) concentration de RNase. Complexes déplacer vers le haut de la taille de la protéine (40 kDa) peuvent être observés (échantillon 4). Le décalage est moins prononcée lorsque de fortes concentrations de RNase ont été utilisés (échantillon 3). Le signal radioactif disparaît lorsque aucun anticorps a été utilisé dans l'immunoprécipitation (échantillons 1 et 2).

Figure 3. Schéma 6% TBE-urée gel (Invitrogen) pour guider l'excision des produits iClip ADNc. Le gel est géré pendant 40 min à 180 V conduisant à un modèle de migration reproductible des ADNc et des colorants (la lumière et bleu foncé) dans le gel. Utilisez une lame de rasoir pour couper (ligne rouge) du haut (H), moyenne (M), et faible (L) des fractions d'ADNc. Commencez par couper au milieu du colorant bleu clair et immédiatement au-dessus de la marque sur la cassette de gel en plastique. Diviser les fractions moyennes et basses et les garnitures de la fraction haute d'environ 1 cm au-dessus du colorant bleu clair. Utilisez des coupes verticales guidé par les poches et le colorant de séparer les différentes voies (dans cet exemple 1-4). La voie de marqueur (m) peut être teinté et imagé pour contrôlertailles après la coupe. Fragment tailles sont indiquées sur la droite.

Figure 4. Analyse des bibliothèques iClip amplifiée par PCR d'ADNc en utilisant l'électrophorèse sur gel. L'ARN récupéré de la membrane (figure 1) était une transcription inverse et la taille purifié par électrophorèse sur gel dénaturant (figure 2). Trois fractions granulométriques de l'ADNc (haute [H]: 120-200 NT, moyenne [M]: 85-120 nt et basse [L]: 70-85 nt) ont été récupérés, circularisé, re-linéarisé et amplifiée par PCR. Les produits de PCR de la distribution de tailles différentes peuvent être observées en raison des différentes tailles des fractions d'entrée. Depuis l'amorce de PCR introduit 76 nt à l'ADNc, tailles devrait se situer entre 196 à 276 nt pour élevée, de 161 à 196 nt pour les moyennes et 146-161 nt pour des fractions de faible taille. Les produits de PCR sont absents lorsque aucun anticorps a été utilisé pour l'immunoprécipitation (pistes 1-3).

Discussion

Depuis le protocole de iClip contient un large éventail de réactions enzymatiques et des étapes de purification, il n'est pas toujours facile d'identifier un problème quand une expérience échoue. Afin de contrôler la spécificité de l'ARN identifiés réticuler des sites, un ou plusieurs contrôles négatifs doivent être maintenues tout au long de l'expérience complète et des analyses ultérieures de calcul. Ces contrôles peuvent être l'échantillon ne-anticorps, les cellules non-réticulés, ou immunoprécipitation à partir de cellules ou de tissus KO. Idéalement, ces expériences de contrôle ne doit pas purifier tout complexes protéines-ARN, et ne devrait donc pas émettre de signal sur le gel SDS-PAGE, et aucun produit détectable après amplification par PCR. Séquençage à haut débit de ces bibliothèques de contrôle devrait revenir très peu de séquences uniques. Knockdown cellules ne sont pas recommandés comme un contrôle séquençage, puisque les séquences résultantes correspondent toujours à liaison croisée des sites de la même protéine, qui est purifiée à partir de cellules knockdown en plus petites quantités.

Des précautions doivent également être prises pour éviter toute contamination avec les produits de PCR à partir d'expériences antérieures. La meilleure façon de minimiser ce problème est de séparer spatialement les étapes pré-et post-PCR. Idéalement, l'analyse des produits de PCR et de toutes les mesures ultérieures doivent être effectuées dans une pièce séparée. Par ailleurs, chaque membre du laboratoire devrait utiliser son propre ensemble de tampons et d'autres réactifs. De cette façon, les sources de contamination peuvent être facilement identifiés.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
For gel electrophoresis and membrane transfer we recommend t he use of XCell SureLock® Mini-Cell and XCell IIâ Blot Module Kit CE Mark (Invitrogen, EI0002), which is compatible with the use of the different precast minigels that are specified throughout the protocol. The brand and order number of all materials used is mentioned during the protocol. The list of enzymes used in the protocol is shown in the table below.
Protein A Dynabeads	Invitrogen	10001D	use protein G for mouse or goat antibody
RNase I	Ambion	AM2295	activity can change from batch to batch
T4 RNA ligase I	New England Biolabs	M0204S
PNK	New England Biolabs	M0201S
proteinase K	Roche Group	03115828001
Superscript III reverse transcriptase	Invitrogen	18080044
Circligase II	Epicentre Biotechnologies	CL9021K
FastDigest® BamHI	Fermentas	FD0054
AccuPrime™ SuperMix I	Invitrogen	12342010	this PCR mix gives the best results in our hands