iClip - trascrittoma livello Mappatura delle interazioni proteina-RNA con risoluzione individuale Nucleotide

Summary

La disposizione spaziale di RNA-binding proteins in una trascrizione è un fattore determinante di regolazione post-trascrizionale. Pertanto, abbiamo sviluppato i singoli nucleotide reticolazione UV risoluzione e immunoprecipitazione (iClip) che permette preciso genoma mappatura dei siti di legame di una RNA-binding protein.

Abstract

L'esclusiva composizione e la disposizione spaziale di RNA-binding proteins (RBPs) su una trascrizione guida i diversi aspetti della regolazione post-trascrizionale ^1. Quindi, un passo essenziale verso la comprensione regolamento trascrizione a livello molecolare è quello di ottenere informazioni sulla posizione i siti di legame del RBPs ^2.

Le interazioni proteina-RNA può essere studiato con metodi biochimici, ma questi approcci non affrontano l'RNA vincolante nel suo contesto nativo cellulare. I tentativi iniziali per lo studio delle proteine-RNA complessi nel loro ambiente cellulare impiegata purificazione di affinità o di immunoprecipitazione in combinazione con display differenziale o analisi microarray (RIP-CHIP) ^3-5. Questi approcci sono stati inclini a identificare le interazioni indiretti o non fisiologica ^6. Al fine di aumentare la specificità e la risoluzione di posizione, una strategia denominata CLIP (UV cross-linking e immunoprecipitazione) è stato introdotto ^7,8. CLIP combina UV cross-linking delle proteine ​​e molecole di RNA con sistemi di purificazione rigorosa tra cui gel elettroforesi di poliacrilammide denaturante. In combinazione con tecnologie high-throughput sequencing, CLIP ha dimostrato come un potente strumento per studiare le interazioni proteina-RNA su un genoma scala (indicato come HITS-CLIP e CLIP-ss) ^9,10. Recentemente, PAR-clip è stato introdotto che utilizza analoghi ribonucleosidi fotoreattivo per il cross-linking ^11,12.

Nonostante l'alta specificità dei dati ottenuti, gli esperimenti CLIP spesso generare librerie cDNA di complessità sequenza limitata. Ciò è in parte a causa della quantità limitata di co-purificato l'RNA e le due inefficiente reazioni legatura RNA necessari per la preparazione della biblioteca. Inoltre, le analisi primer extension indicato che molti cDNA troncare prematuramente al reticolato ¹³ nucleotidi. Tali cDNA troncato vengono persi durante la preparazione del protocollo standard della libreria CLIP. Abbiamo recentemente sviluppato iClip (individuo-nucleotide CLIP risoluzione), che cattura il cDNA troncato sostituendo uno dei inefficiente intermolecolari passi legatura RNA con una più efficiente circularization intramolecolari cDNA (Figura 1) ^14. È importante sottolineare che il sequenziamento del cDNA troncato fornisce intuizioni sulla posizione del cross-link del sito ad una risoluzione nucleotide. Abbiamo applicato con successo allo studio iClip hnRNP organizzazione delle particelle C su un genoma scala e valutare il suo ruolo nella regolazione di splicing ^14.

Protocol

1. UV cross-linking di coltura dei tessuti delle cellule

1. Rimuovere il supporto e aggiungere 6 ml ghiacciata PBS alle cellule coltivate in un piatto di 10 cm (sufficiente per tre esperimenti).
2. Togliere il coperchio e posizionare sul ghiaccio. Irradiare una volta con 150 mJ / cm ² a 254 nm.
3. Raccogliere le cellule raschiando con un sollevatore di cellulare.
4. Trasferire 2 ml di sospensione cellulare a ciascuna delle tre microtubi. Girare alla massima velocità per 10 secondi a 4 ° C per le cellule pellet, quindi rimuovere il surnatante.
5. Snap-congelare il pellet cellulare in ghiaccio secco e conservare a -80 ° C fino al momento dell'uso.

2. Tallone preparazione

1. Aggiungere 100 ml di proteina A Dynabeads (Dynal, 100,02) per sperimentare un microtubo fresco (Usa Dynabeads proteina G per un mouse o anticorpi di capra).
2. Lavare perline 2x con tampone di lisi (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS; deossicolato di sodio allo 0,5%, 1 / 100 della proteasi cocktail III, Calbiochem).
3. Risospendere le sfere in 100 microlitri tampone di lisi con 2-10 mg di anticorpi.
4. Ruotare i tubi a temperatura ambiente per 30-60 min.
5. Lavare 3x con 900 microlitri tampone di lisi e lasciare in ultimo lavaggio fino al momento di passare al punto 4.1.

3. Lisi cellulare e parziale digestione dell'RNA

1. Risospendere il pellet cellulare in 1 ml di tampone di lisi e il trasferimento a 1,5 microprovette ml.
2. Preparare un 1 / 500 di diluizione di RNasi I (Ambion, AM2295). Aggiungere 10 microlitri RNasi di diluizione e 2 microlitri DNasi Turbo al lisato cellulare (1 / 500 RNase diluizioni I [bassa RNAsi] sono utilizzati per la preparazione della biblioteca; 1 / 50 diluizioni [alta RNAsi] sono indispensabili per controllare per specificità anticorpale) .
3. Incubare i campioni per esattamente 3 minuti a 37 ° C, agitando a 1.100 giri al minuto. Trasferire immediatamente in ghiaccio.
4. Spin a 4 ° C e 22.000 g per 20 minuti per eliminare il lisato. Raccogliere accuratamente il sopranatante (lasciare circa 50 microlitri lisato con il pellet).

4. Immunoprecipitazione

1. Rimuovere il tampone di lavaggio dai grani (dal punto 2.5), quindi aggiungere il lisato cellulare (dal punto 3.4).
2. Ruotare i campioni per 2 ore a 4 ° C.
3. Eliminare il supernatante e lavare le perle di 2x con 900 microlitri di alto sale del buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1 M di NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 0,1% SDS; deossicolato 0,5% di sodio).
4. Lavare 2x con 900 microlitri di tampone di lavaggio (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM MgCl _2, 0.2% Tween-20).

5. Defosforilazione di 3'ends RNA

1. Eliminare il supernatante e risospendere il mix di perle in 20 microlitri PNK (15 microlitri di acqua, 4 microlitri pH 5x PNK 6,5 buffer [350mMTris-HCl, pH 6,5; 50mMMgCl 25mMdithiothreitol _2]; enzima 0,5 microlitri PNK; 0,5 microlitri RNasin [Promega]).
2. Incubare per 20 minuti a 37 ° C.
3. Aggiungere 500 microlitri di buffer lavarsi e lavare 1x con alto contenuto di sale buffer.
4. Lavare 2x con tampone di lavaggio.

6. Legatura linker per RNA 3 '

1. Rimuovere con attenzione il sopranatante e risospendere il mix di perle in 20 microlitri legatura (9 microlitri di acqua, 4 microlitri di buffer legatura 4x [200 mMTris-HCl; MM 40m GCL _2; 40 ditiotreitolo mm]; 1 ml di RNA ligasi [NEB]; RNasin 0,5 microlitri [Promega]; 1,5 microlitri di pre-adenylated linker L3 [20 mM], 4 microlitri PEG400 [81170, Sigma]).
2. Incubare per una notte a 16 ° C.
3. Aggiungere 500 microlitri di buffer di lavaggio e poi lavare 2x con 1 ml di alto sale buffer.
4. Lavare 2x con 1 ml di tampone di lavaggio e lasciare in 1 ml di secondo lavaggio.

7. Fine RNA 5 'etichettatura

1. Rimuovere il supernatante e risospendere le sfere in 8 ml di caldo mix PNK (0,4 microlitri PNK [NEB]; 0,8 microlitri ³² P-γ-ATP; 0,8 microlitri di buffer 10x PNK [NEB]; 6 acqua microlitri).
2. Incubare per 5 min a 37 ° C.
3. Rimuovere il mix caldo PNK e risospendere le sfere in 20 l tampone di caricamento Nupage 1x (Invitrogen).
4. Incubare su un Thermomixer a 70 ° C per 10 min.
5. Immediatamente sul posto un magnete per far precipitare le perline vuoto e caricare il surnatante sul gel (vedi punto 8).

8. SDS-PAGE e trasferimento a membrana

1. Caricare i campioni su un NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel (Invitrogen) secondo le istruzioni del produttore. Utilizzate da 0,5 l di 1x tampone MOPS esecuzione (Invitrogen). Anche carico 5 ml di un pre-macchiato marcatore proteico dimensioni (ad esempio PAGE righello plus, Fermentas, SM1811).
2. Esegui il gel per 50 min a 180 V.
3. Rimuovere la parte anteriore gel ed eliminare i rifiuti solidi (contiene libero radioattivi ATP).
4. Trasferire la proteina-RNA complessi dal gel ad una membrana di nitrocellulosa con l'apparecchiatura di trasferimento Novex umido secondo le istruzioni del produttore (Invitrogen, trasferire 1 ora a 30 V).
5. Dopo il trasferimento, lavare la membrana in un tampone PBS, poi avvolgetelo nella pellicola trasparente e di esporla a una pellicola Fuji a -80 ° C (posto un adesivo fluorescente accanto alla membrana per allineare in seguito tche film e la membrana; eseguire esposizioni per 30 minuti, 1 ora e durante la notte).

9. RNA isolamento

1. Isolare la proteina-RNA complessi dal basso RNasi esperimento utilizzando il autoradiograph dal punto 8.5 come una maschera. Tagliare questo pezzo di membrana in diverse fettine e metterli in un microtubo 1,5 ml.
2. Aggiungere 200 microlitri di buffer PK (100 mM Tris-HCl pH 7,4, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA) e 10 microlitri proteinasi K (Roche, 03115828001) ai pezzi membrana. Incubare agitando a 1.100 rpm per 20 minuti a 37 ° C.
3. Aggiungere 200 ml di PKurea tampone (100 mM Tris-HCl pH 7,4, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 7 M urea) e incubare per 20 minuti a 37 ° C.
4. Raccogliere la soluzione e aggiungere insieme con 400 ml di fenolo / cloroformio (Ambion, 9722) in una fase 2 ml di tubo di blocco Gel pesanti (713-2536, VWR) RNA.
5. Incubare per 5 minuti a 30 ° C, agitando a 1.100 giri al minuto. Separare le fasi di filatura per 5 min a 13.000 rpm a temperatura ambiente.
6. Trasferire lo strato acquoso in un nuovo tubo (attenzione a non toccare il gel con la pipetta). Aggiungere 0,5 microlitri glycoblue (Ambion, 9510) e 40 microlitri 3 M di sodio acetato pH 5.5 e mescolare. Poi aggiungere 1 ml di etanolo al 100%, mescolare ancora e precipitare per tutta la notte a -20 ° C.

10. Trascrizione inversa

1. Spin per 20 minuti a 15.000 rpm e 4 ° C. Rimuovere il surnatante e lavare il pellet con 0,5 ml di etanolo al 80%.
2. Risospendere il precipitato in 7,25 microlitri di RNA / Primer Mix (6,25 microlitri di acqua, 0,5 fondo Rclip microlitri [0.5pmol/μl]; 0,5 microlitri dNTP mix [10 mM]). Per ogni esperimento o replicare, utilizzare un primer diverso Rclip contenenti sequenze di codici a barre individuale (v. 14).
3. Incubare per 5 minuti a 70 ° C prima di raffreddamento a 25 ° C.
4. Aggiungi 2,75 microlitri RT mix (2 microlitri di buffer 5x RT; 0,5 microlitri 0.1M DTT; 0,25 microlitri Apice III della trascrittasi inversa [Invitrogen]).
5. Incubare 5 minuti a 25 ° C, 20 min a 42 ° C, 40 min a 50 ° C e 5 min a 80 ° C prima di raffreddamento a 4 ° C.
6. Aggiungere 90 microlitri di buffer TE, 0,5 microlitri glycoblue e 10 microlitri acetato di sodio pH 5.5 e mescolare. Poi aggiungere 250 microlitri di etanolo al 100%, mescolare ancora e precipitare per tutta la notte a -20 ° C.

11. Gel purificazione di cDNA

1. Spin down e lavare i campioni (vedi 10.1), poi risospendere il pellet in 6 ml di acqua.
2. Aggiungere 6 microlitri 2x TBE-urea tampone di caricamento (Invitrogen). Campioni di calore a 80 ° C per 3 minuti prima di caricare direttamente.
3. Caricare i campioni su un 6% prefabbricato TBE-urea gel (Invitrogen) e correre per 40 min a 180 V, come descritto dal produttore. Anche caricare un marker a basso peso molecolare per il taglio successivi (vedi sotto).
4. Tagliare tre bande a 120-200 nt (alto), 85-120 nt (media) e 70-85 nt (basso). Usa theupper colorante ei segni sul supporto in plastica gel per guidare l'escissione (vedi figura 3). Si noti che il primer Rclip e la sequenza L3 insieme rappresentano il 52 nt della sequenza CLIP.
5. Aggiungere 400 microlitri TE e schiacciare la fetta gel in piccoli pezzi con una siringa da 1 ml stantuffo. Incubare agitando a 1.100 giri al minuto per 2 ore a 37 ° C.
6. Inserire due 1 centimetro di vetro pre-filtro (Whatman, 1.823.010), in una colonna Costar SpinX (Corning Incorporated, 8161). Trasferire la parte liquida del campione alla colonna. Spin per 1 minuto a 13.000 giri al minuto in una provetta da 1,5 ml.
7. Aggiungere 0,5 microlitri glycoblue e 40 microlitri di acetato di sodio pH 5.5, poi mescolare il campione. Aggiungere 1 ml di etanolo al 100%, mescolare ancora e precipitare per tutta la notte a -20 ° C.

12. Legatura di primer per la 5'end del cDNA

1. Spin down e lavare i campioni (vedi 10.1), poi risospendere il pellet in 8 mix legatura microlitri (6,5 microlitri di acqua; 0,8 microlitri 10x CircLigase Buffer II; 0,4 microlitri 50 mM MnCl _2; 0,3 microlitri; Circligase II [Epicentre]) e incubare per 1 ora a 60 ° C.
2. Aggiungere 30 microlitri mix di oligo ricottura (26 microlitri di acqua, 3 Buffer FastDigest microlitri [Fermentas]; 1 ml cut_oligo [10 mM]). Incubare per 1 minuto a 95 ° C. Poi diminuire la temperatura ogni 20 sec di 1 ° C fino a 25 ° C si raggiungono.
3. Aggiungere 2 microlitri BamHI (Fast Fermentas) e incubare per 30 minuti a 37 ° C.
4. Aggiungere 50 microlitri TE e 0,5 microlitri glycoblue e mescolare. Aggiungere 10 microlitri di acetato di sodio pH 5.5 e mescolare, poi aggiungere 250 microlitri di etanolo al 100%. Mescolare di nuovo e precipitare per tutta la notte a -20 ° C.

13. Amplificazione PCR

1. Spin down e lavare i campioni (vedi 10.1), poi risospendere il pellet in 19 microlitri di acqua.
2. Preparare la miscela di PCR (19 microlitri cDNA; 1 ml fondo mix P5/P3 Solexa, 10 mM ciascuno, 20 microlitri Accuprime Supermix 1 enzima [Invitrogen]).
3. Eseguire il seguente programma di PCR: 94 ° C per 2 minuti, [94 ° C per 15 sec, 65 ° C per 30 secondi, 68 ° C per 30 sec] _{25-35 cicli,} 68 ° C per 3 minuti, 4 ° C per sempre.
4. Mix 8 microlitri prodotto di PCR con 2 ml di tampone 5x carico TBE e caricare su un 6% gel prefabbricati TBE (invitRogen). Macchiare il gel con Sybrgreen I (Invitrogen) e analizzare con un imager gel.
5. Il codice a barre nella primer Rclip permettono ai campioni di diversi multiplex prima della presentazione per il sequenziamento throughput elevato. 15 ml di presentare la biblioteca per il sequenziamento e conservare il resto.

14. Linker e primer sequenze

DNA linker pre-adenylated 3 ':

[Ordiniamo l'adattatore DNA da IDT e poi fare aliquote di 20μM.]

15. Rappresentante dei risultati:

Prima del sequenziamento della biblioteca iClip, il successo di questo esperimento può essere monitorato in due fasi: la autoradiograph della proteina-RNA complesso dopo il trasferimento a membrana (passo 8.5) e l'immagine gel dei prodotti di PCR (passo 13,4). Nel autoradiograph del basso-RNasi campioni, la radioattività diffusa deve essere vista al di sopra del peso molecolare della proteina (Figura 2, campione 4). Per l'alta RNAsi campioni, questa radioattività è focalizzata più vicino al peso molecolare della proteina (Figura 2, campione 3). Quando non viene utilizzato anticorpi nel immunoprecipitazione, nessun segnale deve essere rilevato (Figura 2, i campioni 1 e 2). Ulteriori controlli importante per la specificità del immunoprecipitazione omettere irradiazione UV o cellule uso che non esprimono la proteina di interesse ^14.

L'immagine gel dei prodotti di PCR (passo 13,4) dovrebbe mostrare un intervallo di grandezza che corrisponde alla frazione cDNA (alta, media o bassa) purificata nel passo 11,4 (Figura 4, corsie 4-6). Si noti che la PCR primer P3Solexa e P5Solexa introdurre un ulteriore 76 nt alla dimensione del cDNA. Se nessun anticorpo è utilizzato durante la immunoprecipitazione, nessun prodotto corrispondente PCR dovrebbe essere rilevato (Figura 4, corsie 1-3). Dimero prodotto primer può apparire a circa 140 nt.

Per i risultati rappresentativi di high-throughput sequencing e la successiva analisi bioinformatica vedere ^14.

Figura 1. Rappresentazione schematica del protocollo iClip. Proteina-RNA sono complessi covalentemente reticolato in vivo, utilizzando radiazioni UV (fase 1). La proteina di interesse è purificata con l'RNA legato (passi 2-5). Per consentire la sequenza-specifica adescamento di trascrizione inversa, un adattatore RNA è legatura al 3 'del RNA, mentre il 5' è radioattivo (punti 6 e 7). Reticolato proteina-RNA complessi sono purificati da RNA gratuitamente utilizzando SDS-PAGE e trasferimento a membrana (punto 8). L'RNA è recuperato dalla membrana da digerire le proteine ​​con proteinasi K lasciando un polipeptide rimane alla cross-link nucleotide (punto 9). Trascrizione inversa (RT) tronca il polipeptide rimanente e introduce due regioni adattatore cleavable e sequenze di codici a barre (punto 10). Selezione del formato rimuove senza fondo RT prima circularization. La linearizzazione segue genera modelli adatti per l'amplificazione PCR (passi 11-15). Infine, high-throughput sequencing genera legge in cui le sequenze di codici a barre sono immediatamente seguite da nucleotide ultimo dei cDNA (passo 16). Dal momento che questo nucleotide individua una posizione a monte del reticolato nucleotide, il sito di legame si può dedurre con alta risoluzione.

Figura 2. Autoradiograph di cross-linked hnRNP C-RNA complessi mediante elettroforesi su gel di denaturazione e trasferimento di membrana. hnRNP C-RNA sono stati complessi immuno-purificato da estratti cellulari utilizzando un anticorpo contro hnRNP C (α hnRNP C, campioni 3 e 4). RNA è stato parzialmente digerito con bassa (+) o alto (+ +) concentrazione di RNAsi. Complessi spostando verso l'alto dalla dimensione della proteina (40 kDa) possono essere osservati (campione 4). Il cambiamento è meno pronunciato quando alte concentrazioni di RNasi sono stati utilizzati (esempio 3). Il segnale radioattivo scompare quando non anticorpale è stato utilizzato nel immunoprecipitazione (campioni 1 e 2).

Figura 3. Schematica 6% TBE-urea gel (Invitrogen) per guidare l'escissione di prodotti iClip cDNA. Il gel viene eseguito per 40 minuti a 180 V che porta ad un modello migratorio riproducibile di cDNA e coloranti (chiaro e blu scuro) nel gel. Utilizzare una lama di rasoio per tagliare (linea rossa) l'alto (H), medio (M) e bassa (L) frazioni cDNA. Iniziate tagliando a metà del colorante azzurro e immediatamente sopra il marchio sulla cassetta gel di plastica. Dividere le frazioni di media e bassa e tagliare la frazione alta circa 1 cm sopra il colorante azzurro. Usa tagli verticali guidati dalla tasche e il colorante per separare le corsie diverse (in questo esempio 1-4). Il vicolo marcatore (m) può essere colorate e ripreso il controllodimensioni dopo il taglio. Dimensioni frammento sono indicati sulla destra.

Figura 4. L'analisi di PCR-amplificato librerie iClip cDNA usando elettroforesi su gel. RNA recuperato dalla membrana (figura 1) è stata trascrizione inversa e la dimensione-purificati mediante elettroforesi su gel denaturante (Figura 2). Tre frazioni dimensione del cDNA (alta [H]: 120-200 nt, media [M]: 85-120 nt e bassa [L]: 70-85 nt) sono stati recuperati, circularized, ri-linearizzata e PCR-amplificato. I prodotti di PCR di distribuzione di diverse dimensioni si possono osservare a seguito di diverse dimensioni delle frazioni di ingresso. Dal momento che il primer PCR presenta 76 nt al cDNA, le dimensioni deve essere compresa tra 196-276 nt per alta, nt 161-196 per le medie e 146-161 nt per le frazioni bassa dimensione. I prodotti di PCR sono assenti quando non anticorpale è stato utilizzato per l'immunoprecipitazione (corsie 1-3).

Discussion

Dato che il protocollo iClip contiene una vasta gamma di reazioni enzimatiche e fasi di purificazione, non è sempre facile identificare un problema quando un esperimento fallisce. Al fine di controllo per la specificità della RNA identificato cross-link siti, uno o più controlli negativi devono essere mantenuti per tutto l'esperimento completo e la successiva analisi computazionale. Questi controlli possono essere il non-anticorpo del campione, la non cross-linked cellule, o immunoprecipitazione da cellule knockout o tessuto. Idealmente, questi esperimenti di controllo non dovrebbe purificare ogni proteina-RNA complessi, e quindi dovrebbe dare nessun segnale sul gel SDS-PAGE, e nessun prodotto rilevabile dopo amplificazione PCR. High-throughput sequencing di queste librerie di controllo dovrebbe restituire sequenze uniche pochissime. Knockdown cellule non sono raccomandati come controllo di sequenziamento, dal momento che le sequenze risultanti sempre conforme ai cross-link siti della stessa proteina, che è purificato dalle cellule atterramento in piccole quantità.

Precauzioni devono essere adottate per evitare la contaminazione con prodotti di PCR di precedenti esperimenti. Il modo migliore per minimizzare questo problema è quello di separare spazialmente fasi pre-e post-PCR. Idealmente, l'analisi dei prodotti di PCR e tutti i passi successivi devono essere eseguite in una stanza separata. Inoltre, ogni membro del laboratorio deve utilizzare il proprio set di buffer e altri reagenti. In questo modo, le fonti di contaminazione possono essere più facilmente identificati.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
For gel electrophoresis and membrane transfer we recommend t he use of XCell SureLock® Mini-Cell and XCell IIâ Blot Module Kit CE Mark (Invitrogen, EI0002), which is compatible with the use of the different precast minigels that are specified throughout the protocol. The brand and order number of all materials used is mentioned during the protocol. The list of enzymes used in the protocol is shown in the table below.
Protein A Dynabeads	Invitrogen	10001D	use protein G for mouse or goat antibody
RNase I	Ambion	AM2295	activity can change from batch to batch
T4 RNA ligase I	New England Biolabs	M0204S
PNK	New England Biolabs	M0201S
proteinase K	Roche Group	03115828001
Superscript III reverse transcriptase	Invitrogen	18080044
Circligase II	Epicentre Biotechnologies	CL9021K
FastDigest® BamHI	Fermentas	FD0054
AccuPrime™ SuperMix I	Invitrogen	12342010	this PCR mix gives the best results in our hands