Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

iCLIP - Transcriptome רחב מיפוי של חלבון-RNA אינטראקציות עם רזולוציה נוקלאוטיד יחיד

Published: April 30, 2011 doi: 10.3791/2638
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 1, 3, 4, 2, 1
1Laboratory of Molecular Biology, Medical Research Council - MRC, 2European Bioinformatics Institute, EMBL Heidelberg, 3Computer and Information Science, University of Ljubljana, 4Wellcome Trust Genome Campus, Wellcome Trust Sanger Institute

ERRATUM NOTICE

Summary

הסידור המרחבי של חלבונים RNA מחייב על תעתיק הוא הקובע המפתח של תקנה שלאחר תעתיק. לכן, פיתחנו הפרט נוקלאוטיד UV ברזולוציה crosslinking ו immunoprecipitation (iCLIP) המאפשר מיפוי מדויק גנום רחב של אתרי הקישור של חלבון-RNA מחייב.

Abstract

הרכב ייחודי הסדר המרחבי של RNA מחייב חלבונים (RBPs) על תעתיק המדריך היבטים מגוונים של תקנה שלאחר תעתיק 1. לכן, צעד חיוני לקראת הבנה תקנה תמליל ברמה המולקולרית היא להשיג מידע מיקומית על אתרי הקישור של RBPs 2.

חלבון-RNA אינטראקציות ניתן ללמוד בשיטות ביוכימיות, אך גישות אלה אינן כתובת RNA מחייב בהקשר הסלולר המקורית שלו. ניסיונות ראשוניים ללמוד חלבון-RNA מתחמי בסביבה הסלולרי שלהם מועסקים טיהור זיקה או immunoprecipitation בשילוב עם תצוגת ההפרש או ניתוח microarray (RIP-Chip), 3-5. גישות אלה היו מועדים בזיהוי אינטראקציות עקיפה או שאינם פיזיולוגיים 6. על מנת להגביר את הספציפיות ופתרון מיקומית, אסטרטגיה המכונה CLIP (UV cross-linking ו immunoprecipitation) הוצג 7,8. CLIP משלב cross-linking UV של חלבונים ומולקולות RNA עם ערכות טיהור קפדני כולל ג'ל אלקטרופורזה denaturing polyacrylamide. בשילוב עם תפוקה גבוהה טכנולוגיות רצף, CLIP הוכח ככלי רב עוצמה כדי לחקור אינטראקציות חלבון-RNA בקנה מידה הגנום כולו (המכונה CLIP-היטים או CLIP-seq) 9,10. לאחרונה, PAR-CLIP הוצג המשתמשת אנלוגים ribonucleoside photoreactive עבור cross-linking 11,12.

למרות הספציפיות הגבוהה של נתונים המתקבלים, ניסויים CLIP לעתים קרובות ליצור ספריות cDNA של מורכבות רצף מוגבל. זה נובע בחלקו לכמות מוגבלת של שיתוף מטוהרים RNA ושני התגובות יעיל RNA קשירת הדרוש לשם הכנת הספרייה. בנוסף, תחל הרחבת מבחני ציינו כי cDNAs רבים לחתוך בטרם עת על 13 נוקליאוטידים crosslinked. CDNAs מקוצץ כאלה הם איבדו במהלך פרוטוקול סטנדרטי CLIP ספריה הכנה. פיתחנו לאחרונה iCLIP (נוקלאוטיד יחיד-CLIP רזולוציה), אשר לוכדת את cDNAs מקוצץ ידי החלפת אחד מולקולאריים הצעדים יעיל RNA קשירת עם circularization יעיל יותר cDNA intramolecular (איור 1) 14. חשוב לציין, רצף cDNAs מקוצץ מספק תובנות לגבי המיקום של אתר cross-הקישור ברזולוציה של נוקלאוטיד. אנו ליישם בהצלחה iCLIP ללמוד hnRNP ארגון C החלקיקים בקנה מידה הגנום כולו ולהעריך את תפקידה בתקנה שחבור 14.

Protocol

1. UV cross-linking של תאים בתרבית רקמה

  1. הסר את המדיה ולהוסיף 6 מ"ל קר כקרח PBS לתאים הגדלים צלחת 10 ס"מ (מספיק בשביל שלושה ניסויים).
  2. הסר את המכסה ומניחים על קרח. מקרינים פעם עם 150 mJ / 2 ס"מ על 254 ננומטר.
  3. קציר התאים על ידי גירוד עם מרים תא.
  4. העברת 2 מ"ל ההשעיה תא אחד של שלושה microtubes. ספין במהירות שיא עבור 10 שניות ב 4 ° C לתאי גלולה, ולאחר מכן להסיר supernatant.
  5. Snap-להקפיא את כדורי התא על הקרח חנות יבש ב -80 ° C עד השימוש.

2. ביד הכנה

  1. הוסף 100 μl של חלבון Dynabeads (Dynal, 100.02) עבור ניסוי microtube טרי (השתמש Dynabeads חלבון G עבור עכבר או נוגדנים עז).
  2. לשטוף עם חרוזים 2x חיץ תמוגה (50 mM טריס-HCl, pH 7.4, 100 מ"מ NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, deoxycholate נתרן 0.5%, 1 / 100 מעכבי פרוטאז קוקטייל השלישי, Calbiochem).
  3. Resuspend חרוזים במאגר 100 תמוגה μl עם נוגדן 20-10 מיקרוגרם.
  4. סובב צינורות בטמפרטורת החדר למשך 30-60 דקות.
  5. לשטוף 3x עם חיץ 900 תמוגה μl ולהשאיר בכביסה האחרונה עד מוכנים לשלב 4.1.

3. תא תמוגה חלקי מערכת העיכול RNA

  1. Resuspend התא גלולה במאגר 1 מ"ל תמוגה ולהעביר microtubes 1.5 מ"ל.
  2. הכן דילול 1 / 500 של RNase אני (Ambion, AM2295). הוסף 10 μl דילול RNase אני, כמו גם 2 DNase טורבו μl lysate אל התא (1 / 500 RNase דילולים אני [נמוך RNase] משמשים להכנת ספריה, 1 / 50 דילולים [גבוה RNase] יש צורך לשלוט על סגוליות נוגדן) .
  3. דגירה דגימות 3 דקות בדיוק בשעה 37 ° C, רועד בסל"ד 1100. מיד להעביר קרח.
  4. ספין על 4 ° C ו 22,000 g עבור 20 דקות כדי לנקות את lysate. בזהירות לאסוף את supernatant (להשאיר על 50 lysate μl עם גלולה).

4. Immunoprecipitation

  1. הסר את חוצץ לשטוף מן חרוזים (משלב 2.5), ואז להוסיף את lysate תא (משלב 3.4).
  2. סובב את דגימות עבור 2 שעות על 4 ° C.
  3. בטל supernatant ולשטוף את החרוזים 2x עם חיץ 900 μl מלח גבוהה (50 מ"מ טריס-HCl, pH 7.4, 1 M NaCl: 1 mM EDTA; 1% NP-40, 0.1% SDS, נתרן deoxycholate 0.5%).
  4. לשטוף עם 2x חיץ 900 לשטוף μl (20 mM טריס-HCl, pH 7.4, 10 mM MgCl 2; 0.2% Tween-20).

5. Dephosphorylation של רנ"א 3'ends

  1. בטל supernatant ו resuspend החרוזים בתמהיל 20 PNK μl (15 μl מים; 4 pH μl 5x PNK 6.5 חיץ [350mMTris-HCl, pH 6.5, 50mMMgCl 25mMdithiothreitol 2]; 0.5 μl אנזים PNK; 0.5 μl RNasin [Promega]).
  2. דגירה של 20 דקות בשעה 37 ° C.
  3. הוסף 500 μl חיץ לרחוץ ולשטוף 1x עם חיץ גבוה מלח.
  4. לשטוף עם 2x חיץ לשטוף.

6. קשירת Linker ל RNA הקצוות "3

  1. הסר בזהירות את supernatant ו resuspend החרוזים בתמהיל קשירת μl 20 (9 μl מים; 4 קשירת μl חיץ 4x [200 mMTris-HCl: MM 40m gCl 2; 40 dithiothreitol mM]; 1 μl RNA האנזים [חוד]; 0.5 RNasin μl [Promega]; 1.5 מקשר μl מראש adenylated L3 [20 מיקרומטר]; 4 μl PEG400 [81170, סיגמא]).
  2. דגירה לילה בשעה 16 ° C.
  3. הוסף 500 μl חיץ לשטוף ולאחר מכן לשטוף עם 2x חיץ גבוה מלח 1 מ"ל.
  4. לשטוף עם 2x חיץ מ"ל 1 לרחוץ לעזוב מ"ל 1 של לשטוף את השני.

7. סוף תיוג RNA 5 "

  1. הסר את supernatant ו resuspend את החרוזים μl 8 תמהיל PNK חם (0.4 μl PNK [חוד]; 0.8 μl 32 P-γ-ATP; 0.8 חיץ μl 10x PNK [חוד]; 6 מים μl).
  2. דגירה של 5 דק 'ב 37 ° C.
  3. מוציאים את תערובת PNK חם resuspend את החרוזים 20 Nupage μl חיץ 1x העמסה (Invitrogen).
  4. לדגור על thermomixer ב 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  5. מיד מקום על מגנט כדי לזרז את החרוזים ריק לטעון את supernatant על הג'ל (ראה שלב 8).

8. SDS-PAGE והעברת הממברנה

  1. טען את דגימות על NuPAGE 4-12% Bis-טריס ג'ל (Invitrogen) על פי הוראות היצרן. אני השתמש 0.5 של 1x מגבים לרוץ חיץ (Invitrogen). גם עומס של 5 μl סמן טרום מוכתמים בחלבון גודל (למשל PAGE שליט פלוס, Fermentas, SM1811).
  2. הפעל את ג'ל 50 דקות ב 180 V.
  3. הסר את חזית ג'ל וזורקים כמו פסולת מוצקה (מכיל חופשי רדיואקטיבי ATP).
  4. מעבירים את חלבון-RNA מתחמי מן הג'ל על קרום nitrocellulose באמצעות מנגנון העברת Novex רטוב על פי הוראות היצרן (Invitrogen, העברת 1 h ב V 30).
  5. לאחר ההעברה, יש לשטוף את הממברנה במאגר PBS, אז לעטוף אותו בפלסטיק נצמד ולחשוף אותו סרט פוג'י ב -80 ° C (מקום מדבקה ניאון ליד הממברנה כדי ליישר לא מאוחרהוא סרט הממברנה; לבצע חשיפות של 30 דקות, 1h ומעלה בלילה).

9. בידוד RNA

  1. לבודד את חלבון-RNA מתחמי מניסוי נמוכה RNase באמצעות autoradiograph משלב 8.5 כמסיכה. חותכים את הקטע הזה של קרום לפרוסות קטנות כמה ולמקם אותם לתוך microtube 1.5 מ"ל.
  2. הוסף 200 μl חיץ קי (100 מ"מ טריס-HCl pH 7.4, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA) וכן 10 μl proteinase K (רוש, 03115828001) את פיסות קרום. דגירה רועד בסל"ד 1100 עבור 20 דקות בשעה 37 ° C.
  3. הוסף 200 μl של PKurea חיץ (100 מ"מ טריס-HCl pH 7.4, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA; 7 M אוריאה) ו דגירה של 20 דקות בשעה 37 ° C.
  4. איסוף הפתרון ולהוסיף אותו יחד עם 400 μl של רנ"א פנול / כלורופורם (Ambion, 9722) עד שלב 2 צינור מ"ל ג'ל נעל כבדה (713-2536, VWR).
  5. דגירה של 5 דקות בקצב של 30 ° C, רועד בסל"ד 1100. הפרד את השלבים על ידי ספינינג במשך 5 דקות ב 13,000 סל"ד בטמפרטורת החדר.
  6. מעבירים את השכבה המימית לתוך צינור חדש (להיזהר שלא לגעת בג'ל עם פיפטה). הוספת 0.5 μl glycoblue (Ambion, 9510) ו 40 אצטט μl 3 M נתרן pH 5.5 ומערבבים. לאחר מכן להוסיף 1 מ"ל אתנול 100%, מערבבים שוב לזרז את הלילה בבית -20 ° C.

10. הפוך שעתוק

  1. ספין של 20 דקות ב 15,000 סל"ד ו - 4 ° C. הסר את supernatant לשטוף את הכדור עם 0.5 מ"ל אתנול 80%.
  2. Resuspend את הכדור ב 7.25-RNA μl / תערובת פריימר (6.25 μl מים; 0.5 פריימר Rclip μl [0.5pmol/μl]; 0.5 μl dNTP לערבב [10mm]). עבור כל ניסוי או לשכפל, להשתמש פריימר Rclip שונה המכיל רצפים ברקוד אישי (ראה 14).
  3. דגירה של 5 דקות ב 70 מעלות צלזיוס לפני קירור עד 25 ° C.
  4. הוסף μl 2.75 RT לערבב (2 חיץ μl 5x RT; 0.5 μl 0.1M DTT: 0.25 μl כתב עילי III הפוך transcriptase [Invitrogen]).
  5. דגירה 5 דקות במהירות של 25 ° C, 20 דקות בשעה 42 ° C, 40 דקות בשעה 50 ° C ו 5 דק 'ב 80 ° C לפני קירור 4 ° C.
  6. הוסף 90 μl TE חיץ, 0.5 glycoblue μl ו 10 נתרן אצטט μl pH 5.5 ומערבבים. ואז להוסיף 250% אתנול 100 μl, מערבבים שוב לזרז את הלילה בבית -20 ° C.

11. ג'ל טיהור cDNA

  1. ספין למטה לשטוף את דגימות (ראו 10.1), ואז resuspend את כדורי ב μl 6 של מים.
  2. הוסף חוצץ 6 μl 2x TBE-אוריאה וטעינה (Invitrogen). דגימות חום עד 80 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ישירות לפני הטעינה.
  3. טען את הדגימות על הג'ל 6% TBE-אוריאה precast (Invitrogen) ולרוץ 40 דקות ב 180 V כפי שתואר על ידי היצרן. גם לטעון סמן נמוך משקל מולקולרי לחיתוך הבאים (ראה להלן).
  4. גזור שלוש להקות ב 120-200 NT (גבוהה), 85-120 NT (בינוני) ו 70-85 NT (נמוך). השתמש theupper לצבוע את הסימנים על התמיכה ג'ל פלסטיק מדריך כריתה (ראה איור 3). שים לב כי תחל Rclip ואת רצף L3 ביחד מהווים NT 52 של רצף CLIP.
  5. הוסף 400 μl TE ולרסק את הפרוסה ג'ל לחתיכות קטנות באמצעות הבוכנה 1 מ"ל במזרק. דגירה רועד בסל"ד 1100 למשך 2 שעות ב 37 ° C.
  6. מניחים שתי 1 כוס ס"מ טרום מסננים (Whatman, 1823010) לתוך עמודה שחקן המשנה SpinX (Corning Incorporated, 8161). מעבירים את החלק הנוזלי של המדגם לעמודה. ספין דקות 1 ב 13,000 סל"ד לתוך צינור 1.5 מ"ל.
  7. הוספת 0.5 μl glycoblue ו 40 נתרן אצטט μl pH 5.5, ואז לערבב את המדגם. הוסף 1 מ"ל אתנול 100%, מערבבים שוב לזרז את הלילה בבית -20 ° C.

12. קשירת של פריימר על 5'end של cDNA

  1. ספין למטה לשטוף את דגימות (ראו 10.1), ואז resuspend את כדורי בתמהיל 8 קשירת μl (6.5 μl מים; 0.8 μl 10x CircLigase הצפת השנייה; 0.4 μl 50 מ"מ MnCl 2; 0.3 μl; Circligase II [Epicentre]) ו דגירה עבור h 1 ב 60 ° C.
  2. הוסף 30 μl לערבב אוליגו חישול (26 μl מים; 3 הצפת FastDigest μl [Fermentas]; 1 μl cut_oligo [10 מיקרומטר]). דגירה דקות 1 ב 95 ° C. ואז להקטין את הטמפרטורה כל 20 שניות עד 1 ° C עד 25 ° C הם הגיעו.
  3. הוסף 2 BamHI μl (Fermentas מהיר) ו דגירה למשך 30 דקות ב 37 ° C.
  4. הוסף 50 μl TE ו 0.5 glycoblue לערבב μl ו. הוסף 10 μl נתרן אצטט pH 5.5 ומערבבים, ואז מוסיפים 250 μl 100% אתנול. מערבבים שוב לזרז את הלילה בבית -20 ° C.

13. PCR הגברה

  1. ספין למטה לשטוף את דגימות (ראו 10.1), ואז resuspend גלולה במים 19 μl.
  2. מכינים את תערובת ה-PCR (19 μl cDNA: 1 μl תערובת פריימר P5/P3 solexa, 10 מיקרומטר אחד; 20 Accuprime μl Supermix האנזים 1 [Invitrogen]).
  3. הפעל את התוכנית הבאה PCR: 94 מעלות צלזיוס למשך 2 דק ', [94 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, 65 ° C למשך 30 שניות, 68 ° C למשך 30 שניות] 25-35 מחזורים, 68 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות, 4 ° C לנצח.
  4. מיקס 8 μl מוצר PCR עם 2 μl של חיץ טעינת 5x TBE עומס על ג'ל 6% TBE precast (Invitרוגן). הכתם ג'ל עם Sybrgreen אני (Invitrogen) ולנתח עם imager ג'ל.
  5. ברקוד על primers Rclip מאפשרים דגימות זמנית שונה לפני הגשת עבור סידור תפוקה גבוהה. שלח 15 μl של הספרייה עבור סידור ולאחסן את כל השאר.

14. לינקר ו פריימר רצפים

הדנ"א מקשר טרום adenylated 3 ':

[אנחנו מזמינים את מתאם ה-DNA מן IDT ולאחר מכן לבצע aliquots של 20μM.]

ה-DNA

15. נציג תוצאות:

לפני רצף של הספרייה iCLIP, ההצלחה של הניסוי ניתן לפקח על שני שלבים: autoradiograph של מורכבות חלבון-RNA לאחר העברת קרום (שלב 8.5) ואת התמונה ג'ל של מוצרי ה-PCR (צעד 13.4). ב autoradiograph של הדגימות נמוך RNase, רדיואקטיביות מפוזר יש לראות מעל המשקל המולקולרי של החלבון (איור 2, מדגם 4). ל-high-RNase דגימות, רדיואקטיביות זו מתמקדת יותר משקל מולקולרי של החלבון (איור 2, מדגם 3). כאשר אין נוגדנים משמש immunoprecipitation, אות לא צריך להיות מזוהה (איור 2, דוגמאות 1 ו -2). שולט חשוב נוסף עבור הספציפיות של immunoprecipitation או להשמיט קרינה UV או להשתמש בתאים שאינם מבטאים את החלבון של עניין 14.

התמונה ג'ל של מוצרי ה-PCR (צעד 13.4) צריך להראות מגוון בגודל המתאים השבר cDNA (גבוהה, בינונית או נמוכה) מטוהרים בשלב 11.4 (איור 4, נתיבי 4-6). שים לב primers PCR P3Solexa ו P5Solexa להציג nt נוסף 76 לגודל של cDNA. אם אין נוגדנים משמש במהלך immunoprecipitation, המוצרים המתאימים PCR לא צריך להיות מזוהה (איור 4, נתיבי 1-3). דימר המוצר פריימר יכול להופיע על 140 nt.

לקבלת תוצאות נציג רצף תפוקה גבוהה ומנתח bioinformatic הבאים לראות 14.

איור 1
באיור 1. ייצוג סכמטי של פרוטוקול iCLIP. חלבון-RNA הם קומפלקסים קוולנטית צולבים in vivo באמצעות קרינת UV (שלב 1). החלבון של הריבית מטוהרים יחד עם RNA כבול (שלבים 2-5). כדי לאפשר תחול רצף ספציפי של שעתוק לאחור, מתאם RNA הוא ligated ל 3 "בסופו של רנ"א, בעוד 5 'סוף מסומן רדיואקטיבית (שלבים 6 ו 7). צולבים חלבון-RNA מתחמי הם מטוהרים מ-RNA בחינם באמצעות SDS-PAGE והעברת הממברנה (שלב 8). RNA הוא התאושש הממברנה על ידי לעכל את החלבון עם proteinase K להשאיר פוליפפטיד הנותרים בקישור הנגדית נוקלאוטיד (שלב 9). שעתוק הפוך (RT) חותכת את פוליפפטיד הנותרים ומציג שני אזורים מתאם cleavable רצפים ברקוד (שלב 10). בחירת גודל מסיר חינם פריימר RT לפני circularization. לינאריזציה הבאים מייצר תבניות מתאים הגברה PCR (שלבים 11-15). לבסוף, תפוקה גבוהה יוצרת רצף קורא בו רצפי ברקוד הם מיד אחריו נוקלאוטיד האחרון של cDNA (שלב 16). מאז זה בתנוחה אחת מאתרת נוקלאוטיד במעלה הזרם של צולבים נוקלאוטיד, האתר מחייב ניתן להסיק עם רזולוציה גבוהה.

איור 2
איור 2. Autoradiograph של צולבים hnRNP C-RNA מתחמי באמצעות ג'ל אלקטרופורזה denaturing והעברת הממברנה. hnRNP C-RNA מתחמי היו חיסונית מטוהרים מן תמציות התא באמצעות נוגדן כנגד hnRNP C (α hnRNP C, דגימות 3 ו 4). RNA היה מעוכל חלקית באמצעות נמוך (+) או גבוה (+ +) ריכוז של RNase. מתחמי הסטה כלפי מעלה מ גודל של חלבון (40 KDA) ניתן להבחין (מדגם 4). השינוי בולטת פחות כאשר ריכוזים גבוהים של RNase שימשו (מדגם 3). האות רדיואקטיבי נעלמת כאשר אין נוגדן שימש immunoprecipitation (דוגמאות 1 ו -2).

איור 3
איור 3. 6% סכמטי TBE-אוריאה ג'ל (Invitrogen) להנחות את כריתה של מוצרים iCLIP cDNA. הג'ל הוא לרוץ 40 דק 'ב 180 V המוביל דפוס הגירה לשחזור של cDNAs וצבעים (אור כחול כהה) בתוך הג'ל. השתמש סכין גילוח לחתוך (קו אדום) הגבוהה (H), בינוני (M), נמוך (L) שברים cDNA. התחל על ידי חיתוך באמצע צבע כחול בהיר ומיד לעיל סימן על הקלטת ג'ל פלסטיק. מחלקים את השברים בינוני נמוך לקצץ את החלק היחסי הגבוה כ 1 ס"מ מעל צבע תכלת. השתמש חתכים אנכיים מונחה על ידי בכיסים ואת צבע להפריד בין נתיבים שונים (בדוגמה זו 1-4). השביל סמן (מ ') יכול להיות מוכתם צילמו לשלוטגודל לאחר חיתוך. גדלים שבר מסומנים בצד ימין.

איור 4
איור 4. ניתוח של ה-PCR-הגברה ספריות iCLIP cDNA באמצעות ג'ל אלקטרופורזה. RNA התאושש הקרום (איור 1) היה עיבד הפוך גודל מטוהרים באמצעות ג'ל אלקטרופורזה denaturing (איור 2). שלושה שברים בגודל של cDNA (גבוה [ח]: 120-200 nt, בינוני [ז]: 85-120 nt נמוך [יב]: 70-85 NT) נמצאו, circularized, מחדש לינארית ו-PCR מוגבר. מוצרי ה-PCR של התפלגות גודל שונים ניתן לראות כתוצאה של גדלים שונים של שברים קלט. מאז פריימר PCR מציג 76 NT ל cDNA, גדלים צריך לנוע בין 196-276 nt גבוהה, 161-196 NT עבור בינוני 146-161 NT עבור שברים גודל נמוך. מוצרי ה-PCR נעדרים כאשר אין נוגדן שימש immunoprecipitation (נתיבי 1-3).

Discussion

מאז פרוטוקול iCLIP מכיל מגוון רחב של תגובות אנזימטיות צעדים טיהור, זה לא תמיד קל לזהות בעיה כאשר ניסוי נכשל. כדי לשלוט על סגוליות של זיהו RNA צולבות קישור לאתרים, אחד או יותר שולטת שלילי יש לשמור לאורך כל הניסוי להשלים ומנתח חישובית הבאים. בקרות אלה יכולים להיות המדגם ללא נוגדנים, הלא צולבים תאים או immunoprecipitation מתאי בנוקאאוט או רקמה. באופן אידיאלי, ניסויים אלו השליטה לא צריך לטהר את כל מתחמי חלבון-RNA, ולכן צריך לתת שום אות על ג'ל SDS-PAGE, ואין מוצרים לזיהוי לאחר הגברה PCR. תפוקה גבוהה רצף של ספריות אלה לשלוט צריך לחזור רצפים ייחודיים מעט מאוד. תאים מציאה אינם מומלצים כביקורת ריצוף, שכן רצפים וכתוצאה מכך עדיין מתאימות צולבות קישור לאתרים של אותו חלבון, אשר מטוהרים מתאי מציאה בכמויות קטנות יותר.

אמצעי זהירות צריך גם לנקוט כדי למנוע זיהום עם מוצרי ה-PCR מניסויים קודמים. הדרך הטובה ביותר כדי לצמצם בעיה זו היא מרחבית נפרד צעדים לפני ואחרי-PCR. באופן אידיאלי, הניתוח של מוצרי ה-PCR וכל השלבים הבאים יש לבצע בחדר נפרד. יתר על כן, כל חבר צריך להשתמש במעבדה קובע את buffers ו ריאגנטים אחרים. בדרך זו, מקורות זיהום ניתן לזהות בקלות.

Disclosures

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgments

המחברים מודים לכל חברי במעבדות Ule, לאסקומב וזופאן לדיון סיוע ניסיוני. אנו מודים ג'יימס Hadfield ואת ניק מתיוס עבור סידור תפוקה גבוהה. ברצוננו לציין כי השיטה המתוארת כאן iCLIP מניות בכמה צעדים עם פרוטוקול CLIP המקורית, שפותחה על ידי ג'נסן קירק ו JU במעבדה של רוברט דרנל. עבודה זו נתמכה על ידי המועצה האירופית למחקר מענק 206,726-קליפ JU וגם לטווח ארוך גבולות תוכנית אנוש המדע מלגה כדי JK

Materials

Name Company Catalog Number Comments
For gel electrophoresis and membrane transfer we recommend t he use of XCell SureLock® Mini-Cell and XCell IIâ Blot Module Kit CE Mark (Invitrogen, EI0002), which is compatible with the use of the different precast minigels that are specified throughout the protocol. The brand and order number of all materials used is mentioned during the protocol. The list of enzymes used in the protocol is shown in the table below.
Protein A Dynabeads Invitrogen 10001D use protein G for mouse or goat antibody
RNase I Ambion AM2295 activity can change from batch to batch
T4 RNA ligase I New England Biolabs M0204S
PNK New England Biolabs M0201S
proteinase K Roche Group 03115828001
Superscript III reverse transcriptase Invitrogen 18080044
Circligase II Epicentre Biotechnologies CL9021K
FastDigest® BamHI Fermentas FD0054
AccuPrime™ SuperMix I Invitrogen 12342010 this PCR mix gives the best results in our hands

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Keene, J. D. RNA regulons: coordination of post-transcriptional events. Nat Rev Genet. 8, 533-543 (2007).
  2. Wang, Z., Burge, C. B. Splicing regulation: from a parts list of regulatory elements to an integrated splicing code. RNA. 14, 802-813 (2008).
  3. Trifillis, P., Day, N., Kiledjian, M. Finding the right RNA: identification of cellular mRNA substrates for RNA-binding proteins. RNA. 5, 1071-1082 (1999).
  4. Brooks, S. A., Rigby, W. F. Characterization of the mRNA ligands bound by the RNA binding protein hnRNP A2 utilizing a novel in vivo technique. Nucleic Acids Res. 28, E49-E49 (2000).
  5. Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Lager, P. J., Keene, J. D. Identifying mRNA subsets in messenger ribonucleoprotein complexes by using cDNA arrays. Proc Natl Acad Sci. 97, 14085-14090 (2000).
  6. Mili, S., Steitz, J. A. Evidence for reassociation of RNA-binding proteins after cell lysis: implications for the interpretation of immunoprecipitation analyses. RNA. 10, 1692-1694 (2004).
  7. Ule, J. CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain. Science. 302, 1212-1215 (2003).
  8. Ule, J., Jensen, K., Mele, A., Darnell, R. B. CLIP: A method for identifying protein-RNA interaction sites in living cells. Methods. 37, 376-386 (2005).
  9. Licatalosi, D. D. HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing. Nature. 456, 464-469 (2008).
  10. Yeo, G. W. An RNA code for the FOX2 splicing regulator revealed by mapping RNA-protein interactions in stem cells. Nat Struct Mol Biol. 16, 130-137 (2009).
  11. Urlaub, H., Hartmuth, K., Lührmann, R. A two-tracked approach to analyze RNA-protein crosslinking sites in native, nonlabeled small nuclear ribonucleoprotein particles. Methods. 26, 170-181 (2002).
  12. König, J. iCLIP reveals the function of hnRNP particles in splicing at individual nucleotide resolution. Nat Struct Mol Biol. 17, 909-915 (2010).

Tags

ביולוגיה של התא גיליון 50 רנ"א וביוכימיה transcriptome ביולוגיה של מערכות RNA-חלבון מחייב

Erratum

Formal Correction: Erratum: iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution
Posted by JoVE Editors on 07/14/2011. Citeable Link.

A correction was made to iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution. There was an error in part 2 of step 3. One of the characters had the incorrect symbol and was corrected to:

"...as well as 2 μl Turbo DNase..."

instead of:

"...as well as 2 ml Turbo DNase..."

iCLIP - Transcriptome רחב מיפוי של חלבון-RNA אינטראקציות עם רזולוציה נוקלאוטיד יחיד
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Konig, J., Zarnack, K., Rot, G.,… More

Konig, J., Zarnack, K., Rot, G., Curk, T., Kayikci, M., Zupan, B., Turner, D. J., Luscombe, N. M., Ule, J. iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution. J. Vis. Exp. (50), e2638, doi:10.3791/2638 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter