iClip - transcriptoma en todo el mapeo de la proteína-ARN interacciones con la Resolución de nucleótidos individuales

Summary

La disposición espacial de ARN-proteínas de unión en una transcripción es un determinante clave de la regulación post-transcripcional. Por lo tanto, hemos desarrollado cada nucleótido reticulación UV resolución y inmunoprecipitación (iClip) que permite que precisa todo el genoma de mapeo de los sitios de unión de una proteína de unión al ARN.

Abstract

La composición y disposición espacial de los ARN-proteínas de unión (prácticas comerciales restrictivas) en una transcripción guía de los diversos aspectos de la regulación post-transcripcional ^1. Por lo tanto, un paso esencial hacia la comprensión de la regulación transcripción a nivel molecular consiste en obtener información de posición en los sitios de unión de las prácticas comerciales restrictivas ^2.

Las interacciones proteína-ARN puede ser estudiado con métodos bioquímicos, pero estos métodos no se ocupan de unión al ARN en su contexto celular de origen. Los primeros intentos de estudiar el ARN-proteína complejos en su entorno celular empleado purificación por afinidad o inmunoprecipitación combinadas con pantalla diferencial o de análisis de microarrays (RIP-CHIP) ^3-5. Estos enfoques son propensos a la identificación de interacciones directas e indirectas o no ^{fisiológico-6.} Con el fin de aumentar la especificidad y la resolución de posición, una estrategia conocida como CLIP (UV entrecruzamiento e inmunoprecipitación) se introdujo ^7,8. SEGMENTO combina UV entrecruzamiento de las proteínas y las moléculas de ARN con esquemas de purificación riguroso incluyendo electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante. En combinación con las tecnologías de secuenciación de alto rendimiento, CLIP ha demostrado ser una poderosa herramienta para estudiar las interacciones proteína-ARN en un genoma de gran escala (en adelante, HITS-CLIP o CLIP-ss) ^9,10. Recientemente, PAR-CLIP se introdujo que utiliza análogos fotorreactivos ribonucleósido para la reticulación ^11,12.

A pesar de la alta especificidad de los datos obtenidos, los experimentos clip suelen generar bibliotecas de cDNA de la secuencia de complejidad limitada. Esto es en parte debido a la cantidad limitada de co-ARN purificado y las dos reacciones ineficientes ligadura de ARN necesario para la preparación de la biblioteca. Además, los ensayos de extensión del cebador indicó que muchos ADNc truncado prematuramente en el reticulado de nucleótidos ^13. Tal ADNc truncado se pierden durante el protocolo de preparación del clip de la biblioteca estándar. Recientemente hemos desarrollado iClip (individual-nucleótidos clip de resolución), que captura el ADNc truncado mediante la sustitución de uno de los pasos intermolecular ineficiente ligadura de ARN con una más eficiente circularización intramolecular cDNA (Figura 1) ^14. Es importante destacar que la secuenciación del ADNc truncado proporciona información detallada sobre la posición del sitio de enlace cruzado con una resolución de nucleótidos. Hemos aplicado con éxito para estudiar iClip hnRNP organización de partículas C en un genoma de gran escala y evaluar su papel en la regulación de empalme ^14.

Protocol

1. UV entrecruzamiento de las células de cultivo de tejidos

1. Retire el papel y añadir 6 ml de helado de PBS a las células cultivadas en una placa de 10 cm (suficiente para tres experimentos).
2. Retire la tapa y colocar en hielo. Irradiar una vez con 150 mJ / cm ² a 254 nm.
3. Recoger las células mediante el raspado con una grúa móvil.
4. Transferencia de 2 ml de suspensión celular a cada uno de tres microtubos. Giran a velocidad máxima durante 10 segundos a 4 ° C para precipitar las células, a continuación, retire el sobrenadante.
5. Complemento congelar los gránulos de las células en hielo seco y almacenar a -80 ° C hasta su uso.

2. Bolas de preparación

1. Añadir 100 ml de la proteína A Dynabeads (Dynal, 100.02) por cada experimento para un microtubo nuevo (uso de la proteína G Dynabeads de un ratón o anticuerpos de cabra).
2. Lávese las cuentas de 2x con buffer de lisis (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS, 0,5% desoxicolato de sodio, 1 / 100 inhibidor de la proteasa cóctel III, Calbiochem).
3. Volver a suspender las bolas en 100 l de tampón de lisis con el anticuerpo 2.10 mg.
4. Gire los tubos a temperatura ambiente durante 30-60 min.
5. Lave 3 veces con 900 l de buffer de lisis y dejar en el último lavado, hasta que esté listo para continuar con el paso 4.1.

3. Lisis celular y la digestión parcial del ARN

1. Resuspender el botón celular en 1 ml de solución amortiguadora de lisis y la transferencia de 1,5 ml microtubos.
2. Prepare una dilución de 1 / 500 de RNasa I (Ambion, AM2295). Añadir 10 l de RNasa dilución I, así como 2 l Turbo DNasa para el lisado celular (1 / 500 diluciones RNasa I [bajo RNasa] se utilizan para la preparación de la biblioteca, 1 / 50 diluciones [alta RNasa] son ​​necesarios para el control de la especificidad de anticuerpos) .
3. Incubar las muestras de exactamente 3 minutos a 37 ° C, agitando a 1100 rpm. Transferir inmediatamente a hielo.
4. Girar a 4 ° C y 22.000 g durante 20 minutos para eliminar el lisado. Recoger cuidadosamente el sobrenadante (dejar unos 50 l de lisado con la pastilla).

4. Inmunoprecipitación

1. Quitar el tampón de lavado de los granos (a partir del paso 2.5), a continuación, añadir el lisado celular (del paso 3.4).
2. Girar las muestras durante 2 horas a 4 ° C.
3. Descartar el sobrenadante y lavar los granos con 2x 900 l alto contenido de sal buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 0,1% SDS, 0,5% desoxicolato de sodio).
4. Lavar 2 veces con 900 l de tampón de lavado (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM MgCl _2, 0,2% Tween-20).

5. Desfosforilación de 3'ends ARN

1. Descartar el sobrenadante y resuspender las cuentas en 20 l de mezcla PNK (15 l de agua, 4 pH 6,5 l 5x PNK buffer [350mMTris-HCl, pH 6,5; 50mMMgCl 25mMdithiothreitol _2], 0,5 l enzima PNK, 0,5 l RNasin [Promega]).
2. Incubar durante 20 min a 37 ° C.
3. Añadir 500 l de tampón de lavado y lavado 1X con alto contenido de sal de amortiguación.
4. Lavar 2 veces con tampón de lavado.

6. La ligadura de enlazador para ARN 3 '

1. Retire con cuidado el sobrenadante y resuspender las cuentas en 20 l mezcla de ligación (9 l de agua; 4 buffer l ligadura de 4x [200 mMTris-HCl; MM GCL 40m _2, 40 mM ditiotreitol], 1 l de ARN ligasa [ORC], 0,5 l RNasin [Promega], 1,5 l de pre-adenilado enlazador L3 [20 m]; 4 l PEG400 [81170, Sigma]).
2. Incubar toda la noche a 16 ° C.
3. Añadir 500 l de tampón de lavado y lavar 2 veces con 1 ml de buffer de alto contenido de sal.
4. Lavar 2 veces con 1 ml de solución de lavado y dejar en 1 ml del segundo lavado.

7. Etiquetado de ARN extremo 5 '

1. Eliminar el sobrenadante y resuspender las bolas en 8 l de mezcla en caliente PNK (0,4 l PNK [ORC], 0,8 l ³² P-γ-ATP, 0,8 l de amortiguación 10 veces PNK [ORC], 6 l de agua).
2. Incubar durante 5 min a 37 ° C.
3. Retire la mezcla PNK caliente y volver a suspender las bolas en 20 l de tampón de carga 1x NuPAGE (Invitrogen).
4. Incubar en un termomezclador a 70 ° C durante 10 min.
5. Coloque inmediatamente en un imán para precipitar las cuentas vacías y cargar el sobrenadante en el gel (vea el paso 8).

8. SDS-PAGE y la transferencia de la membrana

1. Cargar las muestras en un NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Use 0,5 l de 1x MOPS funcionamiento de amortiguación (Invitrogen). También carga de 5 l de un marcador de proteína pre-teñido de tamaño (por ejemplo: página gobernante más, Fermentas, SM1811).
2. Dejar correr el gel durante 50 minutos a 180 V.
3. Quitar la parte frontal de gel y desechar los residuos sólidos (libre contiene ATP radiactivo).
4. La transferencia de los complejos ARN-proteína del gel a una membrana de nitrocelulosa utilizando el aparato de transferencia de Novex húmeda de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen, la transferencia de 1 hora a 30 V).
5. Después de la transferencia, lavar la membrana en tampón PBS, luego se envuelve en el abrigo de saran y exponerla a una película Fuji a -80 ° C (coloque una pegatina fluorescente al lado de la membrana para alinear más tarde tque el cine y la membrana, realizar exposiciones durante 30 minutos, 1 hora y durante la noche).

9. Aislamiento de ARN

1. Aislar los complejos ARN-proteína en el experimento bajo RNasa utilizando la autorradiografía del paso 8.5 como una máscara. Cortar este trozo de la membrana en varias rodajas y colocarlas en un microtubo de 1.5 ml.
2. Añadir 200 l PK buffer (100 mM Tris-HCl pH 7,4, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA) y 10 l de proteinasa K (Roche, 03115828001) a las piezas de la membrana. Incubar con agitación a 1100 rpm durante 20 minutos a 37 ° C.
3. Añadir 200 ul de buffer PKurea (100 mM Tris-HCl pH 7,4, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 7 M urea) y se incuba durante 20 min a 37 ° C.
4. Recoger la solución y añadir junto con 400 l de fenol / cloroformo (Ambion, 9722) a un tubo de 2 ml de fase de bloqueo Gel pesados ​​(713 a 2.536, VWR) de ARN.
5. Incubar durante 5 min a 30 ° C, agitando a 1100 rpm. Separar las fases girando durante 5 minutos a 13.000 rpm a temperatura ambiente.
6. La transferencia de la capa acuosa a un tubo nuevo (con cuidado de no tocar el gel con la pipeta). Añadir 0,5 l glycoblue (Ambion, 9510) y 40 l de sodio 3 M pH 5,5 acetato y mezclar. Luego, agregue 1 ml de etanol al 100%, mezcla de nuevo y se precipitan por la noche a -20 ° C.

10. La transcripción inversa

1. Girar durante 20 minutos a 15.000 rpm y 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y lavar el precipitado con 0,5 ml de etanol al 80%.
2. Resuspender el precipitado en 7,25 l de ARN / mezcla de cebadores (6,25 l de agua, 0,5 imprimación Rclip l [0.5pmol/μl], 0,5 l de mezcla dNTP [10 mM]). Para cada experimento o reproducir, utilizar una imprimación Rclip diferentes que contienen las secuencias individuales de código de barras (ver 14).
3. Incubar durante 5 min a 70 ° C antes de enfriar a 25 ° C.
4. Añadir 2,75 l mezcla RT (2 l 5x buffer RT, 0,5 l 0,1 M TDT, 0,25 l Superíndice III de la transcriptasa inversa [Invitrogen]).
5. Incubar 5 min a 25 ° C, 20 min a 42 ° C, 40 min a 50 ° C y 5 min a 80 ° C antes de la refrigeración a 4 ° C.
6. Añadir 90 l de buffer TE, 0,5 l glycoblue y 10 l de acetato de sodio pH 5,5 y mezclar. A continuación, añadir 250 l de etanol 100%, mezcla de nuevo y se precipitan por la noche a -20 ° C.

11. Gel de purificación de cDNA

1. Decantar y lavar las muestras (véase 10.1), a continuación, volver a suspender las pastillas en 6 l de agua.
2. Añadir 6 l 2x TBE-urea tampón de carga (Invitrogen). Muestras de calor a 80 ° C durante 3 minutos antes de cargar directamente.
3. Cargar las muestras en un 6% prefabricado TBE-urea gel (Invitrogen) y una duración de 40 minutos a 180 V como se describe por el fabricante. También carga un marcador de bajo peso molecular para el corte posterior (ver más abajo).
4. Corte tres bandas en 120-200 nt (alto), 85-120 nt (medio) y 70-85 nt (bajo). Use theupper tinte y las marcas en el soporte de gel de plástico para guiar a la escisión (ver Figura 3). Tenga en cuenta que el primer Rclip y la secuencia de L3 en conjunto representan el 52 nt de la secuencia de CLIP.
5. Añadir 400 l de TE y aplastar la rebanada de gel en pequeños trozos con un émbolo de jeringa de 1 ml. Incubar con agitación a 1100 rpm durante 2 horas a 37 º C.
6. Coloque dos de 1 cm de vidrio pre-filtro (Whatman, 1823010) en una columna de Costar Spinx (Corning Incorporated, 8.161). La transferencia de la porción líquida de la muestra a la columna. Giro de 1 min a 13.000 rpm en un tubo de 1.5 ml.
7. Añadir 0,5 l glycoblue y 40 l de acetato de sodio pH 5,5, a continuación, mezclar la muestra. Añadir 1 ml de etanol al 100%, mezcla de nuevo y se precipitan por la noche a -20 ° C.

12. La ligadura de imprimación para el extremo 5 'del cDNA

1. Decantar y lavar las muestras (véase 10.1), a continuación, volver a suspender las pastillas en ocho mezcla de ligación l (6,5 l de agua, 0,8 l de 10x CircLigase Buffer II, 0,4 l 50 mM _MnCl2 de 0,3 l; Circligase II [Epicentro]) e incubar durante 1 hora a 60 ° C.
2. Añadir 30 l de mezcla oligo recocido (26 l de agua, 3 Buffer FastDigest l [Fermentas], 1 l cut_oligo [10 m]). Incubar durante 1 min a 95 ° C. Luego disminuir la temperatura cada 20 segundos en 1 ° C hasta 25 ° C se alcanzan.
3. Añadir 2 l BamHI (Fast Fermentas) e incubar durante 30 min a 37 ° C.
4. Añadir 50 l de TE y 0,5 l glycoblue y mezclar. Añadir 10 l de acetato de sodio pH 5,5 y mezclar, luego añadir 250 l de etanol al 100%. Mezclar de nuevo y se precipitan por la noche a -20 ° C.

13. Amplificación por PCR

1. Decantar y lavar las muestras (véase 10.1), a continuación, volver a suspender el pellet en 19 l de agua.
2. Prepare la mezcla de PCR (19 l cDNA, 1 l de mezcla manual P5/P3 Solexa, 10 M cada uno, 20 Accuprime l Supermix una enzima [Invitrogen]).
3. Ejecute el siguiente programa de PCR: 94 ° C durante 2 minutos, [94 ° C durante 15 segundos, 65 ° C durante 30 segundos, 68 ° C durante 30 segundos] _{25-35 ciclos,} 68 ° C durante 3 min, 4 ° C para siempre.
4. Mix 8 l producto de PCR con 2 l de tampón 5x carga TBE y la carga en un 6% prefabricado gel de TBE (InvitRogen). Tinción del gel con Sybrgreen I (Invitrogen) y analizar con una cámara de gel.
5. El código de barras en las cartillas Rclip permiten a las muestras de multiplex diferentes antes de la presentación para la secuenciación de alto rendimiento. Presentar 15 l de la biblioteca para la secuenciación y guardar el resto.

14. Enlazador y el primer secuencias

ADN linker Pre-adenilado 3 ':

[Se para el adaptador de ADN de IDT y luego hacer alícuotas de 20μM.]

15. Los resultados representativos:

Antes de la secuenciación de la biblioteca iClip, el éxito de la experiencia puede ser controlado en dos etapas: la autorradiografía del complejo proteína-ARN después de la transferencia de membrana (paso 8.5) y la imagen de gel de los productos de la PCR (paso 13,4). En la autorradiografía de las muestras de baja RNasa, la radioactividad difusas debe ser visto por encima del peso molecular de la proteína (Figura 2, muestra 4). De alta RNasa muestras, la radiactividad se concentra cerca del peso molecular de la proteína (Figura 2, muestra 3). Cuando no hay anticuerpos se utiliza en la inmunoprecipitación, no hay ninguna señal debe ser detectado (Figura 2, las muestras 1 y 2). Aún más los controles importantes para la especificidad de la inmunoprecipitación o bien omitir la radiación UV o células uso que no expresan la proteína de interés ^14.

La imagen de gel de los productos de PCR (paso 13,4) debería mostrar un rango de tamaño que corresponde a la fracción de cDNA (alta, media o baja) purificada en el paso 11.4 (Figura 4, carriles 4-6). Tenga en cuenta que los cebadores de PCR P3Solexa y P5Solexa introducir un adicional de 76 nt con el tamaño de la DNA. Si no hay anticuerpos se utiliza durante la inmunoprecipitación, no correspondientes productos PCR deben ser detectados (Figura 4, carriles 1-3). Primer producto dímero puede aparecer a unos 140 nt.

Para obtener resultados representativos de alto rendimiento de secuenciación y posterior análisis bioinformáticos ver ^14.

Figura 1. Representación esquemática del protocolo de iClip. ARN en proteínas son complejos de enlaces cruzados covalentes en vivo, utilizando la radiación ultravioleta (paso 1). La proteína de interés se purifica, junto con el ARN unido (pasos 2-5). Para tener en cuenta la secuencia específica de cebado de la transcripción inversa, un adaptador de ARN se liga a los 3 'del ARN, mientras que el extremo 5' es marcado radiactivamente (pasos 6 y 7). Reticulado ARN-proteína complejos se purifican a partir de ARN libre uso de SDS-PAGE y la transferencia de la membrana (paso 8). El ARN se recupera de la membrana por la digestión de la proteína con proteinasa K dejando un polipéptido que permanecen en la cruz-link nucleótidos (paso 9). La transcripción inversa (RT) trunca en el polipéptido restantes y se introducen dos regiones adaptador escindibles y las secuencias de código de barras (paso 10). Selección del tamaño elimina sin imprimación RT antes de circularización. La linealización siguiente genera plantillas adecuadas para la amplificación por PCR (pasos 11-15). Por último, la secuenciación de alto rendimiento genera lee en el que las secuencias de códigos de barras son inmediatamente seguido por el último nucleótido del cDNA (paso 16). Desde esta posición coloca un nucleótido aguas arriba de la secuencia de nucleótidos reticulado, el sitio de unión se puede deducir con alta resolución.

Figura 2. Autorradiografía de reticulado hnRNP C-ARN complejos mediante electroforesis en gel de desnaturalización y transferencia de la membrana. hnRNP C-ARN complejos se inmuno-purificada a partir de extractos de células utilizando un anticuerpo contra hnRNP C (α hnRNP C, las muestras 3 y 4). ARN fue parcialmente digerido con baja (+) o alto (+ +) la concentración de RNasa. Complejos de cambio hacia arriba desde el tamaño de la proteína (40 kDa) se puede observar (muestra 4). El cambio es menos pronunciada cuando las altas concentraciones de RNasa se utilizaron (muestra 3). La señal radioactiva desaparece cuando no hay anticuerpos se utilizó en la inmunoprecipitación (muestras 1 y 2).

Figura 3. Esquema 6% TBE-urea gel (Invitrogen) para guiar la extirpación de los productos iClip cDNA. El gel se ejecuta durante 40 minutos a 180 V que lleva a un patrón de migración reproducible de ADNc y colorantes (luz y de color azul oscuro) en el gel. Use una hoja de afeitar para cortar (línea roja) de la altura (H), media (M) y bajo (L) las fracciones de cDNA. Comience por cortar en la mitad de la tinta de color azul claro y justo encima de la marca en la cinta de gel de plástico. Divide las fracciones de media y baja y el ajuste de la fracción de alto alrededor de 1 cm por encima del tinte de color azul claro. Use cortes verticales guiados por los bolsillos y el tinte para separar las distintas filas (en este ejemplo 1-4). El carril de la marca (m) puede ser teñido y fotografiado para controlartamaños después del corte. Tamaños de los fragmentos se indican a la derecha.

Figura 4. Análisis de la PCR-amplificación de las bibliotecas iClip cDNA mediante electroforesis en gel. ARN se recuperó de la membrana (Figura 1) se transcriben de forma inversa y el tamaño purificado mediante electroforesis en gel desnaturalizante (Figura 2). Tres fracciones de tamaño de cDNA (alta [H]: 120-200 nt, mediano [M]: 85-120 nt y bajo [L]: 70-85 nt) fueron recuperados, circularizado, re-lineal y de amplificación de PCR. Los productos de PCR de la distribución de diferentes tamaños se puede observar como resultado de los diferentes tamaños de las fracciones de entrada. Desde el primer PCR presenta 76 nt con el cDNA, tamaño debe oscilar entre 196 a 276 nt de alto, 161 a 196 nt de mediano y 146-161 nt de fracciones de tamaño bajo. Los productos de PCR están ausentes cuando no de anticuerpos se utilizó para la inmunoprecipitación (carriles 1-3).

Discussion

Dado que el protocolo iClip contiene una amplia gama de reacciones enzimáticas y purificación, que no siempre es fácil identificar un problema cuando un experimento falla. Para el control de la especificidad de identificar ARN entrecruzar los sitios, uno o más controles negativos se debe mantener durante todo el experimento completo y posterior análisis computacional. Estos controles pueden ser la muestra de no-anticuerpos, las células no-reticulado, o inmunoprecipitación de células knock-out o tejido. Idealmente, estos experimentos de control no deben purificar los complejos ARN-proteína, y por lo tanto no deben dar la señal en el gel SDS-PAGE, y ningún producto detectable después de la amplificación por PCR. De alto rendimiento de secuenciación de las bibliotecas de control debe volver secuencias únicas muy pocos. Desmontables células no se recomiendan como un control de secuencia, ya que las secuencias resultantes todavía corresponden a los sitios de enlace transversal de la misma proteína, que se purifica a partir de células caída en cantidades más pequeñas.

Precauciones deben ser tomadas para evitar la contaminación con productos PCR de los experimentos anteriores. La mejor manera de minimizar este problema consiste en separar espacialmente las medidas pre-y post-PCR. Idealmente, el análisis de los productos de PCR y todos los pasos posteriores se deben realizar en una habitación separada. Además, cada miembro del laboratorio debe utilizar su propio conjunto de buffers y otros reactivos. De esta manera, las fuentes de contaminación puede ser más fácil identificarse.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
For gel electrophoresis and membrane transfer we recommend t he use of XCell SureLock® Mini-Cell and XCell IIâ Blot Module Kit CE Mark (Invitrogen, EI0002), which is compatible with the use of the different precast minigels that are specified throughout the protocol. The brand and order number of all materials used is mentioned during the protocol. The list of enzymes used in the protocol is shown in the table below.
Protein A Dynabeads	Invitrogen	10001D	use protein G for mouse or goat antibody
RNase I	Ambion	AM2295	activity can change from batch to batch
T4 RNA ligase I	New England Biolabs	M0204S
PNK	New England Biolabs	M0201S
proteinase K	Roche Group	03115828001
Superscript III reverse transcriptase	Invitrogen	18080044
Circligase II	Epicentre Biotechnologies	CL9021K
FastDigest® BamHI	Fermentas	FD0054
AccuPrime™ SuperMix I	Invitrogen	12342010	this PCR mix gives the best results in our hands