Summary
Ce protocole vidéo montre comment faire de la discrimination et d'énumérer bona fide des cellules souches neurales dans une population mixte de cellules précurseurs neurales utilisant le test sur des cellules neurales formant colonie.
Abstract
Le dosage de Neurosphère (NSA) est l'une des méthodes les plus fréquemment utilisées pour isoler, d'élargir et aussi calculer la fréquence des cellules souches neurales (NSC). Par ailleurs, ce système de culture sans sérum a également été employé pour développer des cellules souches et de déterminer leur fréquence d'une variété de tumeurs et les tissus normaux. Il a été démontré récemment qu'une relation un-à-un n'existe pas entre la formation et de Neurosphère NSCs. Cela suggère que la NSA tel qu'appliqué actuellement, surestime la fréquence des CNS dans une population mixte de cellules précurseurs neurales isolées à la fois du cerveau embryonnaire et adulte des mammifères. Cette vidéo montre pratiquement un roman basé collagène semi-solide de dosage, les neurones formant colonie test sur des cellules (N-ACCP), qui a la capacité à discriminer proviennent de cellules progénitrices en fonction de leur potentiel à long terme de prolifération, et fournit ainsi une méthode d'énumérer la fréquence NSC. Dans le N-ACCP, les colonies ≥ 2 mm de diamètre sont dérivées de cellules qui répondent à tous les critères fonctionnels d'un CNS, alors colonies <2mm sont dérivées de progéniteurs. La procédure de N-ACCP peut être utilisé pour les cellules préparées à partir de différentes sources, y compris les adultes primaires et cultivé ou embryonnaires de souris des cellules du SNC. Ici, nous utilisons des cellules préparées à partir seul passage neurosphères générés par jour embryonnaire du cerveau des souris 14 pour effectuer la N-ACCP. Les cultures sont reconstituées avec des moyennes de prolifération tous les sept jours pendant trois semaines pour permettre aux cellules plaquées à exposer leur plein potentiel prolifératif puis la fréquence des progénitrices neurales et de bonne foi des cellules souches neurales sont calculées respectivement en comptant le nombre de colonies qui sont <2mm et ceux qui sont ≥ 2mm en référence au nombre de cellules qui ont été initialement plaqué.
Protocol
1. Éléments qui doivent être préparés Avant de procéder à Placage Cellulaire:
- Volume approprié de milieu complet NSC est préparée en mélangeant NeuroCult NSC moyen basale et NeuroCult NSC Suppléments prolifération à un ratio 9:1, respectivement.
- Une aliquote de NeuroCult NCFC milieu sans sérum, sans cytokines est décongelé.
- Le milieu est chauffé dans un bain d'eau à 37 ° C.
- Les solutions mères du facteur de croissance épidermique (EGF), facteur de croissance basique fibroblastique (b-FGF) à la concentration de 10 pg / mL et héparine à 0,2% sont préparés à l'avance.
- Selon la taille expérimentation, plusieurs boîtes de culture tissulaire de 35 mm sont nécessaires à l'assiette des cellules et un plat en plastique 150-200cm de Petri est également nécessaire de tenir les plats double de 35mm et un troisième plat 35mm d'eau.
2. Préparation des cellules:
Selon votre expérience, les cellules peuvent être préparés à partir d'une source adultes ou embryonnaires (primaire ou de tissu dissocié neurosphères dissociées). Disséquer les tissus de l'adulte / embryons de souris du système nerveux central (SNC) ou dissocier neurosphères adulte / embryonnaires dérivées comme décrit précédemment 1,2 et ensuite:
- La suspension cellulaire unique est passé à travers un filtre à mailles de 40 um de taille de manière à supprimer non dissociée des touffes.
- 10 ul de la suspension cellulaire est mélangé avec 90μl de bleu trypan pour effectuer un comptage des cellules. Remarque: D'autres dilutions cellule appropriée peut également être utilisé.
- Si vous utilisez embryonnaire ou adulte primaires dérivées des cellules neurales, diluer la suspension cellulaire à une concentration de 6,5 x 10 5 cellules / ml dans un milieu complet NSC. Si utilisant des cellules de neurosphères dissociées provenant adultes ou embryonnaires des cellules neurales, diluer la suspension cellulaire à une concentration de 2,2 x 10 5 cellules / ml dans un milieu complet NSC.
3. Cellules Placage des semi-solide N-ACCP moyen:
- Le volume approprié des composants suivants sont mélangés dans l'ordre, selon le nombre de répétitions. Ici, nous mélanger la quantité nécessaire pour deux répétitions ou de dupliquer des plats. Pour les nombres de répétitions supplémentaires, s'il vous plaît se référer au tableau 1.
- 1,7 ml de NeuroCult NCFC milieu sans sérum, sans cytokines
- 330 uL de suppléments NeuroCult prolifération NSC
- 6,6 uL d'EGF (10μg/mL)
- 32 uL de pénicilline / streptomycine
- 3,3 uL de b-FGF (10μg/mL) requis uniquement si la culture de cellules dérivées de cellules neurales adultes.
- 3,3 uL de l'héparine (0,2%) requis uniquement si la culture de cellules dérivées de cellules neurales adultes.
- 25 pi de suspension cellulaire (de 2,2 x 10 5 cellules / ml à partir des cellules neurosphères dissociées ou 6,5 x 10 5 cellules / ml de cellules primaires à partir de tissus du système nerveux central dissocié). Note: Les numéros de cellulaire finale plaquée devrait être d'environ 2500 cellules par boîte de 35 mm de la culture pour les cellules dérivées Neurosphère et 7500 cellules par boîte de 35 mm pour la culture de cellules primaires. Dans certains cas, la densité cellulaire finale plaquage doit être ajustée en effectuant une expérience de titrage cellule. Pour les analyses statistiques, le nombre total de colonies détectées après 21 jours de culture doit être dans la plage d'au moins 50 à 150 colonies.
- Le milieu contenant les cellules est mélangé doucement puis 1,3 ml de solution de collagène froid est transféré à la suspension cellulaire et bien mélangés par pipetage doux pour éviter d'introduire des bulles.
- La solution mixte est dispensé au centre de chaque boîte de culture 35mm (~ 1,5 ml / boîte) et les plats sont inclinés en douceur en utilisant un mouvement circulaire pour laisser le mélange réparti uniformément sur la surface du plat. .
- Les 35 boîtes de culture reproduire mm sont placés dans une plaque de Pétri de 100 mm. Le couvercle de la nouvelle boîte de 35 mm est enlevé et la capsule ouverte est également placé dans le même plat de Pétri de 100 mm. L'eau stérile est ajoutée à cette boîte de 35 mm ouverte pour maintenir l'humidité optimale pendant la période d'incubation. Bioessai plaques carrées (245 mm) sont utilisés lorsque plus de reproduire des boîtes de 35 mm ont été mis en place. Encore une fois, comprennent 2 ou 3 boîtes de 35 mm ouvert contenant de l'eau stérile.
- Les plaques sont transférées à un incubateur réglé à 37 ° C, 5% de CO2 et 95% d'humidité. Le collagène fige en augmentant la température et la formation de gel se fera dans environ une heure. Les cultures ne devraient pas être dérangé pendant ce temps.
- Les cellules cultivées sont incubées pendant 21 jours (les différences de taille des colonies peuvent être clairement distingués, après 21 jours).
4. Préparation moyen reconstitution et de Nourrir la culture:
Comme la N-ACCP cultures sont incubées pendant une longue période de temps (21 jours), les cultures doivent être nourris avec les NeuroCult appropriée complète moyennes de réapprovisionnement fraîchement préparés comme suit:
- 4,5 ml de NeuroCult NSC milieu de base est mélangée avec 0,5 mL de suppléments NeuroCult prolifération NSC et ensuite les facteurs de croissance est ajouté:
- 250 ul d'10μg/mL EGF (pour donner une concentration finale de 0,5 pg / ml EGF)
- 125 ul d'10μg/mL b-FGF (pour donner une concentration finale de 0.25μg/mL b-FGF) requis uniquement si la culture de cellules dérivées de cellules neurales adultes.
- 125 ul d'héparine de 0,2%, requis uniquement si la culture de cellules dérivées de cellules neurales adultes.
- 60 uL du milieu approprié NeuroCult complète reconstitution (pour les cellules embryonnaires ou adultes) est ajouté dans le centre de chaque plat Assay NCFC fois tous les 7 jours pendant l'incubation toute Assay NCFC la culture (21 jours).
5. Scoring colonies Assay N-CFC dérivés et calcul de la fréquence de bonne NSCs Fide et cellules progénitrices neurales:
- Chaque plat de 35 mm de la culture est placée sur un plat notation quadrillées avec la taille de grille de 2,0 mm x 2,0 mm, puis les deux plats sont placés sur la platine du microscope.
- L'utilisation de faible puissance (2.5X - 5X) lentille d'objectif, chaque plat est numérisé et les colonies sont marqués en fonction de leurs tailles.
- Les colonies sont classés en deux grandes catégories:
- Moins de 2 mm de diamètre
- Diamètre ≥ 2 mm
6. Les résultats représentatifs:
Comme dans l'essai Neurosphère, cellules étalées dans le N-CFC test commencent à proliférer et de faire de petites colonies de cellules dans les 3 - 7 jours après le placage (figure 1). Dans deux semaines, des colonies de tailles différentes peuvent être distinguées. Bien que la majorité des colonies ont tendance à cesser de croître après 14 jours, certaines colonies continuent à augmenter en taille. En 21 jours, les colonies peuvent être classés dans l'une des quatre catégories: 1) moins de 0,5 mm de diamètre, 2) 0,5 - 1 mm de diamètre, 3) 1 - 2 mm de diamètre et 4) ≥ 2mm de diamètre. Pratiquement, les colonies plus petites que 2 mm de diamètre sont considérés comme des dérivés progénitrices (figure 2) et les colonies ≥ 2mm de diamètre sont considérés comme des dérivés NSC (Figure 3). Le nombre de colonies ≥ 2mm de diamètre par nombre total de cellules plaquées, représente la fréquence de la réelle bonne foi des cellules souches neurales à long terme d'auto-renouvellement et multi-potentiels capacités. Le total faisant Neurosphère fréquence dans une population de cellules particulières après 7-8 jours dans une expérience parallèle NSA a été estimée à être semblable à la colonie formant au total la fréquence de la même population cellulaire après 21 jours dans une expérience N-ACCP. La N-ACCP prévoit toutefois une condition plus permissive afin que chaque cellule peut montrer tout son potentiel prolifératif.
| Composante | 2 répétitions | 3 répétitions | 4 répétitions |
| NeuroCult NCFC milieu sans sérum, sans cytokines | 1700 | 2550 | 3400 |
| NeuroCult NSC Suppléments prolifération | 330 | 495 | 660 |
| EGF (10 pg / ml) | 6.6 | 9.9 | 13,2 |
| bFGF (10 pg / ml), uniquement pour les cellules adultes | 3.3 | 4,95 | 6.6 |
| Solution d'héparine (0,2%), uniquement pour les cellules adultes | 3.3 | 4,95 | 6.6 |
| Pénicilline / streptomycine (1:100) | 32 | 48 | 64 |
| Les cellules à l'adresse: 2,2 x 10 5 cellules cultivées / ml ou 6,5 x 10 5 cellules primaires / mL | 25 | 37,5 | 50 |
| Solution de collagène | 1300 | 1950 | 2600 |
Tableau 1. Composantes de la culture d'essai complète N-CFC.
Figure 1. Colonies représentant de la N-ACCP culture de la souris à un seul passage NSCs E14 7 jours après placage. Les colonies peuvent afficher la morphologie et de taille différentes. Le grossissement est de; 4x
Figure 2. Colonies progénitrices dérivées Représentant de différentes tailles dans la N-ACCP culture de passage on E14 NSCs souris 21 jours après placage. Comme indiqué, les colonies ont une morphologie différente, mais toutes sont à moins de 2 mm de la taille. Le grossissement est de; 4x
Représentant la figure 3. Bona fide de cellules souches dérivées colonie en N-ACCP culture de passage on E14 NSCs souris 21 jours après placage. Colonies de cellules souches dérivées pourrait afficher morphologie différente (voirla vidéo) mais tous sont ≥ 2mm de diamètre. Le grossissement est de; 4x
Discussion
Bien test Neurosphère 3,1,2 est la méthode la plus commune d'isoler et de multiplier des cellules souches neurales provenant de diverses sources comme le tissu du SNC adultes et embryonnaires, il ne peut pas mesurer avec précision la fréquence NSC dans une population mixte de cellules précurseurs neurales (tige et progéniteurs) car il n'existe pas une relation un à un entre le nombre de neurosphères et le nombre de bona fide 4 cellules souches. Pour répondre à cette limitation, l'original NSA a été adapté de manière à permettre l'souches neurales et les progéniteurs de grandir à leur capacité de prolifération complète pendant trois semaines 5-7. Contrairement aux liquides NSA, dans la N-ACCP les colonies sont en fait issus par clonage, comme la matrice de collagène semi-solide empêche la migration des cellules simples plaqués et l'agrégation des colonies. Pour obtenir des résultats compatibles avec ce dosage, nous recommandons:
- Assurer une suspension cellulaire unique dans la suspension de cellules d'origine. Passez votre suspension cellulaire unique à travers un filtre à mailles de 40 um de taille de manière à supprimer non dissociée des touffes.
- Conserver la solution de collagène sur la glace ou dans le frigo 4 ° C. Le collagène est le dernier élément à ajouter au mélange de la suspension cellulaire comme il se fige en augmentant la température.
- N'oubliez pas de nourrir la culture de chaque semaine. Ajout du support de réapprovisionnement contenant un facteur de croissance (s) une fois tous les 7 jours permettra aux cellules de continuer à proliférer au cours de la période de culture prolongée.
- La densité cellulaire finale plaquage ont été optimisés pour des cellules dérivées de cellules primaires soit ou de culture de neurones de telle sorte que le nombre total de colonies détectées après 21 jours de culture dans le NCFC-A est dans la plage d'au moins 50 à 200 colonies. Cette gamme permet la détection des colonies rares NSC dérivés> 2mm de diamètre dans des échantillons tout en offrant un nombre suffisant de colonies pour les analyses statistiques. Selon la source cellulaire de départ, beaucoup moins (<50) et un plus grand nombre de colonies (> 250) sont parfois obtenus. Trop peu de colonies se traduira dans les colonies> 2mm de diamètre étant en dessous des niveaux de détection, tandis que les colonies de trop se traduira par la surpopulation des composants anddepletion milieu de croissance résultant en une colonie comptant inexacts. Par conséquent densité de placage cellulaire devra être ajustée en conséquence (c'est à dire augmenter ou diminuer le nombre total de cellules étalées)
Disclosures
Un des auteurs, Sharon A. Louis, est affilié à StemCell Technologies Inc, un producteur de certains des réactifs utilisés dans cette étude.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu financièrement par la Fondation Overstreet.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| NeuroCult NCFC medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05720 | |
| 0.05% trypsin-EDTA | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Biosciences | 352340 | |
| Pen/Strep | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| Collagen | Reagent | Stem Cell Technologies | 04902 | |
| EGF | Growth factor | R&D Systems | 2028-EG | |
| b-FGF | Growth factor | R&D Systems | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma-Aldrich | H4784 | Reconstituted in PBS |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352070 | |
| 35 mm culture dishes | Culture ware | Stem Cell Technologies | 27100 | |
| Gridded scoring dishes | Culture ware | Stem Cell Technologies | 27500 |
References
- Azari, H., Rahaman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J Vis Exp. , (2010).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahaman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay. J Vis Exp. , (2011).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Louis, S. A. Enumeration of Neural Stem and Progenitor Cells in the Neural Colony Forming Cell Assay. Stem Cells. , (2008).
- Golmohammadi, M. G. Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain. Stem Cells. 26, 979-987 (2008).
- Louis, S. A., Reynolds, B. A. Neurosphere and Neural Colony-Forming Cell Assays. Protocols for Neural Cell Culture. 10, 1-28 (2010).
