Summary
Bu video protokolü iyi niyetli nöral kök hücreler nöral prekürsör hücrelerin koloni oluşturan nöral hücre çalışması ile oluşan karışık bir nüfus nasıl ayrımcılık ve numaralandırmak göstermektedir.
Abstract
Neurosphere assay (NSA), izole, genişletmek ve aynı zamanda nöral kök hücreler (NSC'lerde) sıklığını hesaplamak için en sık kullanılan yöntemlerden biridir. Ayrıca, bu serum serbest kültür sistemi kök hücrelerin çeşitli tümörler ve normal dokuları genişletmek ve sıklığını belirlemek için istihdam edilmiştir. Neurosphere oluşumu ve NSC'lerde arasında bire bir ilişki yok son zamanlarda kanıtlanmıştır. Bu NSA gibi şu anda uygulanan nöral prekürsör hücrelerin embriyonik ve yetişkin memelilerin beyin hem izole karışık bir nüfus NSC'lerde frekans olduğundan yük olduğunu göstermektedir. Bu video neredeyse yarı-katı test tabanlı bir roman kollajen gösterir, sinir koloni böylece uzun vadeli proliferatif potansiyeli dayalı, progenitör hücrelerden kök ayırt etmek yeteneğine sahiptir ve hücre çalışması (N-CFCA) oluşturan bir yöntem sağlar MGK frekans numaralandırmak. N-CFCA, koloniler <2mm atalarıdır türetilmiş ise ≥ 2 mm çapında koloniler MGK tüm fonksiyonel kriterleri karşılayan hücreler türetilmiştir. N-CFCA prosedürü birincil ve kültürlü bir yetişkin ya da embriyonik fare merkezi sinir sistemi hücreleri dahil olmak üzere farklı kaynaklardan hazırlanan hücreler için kullanılabilir. Burada geçit embriyonik gün 14 farelerin beyin üretilen N-CFCA gerçekleştirmek için bir neurospheres hazırlanan hücreleri kullanır. Kültürlerin çoğalması orta ile kaplı hücreler tam proliferatif potansiyeli sergilemek için izin ve daha sonra nöral progenitör ve iyi niyetli sinir kök hücrelerinin sıklığı sırasıyla <2mm kolonilerin sayısı sayarak hesaplanır üç hafta boyunca her yedi günde bir yenileniyor ve ≥ 2mm başlangıçta kaplama hücrelerinin sayısı referans olanlar.
Protocol
1. Hazırlayan: Hücre Kaplama Başlamadan Önce olun gerekiyor Öğeler:
- Tam MGK orta Uygun hacmi, 09:01 oranında NeuroCult MGK Bazal Orta ve NeuroCult MGK Silahların Yayılmasını Önleme Takviyeler sırasıyla karıştırılarak hazırlanır.
- NeuroCult NCFC Serum-Alerjik Orta Sitokinler olmadan bir kısım çözülmüş.
- Orta, 37 ° C su banyosunda ısıtılır.
- Epidermal büyüme faktörü (EGF), 10 mg / ml% 0.2 ve heparin konsantrasyonu temel fibroblastik büyüme faktörü (b-FGF) Stok çözümleri önceden hazırlanır.
- Deney boyutuna bağlı olarak, birkaç 35mm doku kültürü yemekleri plaka hücreleri ve bir 150-200cm plastik Petri kabı da yinelenen 35mm yemekleri tutmak için gerekli olan ve üçüncü bir su 35mm çanak ihtiyaç vardır.
2. Cep Hazırlanışı:
Denemenizi bağlı olarak, hücrelerin embriyonik veya erişkin bir kaynak (birincil ayrışmış bir doku ya da ayrışmış neurospheres) hazırlanabilir. Yetişkin / embriyonik fare merkezi sinir sistemi (MSS) dokular disseke veya daha sonra 1,2 ve daha önce açıklandığı gibi embriyonik türetilen / yetişkin neurospheres ayrıştırmaları:
- Tek hücre süspansiyonu 40 mikron boyutlu gözenekli filtre geçirilir şekilde ayrışmış olmayan kümeleri kaldırmak.
- 10μl hücre süspansiyonu, hücre sayımı gerçekleştirmek için Tripan mavi 90μl ile karıştırılır Not: Diğer uygun hücre dilüsyonları de kullanılabilir .
- Eğer birincil embriyonik veya yetişkin elde edilen sinir hücreleri kullanarak, tam MGK orta 6,5 x 10 5 hücre / ml 'lik bir konsantrasyon hücre süspansiyonu sulandırmak. Hücreleri, yetişkin ya da embriyonik sinir hücrelerinden elde edilen ayrışmış neurospheres kullanıyorsanız, tam MGK orta 2.2 x 10 5 hücre / ml 'lik bir konsantrasyon hücre süspansiyonu sulandırmak .
3. Yarı-katı N-CFCA Orta Kaplama Hücreler:
- Aşağıdaki bileşenlerin uygun hacmi tekerrür sayısına bağlı olarak, sipariş karıştırılır. Burada çoğaltır iki için gerekli miktarı karıştırın veya yinelenen yemekleri. Çoğaltır ek numaraları için, tablo 1'e bakınız.
- Sitokinler olmadan NeuroCult NCFC Serum-Alerjik Orta 1.7 mL
- 330 mcL NeuroCult MGK Silahların Yayılmasını Önleme Takviyeler
- 6.6 mcL EGF (10μg/mL)
- Penisilin / Streptomisin 32 mcL
- B-FGF (10μg/mL) 3.3 mcL hücreleri kültür yetişkin sinir hücrelerinden elde edilen sadece gerekli.
- Heparin (% 0.2) 3.3 mcL hücreleri kültür yetişkin sinir hücrelerinden elde edilen sadece gereklidir.
- Hücre süspansiyonu 25μL (2.2 ayrışmış neurospheres veya 6.5 x 10 5 hücre / mL birincil hücreler ayrışmış MSS dokusu x 10 5 hücre / mL hücreleri) Not: son hücre sayıları kaplama, 35 mm kültürü çanak başına yaklaşık 2500 hücre olmalıdır neurosphere edilen hücreler ve birincil hücreler için 35 mm kültür çanak başına 7500 hücreleri. Bazı durumlarda, nihai hücre kaplama yoğunluğu bir hücre titrasyon deneyi yaparak ayarlanması gerekir. 150 koloniler istatistiksel analizler için, kültür 21 gün sonra tespit edilen kolonilerin toplam sayısı en az 50 aralığında olmalıdır.
- Içeren hücreler orta 1.3 mL soğuk Kollajen çözüm hücre süspansiyonu aktarılır ve herhangi bir kabarcıkları tanıtan önlemek için yumuşak pipetleme iyice karıştırılır ve sonra hafifçe karıştırılır.
- Karma çözüm her 35mm kültür çanak (~ 1.5 mL / çanak) merkezi dağıtılır ve yemekleri karışımı yemeğin yüzeyi üzerinde eşit biçimde yayılmasına izin dairesel hareketlerle hafifçe kullanarak uçlu. .
- Yinelenen 35 mm kültür kaplarına 100 mm Petri plaka yerleştirilir. Yeni 35 mm çanak kapağı çıkarılır ve açık bir tabak da aynı 100 mm Petri kabı yerleştirilir. Steril su kuluçka dönemi sırasında optimum nemi korumak için, bu açık 35 mm çanak eklenir. Kare biyoassay levhalar (245 mm) 35 mm yemekleri daha çoğaltmak kurulmuş olduğunda kullanılır. Yine, 2 ya da steril su içeren 3 adet açık, 35 mm yemekleri içerir.
- Plakalar 37 kuvöz ayarlamak için transfer ° C,% 5 CO2 ve% 95 nem. Kollajen congeals artan sıcaklık ve jel oluşumu tarafından yaklaşık bir saat içinde gerçekleşir. Kültürleri, bu süre içinde rahatsız olmamalıdır.
- Kültüre hücreleri 21 gün (21 gün sonra koloni boyutu farklar açıkça ayırt edilebilir) boyunca inkübe edilir.
4. Yenileme Orta hazırlanması ve Kültür Besleme:
N-CFCA kültürleri bir süre (21 gün) uzun süre inkübe olarak, kültürler uygun tam NeuroCult ile beslenmelidir ikmal orta aşağıdaki gibi taze olarak hazırlanır:
- NeuroCult MGK Bazal Orta 4.5 mL 0.5 m karışıkL NeuroCult MGK Silahların Yayılmasını Önleme Destekleri ve büyüme faktörleri sonra eklenir:
- 250 mcL 10μg/mL EGF (0.5 mikrogram / ml EGF nihai konsantrasyonu vermek için)
- 10μg/mL b-FGF (0.25μg/mL b-FGF final konsantrasyon vermek için) 125 mcL hücreleri kültür yetişkin sinir hücrelerinden elde edilen sadece gerekli.
- % 0.2 Heparin 125 mcL, kültür hücreleri, yetişkin sinir hücrelerinden elde edilen sadece gerekli .
- Uygun NeuroCult Yenileme Orta (embriyonik veya erişkin hücreler için) 60 mcL tüm NCFC Testi kültürü inkübasyon (21 gün) boyunca her 7 günde bir her NCFC Testi çanak merkezine eklenir.
5. N-CFC Testi Türetilmiş Kolonileri Puanlama ve Bona Fide NSC'lerde ve Sinir Progenitör Hücreler Frekans hesaplanması:
- Her 35 mm kültür çanak ızgara boyutu ile 2.0 mm x 2.0 mm ızgara puanlama tabağına yerleştirilir ve sonra her iki yemekleri mikroskop aşamasında yerleştirilir.
- Objektif lens, her bir çanak taranır ve koloniler kendi boyutlarına göre puanlanır (5X 2.5X) düşük güç kullanma.
- Kolonileri iki ana kategoriye ayrılır:
- 2 mm çapında daha az
- ≥ 2 mm çaplı
6. Temsilcisi Sonuçlar:
Kaplama 7 gün sonra (Şekil 1) - neurosphere tayininde, N-CFC tayininde kaplama hücreleri prolifere hücre küçük koloniler 3 gün içinde yapmak için başlayın. Iki hafta içinde, farklı boyutlarda koloni ayırt edilebilir. 14 gün sonra büyüyen kolonilerin çoğunluğu durdurmak için eğiliminde iken, bazı koloniler boyutu artmaya devam. 1 mm çapında, 3) 1 - 2 mm çapında ve 4) ≥ 2mm çapında en az 0,5 mm çapında, 2) 0.5) 1: 21 gün, koloniler dört kategoriden birine sınıflandırılır olabilir. Uygulamada, 2 mm çapından daha küçük koloniler progenitör türetilmiştir olarak adlandırılır (Şekil 2) ve MGK (Şekil 3) türetilen koloniler çapı ≥ 2mm adlandırılır. Kaplama toplam hücre ortalama çapı ≥ 2mm kolonilerin sayısı, uzun vadeli kendini yenileyen ve çok potansiyel yetenekleri ile gerçek bona fide sinir kök hücrelerinin sıklığı temsil eder. Paralel bir NSA deneyde 7-8 gün sonra belirli bir hücre popülasyonu frekans oluşturan toplam neurosphere N-CFCA deneyde 21 gün sonra aynı hücrede nüfus sıklığı toplam koloni oluşturan benzer olması tahmin ediliyor. N-CFCA Ancak, her bir hücrenin tam proliferatif potansiyeli gösterebilir kadar, daha müsamahakâr bir durum sağlar.
| Bileşen | 2 çoğaltır | 3 çoğaltır | 4 çoğaltır |
| Sitokinler olmadan NeuroCult NCFC Serum-Alerjik Orta | 1700 | 2550 | 3400 |
| NeuroCult MGK Silahların Yayılmasını Önleme Takviyeler | 330 | 495 | 660 |
| EGF (10 mg / ml) | 6,6 | 9,9 | 13,2 |
| Sadece yetişkin hücreler için bFGF (10 mg / ml), | 3,3 | 4,95 | 6,6 |
| Heparin sadece yetişkin hücreler için Çözüm (% 0.2), | 3,3 | 4,95 | 6,6 |
| Penisilin / Streptomisin (1:100) | 32 | 48 | 64 |
| Az Hücreler: 2.2 x 10 5 kültürlü hücre / ml VEYA 6.5 x 10 5 birincil hücre / ml | 25 | 37,5 | 50 |
| Kollajen Çözüm | 1300 | 1950 | 2600 |
Tablo 1 eksiksiz bir N-CFC tahlil kültür Bileşenleri.
Şekil 1. geçit bir E14 fare NSC'lerde N-CFCA kültür Temsilcisi koloniler 7 gün sonra kaplama. Koloniler farklı morfoloji ve boyutunu görüntülemek olabilir. Orijinal büyütme; 4x
Şekil 2 N-CFCA pasaj kültürünün farklı boyutları kaplama 21 gün sonra bir E14 fare NSC'lerde Temsilcisi progenitör elde edilen koloniler. Gösterildiği gibi, farklı koloniler morfoloji var ama boyutu az 2 mm. Orijinal büyütme; 4x
Şekil 3. Temsilcisi bona fide kök hücre kaplama 21 gün sonra geçiş bir E14 fare NSC'lerde N-CFCA kültüründe koloni türetilmiştir. Kök hücre elde edilen koloniler farklı morfoloji gösterebilir (bkz.video) ama çapı ≥ 2mm. Orijinal büyütme; 4x
Discussion
Neurosphere tahlil 3,1,2, yetişkin ve embriyonik MSS dokusu gibi çeşitli kaynaklardan sinir kök hücreler izole etmek ve genişletmek için en yaygın yöntem olmakla birlikte, doğru nöral prekürsör hücrelerinin karışık bir nüfus MGK frekansını ölçmek değildir (kök ve atalarıdır) neurospheres sayısı ve bona fide kök hücreler 4 sayısı 1-1 arasında bir ilişki yok gibi. Bu sınırlama gidermek için, orijinal NSA nöral kök ve atalarıdır 5-7 üç hafta boyunca tam proliferasyon kapasitesi büyümeye izin verecek şekilde adapte olmuştur. Sıvı NSA aksine, yarı katı kollajen matriks koloniler tek kaplama hücreleri ve agregasyonu göç engeller N-CFCA koloniler aslında klonal, elde edilir. Bu testte tutarlı sonuçlar için bizim önerimiz:
- Orijinal hücre süspansiyonu tek bir hücre süspansiyonu olun. Ayrışmış olmayan kümeleri kaldırmak şekilde 40 mikron boyutlu gözenekli filtre ile tek hücre süspansiyonu iletin.
- Kollajen çözüm buz üzerinde veya +4 ° C'de buzdolabında tutun. Kollajen sıcaklığı artırarak congeals hücre süspansiyonu karışımı eklenebilir son öğe.
- Her hafta kültürü beslemek için ihmal etmeyin. Her 7 günde bir büyüme faktörü (ler) içeren ikmal orta ekleme hücreleri genişletilmiş kültürü süre içinde yayılmaya devam etmektedir sağlayacaktır.
- Son hücre kaplama yoğunluğu, primer veya kültür sinir hücreleri elde edilen hücreler için optimize edilmiştir, böylece kültürün 21 gün sonra tespit edilen koloniler toplam sayısı NCFC aralığında en az 50 - 200 koloniler. Bu aralık, istatistiksel analizler için yeterli sayıda kolonilerin sağlarken örnekleri çapında nadir MGK elde edilen koloniler> 2mm algılanmasını sağlar. Başlangıç hücre kaynağına bağlı olarak, önemli ölçüde daha az (<50) ve kolonilerin sayısı daha yüksektir (> 250), bazen elde edilir. Pek çok koloniler yanlış bir koloni sayımı sonucunda büyüme orta bileşenlerinin aşırı kalabalık anddepletion neden olurken, çok az koloniler, çapı tespit seviyelerinin altında koloniler> 2mm neden olacaktır. Bu nedenle hücre kaplama yoğunluğu buna göre ayarlanır gerekecektir (yani toplam hücrelerin kaplama sayısı artan ya da azalan)
Disclosures
Yazarlardan biri, Sharon A. Louis StemCell Technologies Inc, bu çalışmada kullanılan bazı reaktiflerin bir yapımcı ile bağlanmıştır.
Acknowledgments
Bu çalışma Overstreet Vakfı parasal destek verdi.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| NeuroCult NCFC medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05720 | |
| 0.05% trypsin-EDTA | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Biosciences | 352340 | |
| Pen/Strep | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| Collagen | Reagent | Stem Cell Technologies | 04902 | |
| EGF | Growth factor | R&D Systems | 2028-EG | |
| b-FGF | Growth factor | R&D Systems | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma-Aldrich | H4784 | Reconstituted in PBS |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352070 | |
| 35 mm culture dishes | Culture ware | Stem Cell Technologies | 27100 | |
| Gridded scoring dishes | Culture ware | Stem Cell Technologies | 27500 |
References
- Azari, H., Rahaman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J Vis Exp. , (2010).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahaman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay. J Vis Exp. , (2011).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Louis, S. A. Enumeration of Neural Stem and Progenitor Cells in the Neural Colony Forming Cell Assay. Stem Cells. , (2008).
- Golmohammadi, M. G. Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain. Stem Cells. 26, 979-987 (2008).
- Louis, S. A., Reynolds, B. A. Neurosphere and Neural Colony-Forming Cell Assays. Protocols for Neural Cell Culture. 10, 1-28 (2010).
