Summary
La capacità di manipolare le staminali neurali umane / precursore cellule (hNSPCs) in vitro permette di indagare la loro utilità come i trapianti di cellule a fini terapeutici e di esplorare lo sviluppo umano neurale. Questo protocollo presenta un metodo di coltura e hNSPCs passaging nella speranza di aumentare la riproducibilità della ricerca sulle cellule staminali.
Abstract
La capacità di manipolare le staminali neurali umane / precursore cellule (hNSPCs) in vitro fornisce un mezzo per indagare la loro utilità come i trapianti di cellule per scopi terapeutici e di esplorare molti processi fondamentali dello sviluppo umano neurale e patologia. Questo protocollo presenta un semplice metodo di coltura e hNSPCs passaging nella speranza di standardizzazione questa tecnica e aumentando la riproducibilità della ricerca sulle cellule staminali. Il hNSPCs che usiamo sono stati isolati da cadavere corteccia cerebrale postnatale dal National Human Resource cellule staminali neurali e cresciuto come culture aderente su fiaschi rivestiti con fibronectina (Palmer et al, 2001;.. Schwartz et al, 2003). Noi la nostra cultura hNSPCs in DMEM: F12 senza siero dei media integrato con EGF, FGF, PDGF e di passaggio e le 01:02 circa ogni sette giorni. Utilizzando queste condizioni, la maggior parte delle cellule in cultura mantenere una morfologia bipolare ed esprimono marker di cellule indifferenziate staminali neurali (come nestina e Sox2).
Protocol
Nota: Per la coltura di routine dei nostri hNSPCs, cambiamo 50-100% dei media a giorni alterni e di solito li passaggio 01:02 una volta alla settimana. La cultura dei media contiene il 20% BIT-9500, 1X fattori antibiotica / antimicotica, e la crescita (EGF, FGF, PDGF e ciascuno a 40 ng / ml) in DMEM: F12 i media di base.
Preparazione del Flask patinate e Dissociare le celle
- Per preparare nuovi palloni per le cellule diversi passaggi, cappotto fiasche T25 con 10 mg / ml fibronectina umana in Emem per 4 ore, o durante la notte, a 37 ° C di coltura tissutale incubatore. Poco prima passaging le cellule, rimuovere la soluzione fibronectina e risciacquare i palloni con PBS.
- Trasferire il vecchio "condizionato" media dalle cellule da diversi passaggi per il nuovo fibronectina rivestite palloni (in modo tale che la metà del volume finale di media per ogni pallone sarà la "condizione" media). Queste condizioni di coltura contribuiscono a mantenere queste cellule nel loro stato indifferenziato.
- Una volta che tutti i media viene rimosso dalle cellule di diversi passaggi, lavare le cellule una volta con PBS. Fare attenzione a secco non fuori le cellule.
- Aggiungi cellulare dissociazione Buffer (CDB) direttamente sulle celle (1,0-1,5 ml per un pallone T25). Incubare le cellule nel buffer per circa 5 minuti a temperatura ambiente. Picchiettando delicatamente il pallone contribuirà ad accelerare il distacco delle cellule.
Centrifugazione, risospensione, e celle placcatura
- Aggiungi siero contenenti media (DMEM: F12 con il 10% di siero siero fetale bovino) (usare ~ 3 volte il volume di CDB) al pallone con le cellule distaccata. Rimuovere il supporto e le cellule in una provetta da 15 ml. Utilizzare un piccolo volume di fresca siero contenente i media per sciacquare il pallone e recuperare le cellule residue.
- Centrifugare i media e le celle a 1000 giri (~ 200xg) per 5 minuti.
- Aspirazione fuori il siero contenenti media e risospendere le cellule in terreni di coltura fresco, pipettando su e giù per ottenere una sospensione omogenea cellulare.
- Trasferire la metà delle cellule risospese in ogni pallone nuovo per una frazione di 1:2. Si noti il nuovo numero passaggio sul pallone.
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Discussion
Abbiamo scoperto che questo protocollo offre culture affidabile hNSPCs. Un fattore critico per le nostre cellule è che hanno bisogno di essere mantenuto il più culture piuttosto denso e non possono essere diversi passaggi al punto che le cellule sono scarse. Nelle nostre mani, le culture sparse crescono molto lentamente o cessare completamente divisione. Per questo motivo, siamo soliti suddividere le nostre culture 1:2 o 1:3 quando una cultura è estremamente denso. Rivestimento della superficie di un piatto cultura con fibronectina è importante in quanto favorisce l'attaccamento e la migrazione delle cellule buone, ma, a differenza di laminina, permette anche l'uso di Cell dissociazione Buffer (CDB) per staccare le cellule. Attaccamento alla cellula laminina è troppo forte e richiede l'uso di un enzima proteolitico (es. tripsina) per il distacco delle cellule. Non enzimatica CDB è preferito a tripsina dal taglio proteolitico delle proteine della superficie cellulare può portare a cambiamenti morfologici in hNSPCs nel tempo. Inoltre, hNSCPs coltura nei media condizionata aiuta a mantenere queste cellule nel loro stato indifferenziato.
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Acknowledgments
Gli autori ringraziano il Dott. Philip H. Schwartz del National Human Resource neurale delle cellule staminali presso l'Ospedale dei Bambini, Orange County Istituto di Ricerca per la fornitura di hNSPCs e l'istruzione iniziale nella loro coltura.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| BIT-9500 (BSA, Insulin, Transferrin) | Reagent | Stem Cell Technologies | 09500 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Reagent | Invitrogen | 15240-062 | |
| DMEM:F12 (1X) | Reagent | Invitrogen | 11330-032 | |
| EMEM (1X) | Reagent | Mediatech, Inc. | MT-10-010-CV | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Fetal Bovine Serum | Reagent | Invitrogen | 10437-028 | |
| FGF, human basic recombinant | Reagent | PeproTech Inc | 100-18B | |
| PDGF-AB | Reagent | PeproTech Inc | 100-00AB | |
| EGF, human recombinant | Reagent | BD Biosciences | CB40052 | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Cell Culture Flask, 25 cm2 | Tool | Corning | 10-126-28 | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Fibronectin, human, natural | Reagent | BD Biosciences | CB40008A | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Human Neural Stem/Precursor Cells | Cells | National Human Neural Stem Cell Resource | ||
| Cell Dissociation Buffer | Reagent | Invitrogen | 13150-016 |
References
- Flanagan, L. A., Rebaza, L. M., Derzic, S., Schwartz, P. H., Monuki, E. S. Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins. J. Neurosci. Res. 83, 845-856 (2006).
- Nethercott, H. N., Maxwell, H., Schwartz, P. H. Neural stem cell culture. Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide. Loring, J. F., Wesselschmidt, R. W., Schwartz, P. H. , Elsevier/Cell Press. (2007).
- Palmer, T. D., Schwartz, P. H., Taupin, P., Kaspar, B., Stein, S. A., Gage, F. H. Cell culture. Progenitor cells from human brain after death. Nature. 411, 42-43 (2001).
- Schwartz, P. H., Bryant, P. J., Fuja, T. J., Su, H., O'Dowd, D. K., Klassen, H. Isolation and characterization of neural progenitor cells from post-mortem human cortex. J Neurosci Res. 74, 838-851 (2003).
