Summary
in vitroでのヒト神経幹/前駆細胞（hNSPCs）を操作する能力は、治療目的のための細胞移植としてのユーティリティを調査し、人間の神経発生を探索することができます。このプロトコルは、ヒト幹細胞研究の増加再現性を期待して培養し、継代hNSPCsの方法を提示。
Abstract
in vitroでのヒト神経幹/前駆細胞（hNSPCs）を操作する能力は、治療目的のための細胞移植としてのユーティリティを調査するだけでなく、人間の神経発生と病理学の多くの基本的なプロセスを探索する手段を提供します。このプロトコルは、この手法を標準化し、ヒト幹細胞研究の再現性を高めることを望んで培養し、継代hNSPCsの簡単な方法を提示。我々が使用するhNSPCsは国立ヒト神経幹細胞資源で死体生後脳の皮質から単離し、フィブロネクチン（パーマーら、2001;シュワルツら、2003。）でコーティングしたフラスコ上に付着培養物として増殖させた。 DMEMで我々の文化は私たちのhNSPCs：F12無血清培地はEGF、FGF、およびPDGFを補充し、通過それらの1時02分、約7日ごと。これらの条件を使用して、培養中の細胞の大半は、バイポーラの形態を維持し、未分化な神経幹細胞（そのようなネスチンとSox2など）のマーカーを発現する。
Protocol
注 ：週に一度私たちのhNSPCsのルーチン培養するために、我々は一日おきに、通常は通過して1時02分メディアの50〜100％に変更。 F12ベースのメディア：文化メディアは20％のBIT - 9500 DMEMで、1X抗生物質/抗真菌剤、および成長因子（EGF、FGF、およびPDGF 40 ng / mlの時それぞれ）が含まれています。
コートフラスコを準備し、セルの関連付け解除
- 37℃の組織培養インキュベーターで、継代細胞のために新しいフラスコを準備するには、EMEMで10μg/ mlのヒトフィブロネクチンでコーティングT25フラスコに4時間、または一晩。右の細胞を継代する前に、フィブロネクチン溶液を除去し、PBSでフラスコを洗う。
- 新しいフィブロネクチンでコートフラスコ（各フラスコのためのメディアの半分最後のボリュームが"エアコン"メディアとなるよう）に継代する細胞から古い"エアコン"メディアを転送します。これらの培養条件は、その未分化状態でこれらの細胞を保つのを助ける。
- 一度にすべてのメディアの継代する細胞から削除され、PBSで細胞を1回すすいでください。細胞を乾燥しないように注意してください。
- 直接細胞（T25フラスコ用1.0〜1.5ミリリットル）に細胞解離バッファー（CDB）を追加します。室温で約5分間、バッファーで細胞をインキュベート。静かにフラスコをタップすると細胞剥離をスピードアップに役立ちます。
、遠心分離し再懸濁し、そしてめっきセル
- 剥がれた細胞をフラスコに（CDBの〜3倍のボリュームを使用）：血清含有培地を（F12 10と％熱不活化ウシ胎児血清DMEM）を追加します。 15 mlコニカルチューブにメディアとセルを削除する。フラスコを洗浄し、残りの細胞を回収するために新鮮な血清含有培地の小さなボリュームを使用してください。
- 5分間で1000rpm（〜200xg）でメディアと細胞を遠心分離します。
- 血清含有培地オフ吸引し、均一な細胞懸濁液を作るためにピペッティングし、新鮮培地で細胞を懸濁します。
- 1：02分割のそれぞれの新しいフラスコに再懸濁した細胞の半分を譲渡する。フラスコの新しい道の番号に注意してください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
我々は、このプロトコルはhNSPCsの信頼性の高い文化を提供することを見出した。我々の細胞の一つの重要な要因は、彼らはかなり密培養物として維持されると細胞が疎であることがポイントに継代することができる必要があるということです。私たちの手では、疎な文化は非常にゆっくりと成長または完全に分割することを中止。文化は非常に密集しているときにこのような理由から、我々は、通常私たちの文化、1:2または1:3分割。それが良い細胞の接着および遊走を促進する、しかし、ラミニンとは異なり、それはまた、細胞を分離するために細胞解離バッファー（CDB）の使用を許可するので、フィブロネクチンと培養皿のコーティング面は重要です。ラミニンへの細胞接着が強すぎると細胞剥離のためのタンパク質分解酵素（例えばトリプシン）を使用する必要があります。非酵素的CDBは、細胞表面タンパク質のタンパク質分解的切断は、時間をかけhNSPCsの形態学的変化を引き起こすことがあるため、トリプシンが好ましい。また、馴化培地で培養hNSCPsは、その未分化状態でこれらの細胞を維持するのに役立ちます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
作者は感謝して子供の病院、その培養にhNSPCsと初期命令を提供するためのオレンジカウンティ研究所の国立ヒト神経幹細胞資源の博士フィリップH.シュワルツを認めます。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| BIT-9500 (BSA, Insulin, Transferrin) | Reagent | Stem Cell Technologies | 09500 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Reagent | Invitrogen | 15240-062 | |
| DMEM:F12 (1X) | Reagent | Invitrogen | 11330-032 | |
| EMEM (1X) | Reagent | Mediatech, Inc. | MT-10-010-CV | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Fetal Bovine Serum | Reagent | Invitrogen | 10437-028 | |
| FGF, human basic recombinant | Reagent | PeproTech Inc | 100-18B | |
| PDGF-AB | Reagent | PeproTech Inc | 100-00AB | |
| EGF, human recombinant | Reagent | BD Biosciences | CB40052 | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Cell Culture Flask, 25 cm2 | Tool | Corning | 10-126-28 | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Fibronectin, human, natural | Reagent | BD Biosciences | CB40008A | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Human Neural Stem/Precursor Cells | Cells | National Human Neural Stem Cell Resource | ||
| Cell Dissociation Buffer | Reagent | Invitrogen | 13150-016 |
References
- Flanagan, L. A., Rebaza, L. M., Derzic, S., Schwartz, P. H., Monuki, E. S. Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins. J. Neurosci. Res. 83, 845-856 (2006).
- Nethercott, H. N., Maxwell, H., Schwartz, P. H. Neural stem cell culture. Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide. Loring, J. F., Wesselschmidt, R. W., Schwartz, P. H. , Elsevier/Cell Press. (2007).
- Palmer, T. D., Schwartz, P. H., Taupin, P., Kaspar, B., Stein, S. A., Gage, F. H. Cell culture. Progenitor cells from human brain after death. Nature. 411, 42-43 (2001).
- Schwartz, P. H., Bryant, P. J., Fuja, T. J., Su, H., O'Dowd, D. K., Klassen, H. Isolation and characterization of neural progenitor cells from post-mortem human cortex. J Neurosci Res. 74, 838-851 (2003).
