Summary
ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर testes तेजी से और कुशलता से वयस्क पुरुषों विदारक सुइयों का उपयोग कर से अलग कर सकते हैं . अभ्यास के साथ, एक आसानी से एक या दो दिनों में एंटीबॉडी या एंजाइम आधारित assays के लिए उच्च throughput अनुक्रमण या अधिक परंपरागत आणविक जीव विज्ञान के तरीकों से डीएनए या शाही सेना के विश्लेषण के लिए या प्रोटीन की पर्याप्त testes की राशि को अलग कर सकते हैं.
Abstract
ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर के testes स्टेम सेल के रखरखाव और भेदभाव, अर्धसूत्रीविभाजन, और सोम - germline बातचीत के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल उपलब्ध कराते हैं . Testes आम तौर पर 0-3 दिनों pupal मामले से eclosion के बाद वयस्क पुरुषों से अलग कर रहे हैं. जंगली प्रकार मक्खियों के testes को आसानी से अन्य ऊतकों से प्रतिष्ठित कर रहे हैं क्योंकि वे पीले हैं, लेकिन सफेद उत्परिवर्ती मक्खियों के testes, प्रयोगशाला प्रयोगों के लिए एक आम आनुवंशिक पृष्ठभूमि मक्खी पेट के लिए दोनों के आकार और रंग में समान हैं. एक गिलास खुर्दबीन स्लाइड पर एक काले रंग की पृष्ठभूमि के साथ विच्छेदन प्रदर्शन testes की पहचान काफी आसान बनाता है. Testes विदारक सुइयों का उपयोग मक्खियों से हटा रहे हैं. प्रोटोकॉल है कि testes विच्छेदन के लिए संदंश का उपयोग करने के लिए तुलना में, हमारे विधि अभी तक जल्दी है, एक अच्छी तरह से अभ्यास व्यक्ति प्रति घंटे 200-300 जंगली प्रकार मक्खियों से testes काटना, 400-600 testes उपज की अनुमति है. सफेद मक्खियों से testes या म्यूटेंट कि testes के आकार को कम करने से कठिन काटना और आम तौर पर प्रति घंटे 200-400 testes उपज हैं.
Protocol
- एक काले रंग की पृष्ठभूमि के साथ एक गिलास खुर्दबीन स्लाइड खुर्दबीन स्लाइड के रूप में एक ही आकार 20 # सफेद कागज कट. रंग स्लाइड आकार कागज काले रंग की एक तरफ एक स्थायी मार्कर का उपयोग कर (जैसे, Sharpie). काले पक्ष को सफेद गोंद (एल्मर) लागू करते हैं और स्लाइड के लिए कागज पालन. स्लाइड reused किया जा सकता. ¾ "लेबल टेप (Fisherbrand), खुर्दबीन स्लाइड, कांच की ओर सुरक्षित, सीओ 2 मक्खी पैड के लिए यह जगह में ठीक है.
- 0-3 दिन पुराने नर मक्खियों लीजिए.
- बर्फ की एक बाल्टी तैयार, खारा (पीबीएस), सुइयों विदारक फॉस्फेट-buffered.
- चतनाशून्य करना 5-10 सीओ 2 की एक धारा का उपयोग कर मक्खियों और बोतल या शीशी से उन्हें खुर्दबीन स्लाइड के पास मक्खी पैड करने के लिए स्थानांतरण .
- पिपेट ~ 50 μl बर्फ ठंड खुर्दबीन स्लाइड के मध्य में एक बूंद में पीबीएस.
- धीरे से ऊपर के साथ एक पुरुष मक्खी लेने विदारक सुई डुबकी पीबीएस के ड्रॉप में यह सुई जगह के साथ उड़ की Pbs, कोमल स्पर्श ventral पक्ष (यानी, पंखों के पास) में विदारक सुई.
- मक्खी के बीच पर एक सुई प्लेस, छाती और पेट के बीच मजबूती से नीचे धक्का . (A6) छठे और सातवें (7) पेट क्षेत्रों (नीचे से दूसरे और तीसरे धारियों) के बीच अन्य सुई प्लेस, पेट छाती से दूर खींच.
- अन्य अंगों, खासकर पेट के अलावा वृषण छेड़ो. विशेष रूप से, सफेद म्यूटेंट में testes और पेट के समान लग रही हो . प्रमुख मतभेद रहे हैं कि हमेशा जोड़े में आते हैं testes, प्रत्येक वृषण एक सर्पिल पैटर्न है और पेट की तुलना में अधिक रंग में सफेद है.
- पीबीएस बर्फ की ठंड में एक polypropylene microcentrifuge ट्यूब में testes का स्टोर.
प्रतिनिधि परिणाम:
चित्रा 1. पुरुष प्रजनन प्रणाली के पृष्ठीय flybase.org/reports/FBim0000074.html से, दृश्य. Flybase रोपण: "पृष्ठ 508 पर मिलर (1950) से 38 एक आंकड़ा के बाद ए मिलर आंतरिक शरीर रचना विज्ञान और ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर के ईमागौ के ऊतक विज्ञान एम. Demerec, संपादक, ड्रोसोफिला, 6 अध्याय, 420 पृष्ठों के जीवविज्ञान में - 534 कोल्ड स्प्रिंग हार्बर लेबोरेटरी प्रेस, प्रतिकृति संस्करण, 1994. कोल्ड स्प्रिंग हार्बर लेबोरेटरी प्रेस द्वारा 1994 कॉपीराइट. कोल्ड स्प्रिंग हार्बर प्रयोगशाला (CSHL) से रज़ामंदी प्रेस के साथ प्रयुक्त देखें . http://www.cshlpress.com. "
Discussion
हम एक वयस्क पुरुष ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर से testes अलग प्रोटोकॉल के लिए प्रदान करते हैं. क्योंकि तकनीक है एक दो हाथ समन्वय की आवश्यकता है, कौशल और अभ्यास के साथ ही आता है.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखकों हमारी प्रयोगशाला में इस तकनीक शुरू करने के लिए Vasia Vagin धन्यवाद.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting needle | Tool | Fisher Scientific | S17346 | |
| Micro Slides, Plain | Tool | Fisher Scientific | 12-553 | |
| Microscope Light | Tool | Schott AG | KO-1500 | |
| CO2 pad | Tool | Genesee Scientific | 59-172 | |
| Benchtop Flowbuddy Complete System | Tool | Genesee Scientific | 59-122WCU | |
| Bubble Humidifier | Tool | Salter Labs | 7100 | |
| Ball filler needle | Tool | Genesee Scientific | 54-119 | |
| ¾” Label Tape | Supply | Fisher Scientific | 15-901-5B |
References
- Singh, S. R., Hou, S. X. Immunohistological Techniques for Studying the Drosophila Male Germline Stem Cell. Methods Mol Biol. 450, 45-59 (2008).
