Summary
מאמר זה מתאר שיטה לבידוד אלקטרו גירוי כימי sensilla הפרט באמצעות תאית, קצה הקלטות תחת שמן מינרלי.
Abstract
אנו מתארים שינוי של 1,2 טיפ הקלטה קיימת טכניקה electrophysiologically חוקרת קצר, דמוי יתד sensilla חושית 3,4. על פני השטח אמצע הגחון של עקרבים כל שני איברים בשם pectines, אשר יש שדות צפופה של mechano ו chemosensory יתד sensilla 5,6. אחת השיטות להערכת chemoresponsiveness של sensilla אלה משתמשת אלקטרודה טונגסטן עבור extracellularly הקלטה פעילות עצבית בתוך sensillum כמו odorant נדיפים הוא הציג לתחום חושי 5,7. המגבלות של שיטה זו כוללת איסוף נתונים איטי מבוא ממריץ מבוקרת, והסרה מ, השדה יתד. כדי להתגבר על המגבלות האלה, פיתחנו טכניקה חדשה קצה הקלטה המשתמשת שמן מינרלי פולרי כמדיום שדרכו כדי לספק בסיס מים tastants לפרט יתד sensilla 8,9. יש לנו מיושם בהצלחה בשיטה זו כדי להשיג chemoresponses sensillar לחומצה אתנול לימון, ומלח. כאן אנו מתארים את פרוטוקול הניסוי למחקר כזה 9. אנחנו חושבים זה השיטה החדשה עשוי להיות שימושי עבור הלומדים את מאפייני התגובה של מערכות אחרות chemosensory arthropod, כולל אלה של 10 חרקים, 11 וסרטנים 12.
Protocol
1. טרום הקלטה, בעלי חיים הכנה
- הסר את העקרב מהצנצנת הבית שלה יש להניח אותו במיכל מקורר מראש כוס; הבא, במקום את הצנצנת המכילה את העקרב לסביבה הקפאה (-5 מעלות צלזיוס) למשך תקופה מינימלית של שתי דקות. זמן זה עשוי להשתנות על פי גיל, גודל, מינים, וכו 'של העקרב ספציפי תחת מחקר. אבל בדרך כלל, שלב הסביבה הקפאת השלמת פעם החיה היא תנועה.
- אחרי שתי דקות, להסיר את העקרב משותקת ממכל זכוכית קר, למקם אותו בצד הגחון על שקופיות מיקרוסקופ. אבטח את העוקץ, זנב, רגליים, pedipalps עם חימר moldable (על בסיס שמן, ואן Aken Plastalina).
- הפוך את פלטפורמה שעליה לשים pectines של עקרב. התאם את אורך ורוחב של הפלטפורמה לפי גודל של pecten. בדרך כלל, הפלטפורמות שלנו בנויים מתוך מכסה זכוכית מיקרוסקופ ו - כ 10 (L) X 18 (W) מ"מ.
- ציית פעמיים צדדי דבק לפלטפורמת pecten, זמירה את הקלטת (במידת הצורך) כדי להתאים.
- כדי להפוך את חדר pectinal, לשים שלוש או ארבע של הפלטפורמה הצדדים בשעווה מראש נמס (אנו משתמשים שבבי שעוות דבורים 100%) עד לעומק של 3-4 מ"מ. אנחנו ממיסים את השעווה על ידי הנחת אסימונים בתוך צלחת פטרי זכוכית, הממוקם על פלטה חשמלית. לאחר שעווה בשולי החדר pectinal הוא מקורר לטמפרטורת החדר, זה אמור ליצור קירות של שעווה על 1 מ"מ גבוה.
- על החיה, לאתר את נקודת הכניסה pectinal, והמקום קצה בלתי שעווה של הפלטפורמה (קלטת בצד-up) האחוריים רק אליו. לאחר מכן, לייצב את הפלטפורמה (כך שלא יעברו בהמשך) על ידי לחיצה בעדינות את זכותה וקצוות היקפי שמאל נגד חימר השתמשו לרסן את הרגליים של החיה.
- השתמש קנס שקצהו מלקחיים בזהירות המקום pecten או pectines בתוך החדר. באופן ספציפי, באמצעות מלקחיים, להחזיק את pecten לאורך עמוד השדרה pectinal, ובעדינות להביא את pecten החוצה מתחת לזכוכית לכסות ומוריד אותה אל הרצפה פלטפורמה דבק. הקמת האג"ח pecten על קלטת בקפידה על ידי הפעלת לחץ על עמוד השדרה pectinal.
- עכשיו להחיל שעווה מותכת (אנו משתמשים מרית מתכת מחומם מראש) עד לקצה בלתי שעווה של הרציף. המטרה היא כפולה, כדי לאבטח את pecten באופן מלא לתחום את חדר המבוא שמן מינרלי בעתיד. היזהר בעת החלת שעווה מעל pecten של בעל החיים, כפי שאפשר הנזק pecten בשעווה כי הוא חם מדי.
- בניית תא pecten תושלם. בשלב הבא, ליצור חיבור אלקטרודות אדיש עם hemolymph של החיה ידי הוספת חוט כסף בין שני פלחי הזנב.
2. הקלטה תאיים סימולטני גירוי כימי
- אנו מכינים את חיה 24 שעות לפני ביצוע תאית, קצה ההקלטות, אשר, בין היתר (כלומר התאמה חיה למצב קבוע), מאפשר זמן אישית לעשות pipettes ממריץ של ספציפי (sensillum תלויי) בקוטר-קצה. אנו משתמשים חולץ micropipette להשגת מפרטים כאלה. באופן אידיאלי, בקוטר של pipettes הוא ≈ 2 מיקרומטר גדול יותר מאשר קוטר הנקבוביות sensillar. אנו להתאים את מפרט micropipette שלנו בהתאם עבור כל חיה.
- 1 שעות לפני ההקלטה, נוסיף 5 μl של שמן מינרלי לחדר pectinal, השריית pecten תחת שמן. לאחר מכן, אנו בעמדה חיה מתחת מיקרוסקופ רב עוצמה, אשר מזה זמן עבודה מטרות המרחק עלית תאורה.
- כדי לעורר כימית יתד sensilla, אנחנו מציגים tastants מימית (כלומר חומצת לימון ומלח) דרך המדיום שמן. ראשית, אנו משתמשים מילוי micropipette להזריק את החומר מהגוף לתוך פיפטה ממריץ. הערה: כל הפתרונות ממריץ אמור להכיל אלקטרוליט עבור המוליכות החשמלית.
- בשלב הבא, לאחר מיצוב פיפטה ממריץ על micromanipulator (במתקן ההקלטה), הכנס את האלקטרודה הקלטה לתוך בסופו של דבר, לפתוח בוטה של פיפטה ממריץ. חשוב להבטיח מגע בין האלקטרודה מתכת פתרון ממריץ אלקטרוליטי.
- לאחר הכנת מעוגנת חשמלית (דרך האלקטרודה אדיש), פשוט להוריד את פיפטה דרך המדיום שמן על נקבוביות sensillar. משך גירוי כימי לכל sensillum pectinal יכול להשתנות ככל שלושים דקות לשנייה קטנה כמו אחד. באופן כללי, אנו יכולים מדגם יתדות מרובים (> 30) לכל טפטפת. במקרה פיפטה ממריץ הופך סתום בפסולת דקה, פשוט להחליף את פיפטה סתומים עבור פיפטה חדשה בשימוש.
3. הכנת בעלי חיים במשך ימים מרובים של ניסויים בבעלי חיים
- אם החיה היא לשמש במשך זמן ממושך, אנו ממליצים על שימוש חוזר לחדר pectinal והחלפת טיפה של שמן מינרלי עבור כל מפגש הקלטה. אחרי הקלטה של יום נתון היא מוחלטת, הסר את ההקלטה החיה של הגדרת ולבצע לשטוף שמן מינרלי.
- Specifically, להוסיף עוד טיפה (5 μl) של שמן מינרלי אל החדר, וכן להסיר את כל הנפט. זה עוזר לצמצם את נוכחותם של ממריץ שיורית, אשר ייתכן דלפו של פיפטה במהלך הפגישה ההקלטה.
- לפני הפגישה הבאה, להוסיף טיפה אחת של שמן כפי שתואר לעיל.
4. נציג תוצאות:
בהתאם לציוד הקלטה בשימוש (למשל מגבר מסוים, digitizing חומרה וכו '), תוצאה נציג היא הקלטה תאיים עם S: N יחס של לפחות 3:1.
בנייה מוצלחת של החדר שמן מינרלי הכרחי לבודד גירוי כימי sensilla הפרט, כפי שהוא מספק מדיום להעברת tastants כימיים קוטבי (על בסיס מים) 8. אם יש מעט שמן מדי או בכלל, הפתרון ממריץ יתפשט מ sensillum רשמה אל sensilla השכנות, אשר עלולים לגרום התקף ממושך, בלתי מבוקרת של גירוי כימי 8.
Discussion
הפרוטוקול הנ"ל מתאר כיצד להכין גראסלאנד במדבר עקרב (Paruroctonus utahensis) למחקר אלקטרו. באופן ספציפי, אנחנו מראים איך לבנות חדר על תאי מבוקר קצה הקלטות של נוירונים chemosensory pectinal תחת שמן. מכיוון שמן ומים לא מתערבבים, זה אפשרי לבודד גירוי כימי (עם בסיס מים ממריצים) כדי sensilla יחיד. יודגש כי פ utahensis, הוא חיה קטנה יחסית (≈ 2.5-5 ס"מ) החלת פרוטוקול לבעלי חיים גדולים יותר עשויים לדרוש התאמות גודל רבים, כגון גודל של הפלטפורמה של חיה, קאמרית, וכמות השמן מיושם. אנו ממליצים על עריכת מחקרים הפיילוט לבדוק את הכמות המינימלית של שמן הכרחי במסירה מבוקרת של מים מבוססי ממריצים כימיים.
יתר על כן, לא מצאנו השפעה של שמן על פעילות הבסיס העצבי בתוך pectinal sensilla 8. זה צריך להיות אישר מודל עבור מערכות אחרות, לפני הערכת chemoresponsiveness.
שיטה זו עשויה לשמש בשילוב עם שיטה אחרת לבדיקת ההשפעות chemoresponse האינטראקציה בין sensilla בתחום חושית. לדוגמה, ניתן שיא קצה (תחת שמן) מבית sensillum אחד כמו שאנחנו בסיס שיא (באמצעות אלקטרודה טונגסטן) מ sensillum שכנה 9. תצורה מעין הקלטה ניתן להשתמש כדי להעריך אם כימית או לא מעוררים זה sensillum משפיע על הפעילות העצבית של sensillum בסיס מוקלט. עד כה, אף אחד לא בדקה את זה עקרב pectinal sensilla, והיא נותרת פתוחה עבור מערכות chemosensory אחרים גם כן.
לסיכום, אנחנו חושבים שיטת טיפ הקלטה תחת ההתקדמות שמן היקף החקירות אלקטרו לתוך הבסיס העצבי של gustation arthropod. בכתב היד הזה, אנו מספקים פרוטוקול להכנת חיות בשיטה זו, ואנו מקווים שהיא מספקת בסיס מוצק מחקר נוסף של מערכת העצבים ההיקפית חושית.
Disclosures
פרסמנו בעבר בשיטות אלה בשני כתבי עת, נולטון ו Gaffin (2009) ו נולטון ו Gaffin (in press).
Acknowledgments
אנו מודים לקרן החיים, אוניברסיטת אוקלהומה תוכנית הזדמנויות מחקר לתואר ראשון, ואת המחלקה לזואולוגיה למימון עבודה זו. כמו כן, אנו מבקשים להודות לד"ר Hoefnagels מריאל לעזרה העריכה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lift-N-Press tab | Ted Pella, Inc. | 16082 | Doubled-sided adhesive |
| MicroFil | World Precision Instruments, Inc. | MF34G | Micropipette filler |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-6 | Glass pipettes |
| Micr–lectrode Holder | World Precision Instruments, Inc. | MEH3SBW10 |
References
- Hodgson, E. S., Lettvin, J. Y., Roeder, K. D. Physiology of a Primary Chemoreceptor unit. Science. 12, 417-418 (1955).
- Newland, P. L. Taste processing in the insect nervous system. Methods in Insect Sensory Neuroscience. Christensen, T. A. , CRC Press. Boca Raton. 289-318 (2005).
- Foelix, R. F., Müller-Vorholt, G. The fine structure of scorpion sensory organs II. Pecten sensilla. Bull. Br. Arachnol. Soc. 6, 68-74 (1983).
- Carthy, J. D. Fine structure and function of the sensory pegs on the scorpion pecten. Experientia. 22, 89-91 (1966).
- Gaffin, D. D., Brownell, P. H. Response properties of chemosensory peg sensilla on the pectines of scorpions. J. Comp. Physiol. A. 181, 291-300 (1997).
- Wolf, H. The pectine organs of the scorpion, Vaejovis spinigerus: Structure and (glomerular) central projections. Arthropod Struct. Dev. 37, 67-80 (2008).
- Gaffin, D. D., Brownell, P. H. Electrophysiological evidence of synaptic interactions within chemosensory sensilla of scorpion pectines. J. Comp. Physiol. A. 181, 301-307 (1997).
- Knowlton, E. D., Gaffin, D. D. A new approach to examining scorpion peg sensilla: the mineral oil flood technique. J. Arachnol. 37, 379-382 (2009).
- Knowlton, E. D., Gaffin, D. D. A new tip-recording method to test scorpion pecten chemoresponses to water-soluble stimulants. J. Neurosci Methods. , Forthcoming Forthcoming.
- Haupt, S. S. Antennal sucrose perception in the honey bee (Apis mellifera L.): behaviour and electrophysiology. J. Comp. Physiol. A. 190, 735-745 (2004).
- Bland, R. G. Sensilla on the antennae, mouthparts, and body of the larva of the alfalfa weevil, hypera postica (gyllenhal) (Coleoptera : Curculionidae). Int. J. Insect Morphol. Embryol. 12, 261-272 (1983).
- Cate, H. S., Derby, C. D. Hooded Sensilla Homologues: Structural Variations of a Widely Distributed Bimodal Chemomechanosensillum. J. Comp. Neurol. 444, 345-357 (2002).
