Summary
Questo articolo descrive un metodo per isolare elettrofisiologico stimolazione chimica per i singoli sensilli via extracellulare, in punta di registrazioni in olio minerale.
Abstract
Descriviamo una modifica di una esistente punta-registrazione 1,2 tecnica elettrofisiologico per indagare breve, come il peg-sensoriale sensilli 3,4. Sulla revisione a medio ventrale superficie di tutti gli scorpioni sono due appendici chiamate pectine, che hanno campi densi di meccano-e chemosensoriali peg sensilli 5,6. Un metodo per la valutazione chemoresponsiveness di questi sensilli utilizza un elettrodo di tungsteno per extracellulare registrare l'attività neurale all'interno di un sensillum come odorizzante volatile è introdotto nel campo sensoriale 5,7. I limiti di questo metodo sono lento i dati raccolti e stimolante introduzione incontrollata di, e la rimozione da, il campo piolo. Per superare questi limiti, abbiamo sviluppato una nuova punta-registrazione tecnica che utilizza l'olio minerale non polare come un mezzo attraverso il quale fornire a base d'acqua tastants a singoli peg sensilli 8,9. Noi abbiamo applicato con successo questo metodo per ottenere chemoresponses sensillar di acido citrico, etanolo, e sale. Qui descriviamo il protocollo sperimentale per uno studio 9. Pensiamo che questo nuovo metodo può essere utile per lo studio delle proprietà di risposta di altri sistemi artropodi chemosensoriali, compresi quelli degli insetti 10, 11 e crostacei 12.
Protocol
1. Pre-registrazione, di preparazione degli animali dal vivo
- Rimuovere lo scorpione dalla sua casa vaso e metterlo in un pre-raffreddata contenitore di vetro; prossimo, posizionare il vaso contenente lo scorpione in un ambiente freddo (-5 ° C) per un minimo di due minuti. Questo tempo può variare a seconda dell'età, le dimensioni, specie, ecc scorpione dello specifico oggetto di studio. Ma in generale, la fase di congelamento ambiente è completo una volta che l'animale è immobile.
- Dopo due minuti, togliere il immobilizzato scorpione del contenitore in vetro freddo, e posizionarlo lato ventrale su un vetrino da microscopio. Fissare il pungiglione, la coda, le gambe e pedipalpi con argilla modellabile (a base di olio, Van Aken Plastalina).
- Fai una piattaforma su cui mettere le scorpione pectine. Regolare la lunghezza della piattaforma e la larghezza in base alle dimensioni del pecten. Tipicamente, le nostre piattaforme sono costruite in vetro microscopio copertura e sono circa 10 (L) x 18 (W) mm.
- Aderire a doppia faccia nastro adesivo alla piattaforma pecten, taglio del nastro (se necessario) per adattarsi.
- Per effettuare una camera pectinal, mettere tre dei quattro lati piattaforma in pre-cera fusa (usiamo chip di cera d'api 100%) ad una profondità di 3-4 mm. Noi sciogliere la cera mettendo il chip all'interno di un piatto di vetro di Petri, che si trova su un piatto caldo. Una volta che la cera sui bordi della camera pectinal viene raffreddato a temperatura ambiente, questo dovrebbe creare muri di cera di circa 1 mm di altezza.
- Sull'animale, individuare il punto di inserimento pectinal, e posto il non-cerata bordo della piattaforma (lato nastro-up) appena posteriormente ad essa. In seguito, stabilizzare la piattaforma (in modo che non si sposta più avanti) premendo delicatamente la sua destra e di sinistra bordi periferici contro l'argilla utilizzata per contenere le gambe dell'animale.
- Usa punta sottile pinzetta per posizionare accuratamente il pecten o pectine all'interno della camera. In particolare, utilizzando pinze, tenere premuto il pecten lungo la spina dorsale pectinal, e delicatamente portare i pecten fuori da sotto il vetro di copertura e abbassarlo sul pavimento della piattaforma adesivo. Stabilire un pecten-to-tape legame con attenzione pressione sulla colonna vertebrale pectinal.
- Ora applicare cera fusa (usiamo un pre-riscaldato spatola metallica) per il non-cerata bordo della piattaforma. Lo scopo è duplice, per fissare il pecten e da includere completamente la camera per la futura introduzione di olio minerale. Prestare attenzione quando si applica la cera sopra pecten dell'animale, in quanto è possibile danneggiare il pettine con la cera che è troppo caldo.
- La costruzione della camera pecten è completa. Quindi, stabilire una connessione con elettrodo indifferente emolinfa dell'animale inserendo un filo d'argento tra due segmenti della coda.
2. Registrazione simultanea extracellulare e stimolazione chimica
- Prepariamo le 24 h animale prima di effettuare extracellulare, in punta di registrazioni, che, tra le altre ragioni (regolazione animale cioè in posizione fissa), permette ora di fare su misura pipette stimolante di uno specifico (sensillum-dipendente) in punta di diametro. Usiamo un estrattore micropipetta per raggiungere tali specifiche. Idealmente, il diametro delle pipette è ≈ 2 micron più grande del diametro dei pori sensillar. Noi regolare le nostre specifiche micropipetta di conseguenza per ogni animale.
- 1 prima registrazione h, si aggiungono 5 ml di olio minerale per la camera pectinal, sommergendo il pecten sott'olio. Poi, abbiamo la posizione dell'animale sotto un potente microscopio, che da tempo gli obiettivi di lavoro a distanza e epi-illuminazione.
- Per stimolare chimicamente piolo sensilli, introduciamo tastants acquosa (es. acido citrico e sale) per mezzo di olio. In primo luogo, si usa un riempitivo micropipetta per iniettare il stimolante nella pipetta stimolante. Nota: tutte le soluzioni stimolante dovrebbe contenere un elettrolita per la conduttanza elettrica.
- Successivamente, dopo aver posizionato la pipetta stimolante su un micromanipolatore (nella registrazione rig), inserire l'elettrodo di registrazione nel smussato, estremità aperta della pipetta stimolante. E 'importante per assicurare il contatto tra l'elettrodo metallico e la soluzione stimolante elettrolitico.
- Una volta che la preparazione è a massa (tramite l'elettrodo indifferente), abbasseranno la pipetta attraverso il mezzo del petrolio e su un poro sensillar. La durata della stimolazione chimica per sensillum pectinal può variare da fino a trenta minuti per non più di un secondo. In generale, possiamo campione spine multiple (> 30) per ogni pipetta. Nel caso in cui la pipetta stimolante si intasa di detriti minuti, semplicemente scambiare la pipetta intasato per un nuovo, pipetta inutilizzato.
3. Preparazione di un animale per più giorni di sperimentazione
- Se l'animale deve essere usato per un periodo di tempo prolungato, si consiglia di riutilizzare la camera pectinal e sostituendo la goccia di olio minerale per ogni sessione di registrazione. Dopo la sessione di registrazione di un dato giorno, rimuovere l'animale dalla registrazione di set-up ed effettuare un lavaggio con olio minerale.
- Specifically, aggiungere un'altra goccia (5 mL) di olio minerale per la camera, e rimuovere tutto l'olio. Questo aiuta a minimizzare la presenza di residui stimolante, che può avere trapelato della pipetta durante la sessione di registrazione.
- Prima della prossima sessione, aggiungere una goccia di olio, come descritto in precedenza.
4. Rappresentante dei risultati:
A seconda dell'apparecchio di controllo utilizzato (ad esempio l'amplificatore particolare, la digitalizzazione di hardware, ecc), un risultato rappresentativo è una registrazione extracellulare con un S: rapporto N di almeno 3:1.
Costruzione di successo della camera di olio minerale è necessario per isolare stimolazione chimica per sensilli singoli, in quanto fornisce un mezzo per la distribuzione di tastants chimici polari (a base d'acqua) 8. Se c'è l'olio troppo poco o niente, la soluzione stimolante si diffonderà dal sensillum registrato al suo sensilli vicini, che rischia di causare un prolungato attacco incontrollata di stimolazione chimica 8.
Discussion
Il protocollo sopra descritto come preparare un deserto prateria scorpione (Paruroctonus utahensis) per lo studio elettrofisiologico. In particolare, si mostra come costruire una camera di controllo extracellulare punta-registrazioni di pectinal neuroni chemosensoriali sott'olio. Perché l'olio e l'acqua non si mescolano, è possibile isolare stimolazione chimica (con acqua a base di stimolanti) per sensilli singoli. Va sottolineato che P. utahensis, è un animale relativamente piccolo (≈ 2,5-5 cm) e l'applicazione di questo protocollo per animali più grandi dimensioni possono richiedere un aggiustamento molti, come le dimensioni della piattaforma dell'animale, da camera, e la quantità di olio applicato. Si consiglia la realizzazione di studi pilota per testare la minima quantità di olio necessario per la consegna controllata a base d'acqua stimolanti chimici.
Inoltre, abbiamo riscontrato alcun effetto di olio sulla linea di base dell'attività neurale all'interno pectinal sensilli 8. Questo dovrebbe essere confermata per sistemi modello anche altri, prima di valutare chemoresponsiveness.
Questo metodo può essere utilizzato in combinazione con un altro metodo per testare gli effetti di interazione tra chemoresponse sensilli nel campo sensoriale. Per esempio, è possibile punta di record (in olio) da un sensillum come base-record (tramite un elettrodo di tungsteno) da un sensillum vicina 9. Tale configurazione di registrazione possono essere utilizzati per valutare anche di costituzione chimica stimolante sensillum influenza l'attività neurale della base-registrato sensillum. Ad oggi, nessuno ha testato questa per pectinal sensilli scorpione, e resta una questione aperta per gli altri sistemi chemosensoriali pure.
Per riassumere, pensiamo che la punta di registrazione metodo del petrolio sotto i progressi nel campo di applicazione indagini elettrofisiologiche nelle basi neurali di gustazione artropodi. In questo manoscritto, mettiamo a disposizione un protocollo per la preparazione degli animali per questo metodo, e speriamo che fornisce una solida base per ulteriori studi di sistemi sensoriali nervoso periferico.
Disclosures
Abbiamo già pubblicato questi metodi in due riviste, Knowlton e Gaffin (2009) e Knowlton e Gaffin (in stampa).
Acknowledgments
Ringraziamo il fondo di Vita, Università di Oklahoma Undergraduate Research Program Opportunità, e il Dipartimento di Zoologia per finanziare questo lavoro. Ringraziamo anche il Dott. Hoefnagels Marielle aiuto editoriale.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lift-N-Press tab | Ted Pella, Inc. | 16082 | Doubled-sided adhesive |
| MicroFil | World Precision Instruments, Inc. | MF34G | Micropipette filler |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-6 | Glass pipettes |
| Micr–lectrode Holder | World Precision Instruments, Inc. | MEH3SBW10 |
References
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