Summary
Este artigo descreve um método eletrofisiológico para isolar a estimulação química sensilla individuais via extracelular, tip-gravações sob óleo mineral.
Abstract
Nós descrevemos uma modificação de uma técnica existente 1,2 ponta de gravação para eletrofisiologicamente investigando curto, peg-like sensilla sensoriais 3,4. Na superfície ventral de todos os escorpiões são dois apêndices chamados pectinas, que têm campos densos de mecano-peg e chemosensory sensilla 5,6. Um método para avaliar chemoresponsiveness destes sensilla usa um eletrodo de tungstênio para extracelularmente gravação atividade neural dentro de um sensillum como um odorant volátil é introduzido no campo sensorial 5,7. As limitações deste método incluem a coleta de dados lento e estimulante introdução não controlada, e remoção de, no campo peg. Para superar essas limitações, desenvolvemos uma técnica de ponta de gravação de novo que usa óleo mineral apolares como um meio através do qual a entregar à base de água tastants para indivíduo peg sensilla 8,9. Nós temos aplicado com sucesso este método para obter chemoresponses sensillar ao ácido cítrico, etanol e sal. Aqui nós descrevemos o protocolo experimental para tal estudo 9. Nós pensamos que este novo método pode ser útil para estudar as propriedades de resposta de outros artrópodes chemosensory sistemas, incluindo os dos insetos 10, 11 e 12 de crustáceos.
Protocol
1. Pré-gravação, Preparação Animais Vivos
- Remova o escorpião do seu jar casa e colocá-lo em um recipiente de vidro pré-refrigerados; seguinte, coloque o jar contendo o escorpião em um ambiente de congelamento (-5 ° C) por um período mínimo de dois minutos. Este tempo pode variar de acordo com a idade, tamanho, espécies, etc do escorpião específica em estudo. Mas, geralmente, a fase de ambiente de congelamento é completo quando o animal está imóvel.
- Depois de dois minutos, retire o escorpião imobilizado do recipiente de vidro frio, e colocá-lo lado ventral para cima sobre uma lâmina de microscópio. Segura o ferrão, cauda, pernas e pedipalpos com barro moldável (à base de óleo, Van Aken Plastalina).
- Tornar uma plataforma na qual a colocar pectinas do escorpião. Ajustar o comprimento da plataforma e largura de acordo com o tamanho do pecten. Tipicamente, as nossas plataformas são construídos a partir de tampa de vidro do microscópio e são aproximadamente 10 (L) X 18 mm (W).
- Aderem fita dupla face adesiva para a plataforma pecten, aparando a fita (se necessário) para se adequar.
- Para fazer com que uma câmara pectínios, coloque três dos quatro lados da plataforma, em pré-fundido de cera (que usam chips de cera de abelha 100%) a uma profundidade de 3-4 mm. Nós derreter a cera, colocando as fichas em uma placa de Petri de vidro, localizada em uma chapa quente. Uma vez que a cera nas bordas da câmara de pectínios é resfriado a temperatura ambiente, este deve criar paredes de cera cerca de 1 mm de altura.
- Sobre o animal, localizar o ponto de inserção pectínios, e coloque a borda un-encerado da plataforma (fita up-side) imediatamente posterior a ele. Depois, estabilizar a plataforma (para que ele não se moverá mais tarde) pressionando suavemente a sua direita e esquerda bordas periféricas contra o barro utilizado para limitar as pernas do animal.
- Use uma pinça de ponta fina, coloque cuidadosamente a pecten pectinas ou no interior da câmara. Especificamente, usando uma pinça, segure o pecten ao longo da espinha pectínios, e gentilmente trazer o pecten de baixo da tampa de vidro e abaixá-lo para o chão plataforma adesivo. Estabelecer um vínculo pecten-para-fita com cuidado de aplicar pressão sobre a coluna pectínios.
- Agora, aplique cera derretida (nós usamos uma espátula de metal pré-aquecido) até a borda un-encerado da plataforma. O objetivo é duplo, para garantir a pecten e para envolver completamente a câmara para futura introdução de óleo mineral. Tenha cuidado ao aplicar a cera sobre pecten do animal, como é possível danificar o pecten com cera que é muito quente.
- A construção da câmara pecten está completa. Em seguida, estabeleça uma conexão eletrodo indiferente com hemolinfa do animal através da inserção de um fio de prata entre dois segmentos da cauda.
2. Gravação simultânea Extracelular e Estimulação Química
- Nós preparamos o animal 24 horas antes da realização extracelular, tip-gravações, que, entre outras razões (ou seja, ajuste de posição fixa para animais), dá tempo para fazer custom-pipetas de um estimulante específico (sensillum-dependente) da ponta de diâmetro. Usamos um extrator micropipeta para se alcançar tais especificações. Idealmente, o diâmetro das pipetas é ≈ 2 M maior do que o diâmetro dos poros sensillar. Nós ajustamos nossas especificações micropipeta de acordo para cada animal.
- 1 h antes da gravação, adicionar 5 mL de óleo mineral para a câmara de pectínios, submergindo o pecten sob óleo. Então, a posição do animal debaixo de um microscópio de alta potência, que há muito trabalho a distância e objetivos epi-iluminação.
- Para estimular quimicamente peg sensilla, introduzimos tastants aquoso (ou seja, ácido cítrico e sal) por meio de óleo. Primeiro, usamos um enchimento micropipeta para injetar o estimulante para a pipeta estimulante. Nota: todas as soluções estimulante deve conter um eletrólito de condutância elétrica.
- Em seguida, após o posicionamento da pipeta estimulante em um micromanipulador (no equipamento de gravação), insira o eletrodo de registro para o fim, sem corte aberto da pipeta estimulante. É importante para garantir o contato entre o eletrodo de metal e uma solução eletrolítica estimulante.
- Uma vez que a preparação é eletricamente aterrado (através do eletrodo indiferente), simplesmente diminuir a pipeta através do meio de petróleo e em um poro sensillar. A duração da estimulação química por sensillum pectínios pode variar de tanto quanto 30 minutos para apenas um segundo. Geralmente, podemos amostra pinos múltiplos (> 30) por pipeta. No caso em que a pipeta estimulantes torna-se obstruídas por escombros minuto, simplesmente trocar a pipeta entupidos de uma pipeta, nova sem uso.
3. Preparação de um animal por vários dias de Experimentação
- Se o animal deve ser usado durante um período de tempo prolongado, recomendamos a reutilização da câmara pectínios e substituindo a gota de óleo mineral para cada sessão de gravação. Após a sessão de um determinado dia de gravação estiver concluída, remova o animal a partir da gravação de set-up e fazer uma lavagem de óleo mineral.
- Specifically, adicionar uma gota (5 L) de óleo mineral para a câmara, e remover todo o óleo. Isso ajuda a minimizar a presença de estimulantes residual, o que pode ter vazado para fora da pipeta durante a sessão de gravação.
- Antes da próxima sessão, adicione uma gota de óleo como descrito anteriormente.
4. Resultados representativos:
Dependendo do equipamento de gravação utilizado (por exemplo, o amplificador particular, digitalização hardware, etc), um resultado representativo é uma gravação extracelular com um S: N proporção de pelo menos 3:1.
Sucesso na construção da câmara de óleo mineral é necessário para isolar a estimulação química sensilla individual, uma vez que fornece um meio para a entrega tastants química polar (à base de água) 8. Se houver óleo muito pouco ou mesmo nenhum, a solução vai se espalhar estimulante do sensillum gravadas ao seu sensilla vizinhos, o que é susceptível de causar um ataque prolongado e descontrolado de químicos estimulação 8.
Discussion
O protocolo acima descreve como preparar um deserto pastagens escorpião (Paruroctonus utahensis) para estudo eletrofisiológico. Especificamente, mostramos como construir uma câmara de controle extracelular ponta gravações de pectínios neurônios chemosensory sob óleo. Porque água e óleo não se misturam, é possível isolar a estimulação química (com base de água estimulantes) para sensilla único. Deve-se ressaltar que P. utahensis, é um animal relativamente pequeno (≈ 2,5-5 cm) e aplicando este protocolo para animais maiores podem exigir ajustes de tamanho de muitos, tais como o tamanho da plataforma do animal, de câmara, e quantidade de óleo aplicado. Recomendamos a realização de estudos-piloto para testar a quantidade mínima de óleo necessária para liberação controlada de estimulantes à base de água química.
Além disso, não houve efeito do óleo sobre a atividade neural de base dentro pectínios sensilla 8. Este deve ser confirmado para sistemas de outro modelo, bem como, antes de avaliar chemoresponsiveness.
Este método pode ser usado em conjunto com outro método para testar efeitos de interação entre chemoresponse sensilla no campo sensorial. Por exemplo, é possível registrar-ponta (em óleo) a partir de uma base de sensillum como registro (através de um eletrodo de tungstênio) de uma sensillum vizinhos 9. Essa configuração de gravação pode ser usada para avaliar se deve ou não quimicamente estimulando uma sensillum afeta a atividade neural do sensillum-base registrados. Até o momento, ninguém testou isso por escorpião pectínios sensilla, e permanece uma questão em aberto para outros sistemas chemosensory também.
Para resumir, nós achamos que o método de gravação de ponta em avanços de petróleo do âmbito de investigações eletrofisiológicas para a base neural da gustação artrópodes. Neste manuscrito, nós fornecemos um protocolo para a preparação de animais para este método, e esperamos que fornece uma base sólida para um estudo mais aprofundado de periféricos sensoriais sistema nervoso.
Disclosures
Temos publicados anteriormente estes métodos em dois jornais, Knowlton e Gaffin (2009) e Knowlton e Gaffin (no prelo).
Acknowledgments
Agradecemos do fundo de Vida, Universidade de Oklahoma Graduação de Pesquisa do Programa Oportunidades, e do Departamento de Zoologia para o financiamento deste trabalho. Agradecemos também Hoefnagels Dr. Marielle para ajudar a editorial.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lift-N-Press tab | Ted Pella, Inc. | 16082 | Doubled-sided adhesive |
| MicroFil | World Precision Instruments, Inc. | MF34G | Micropipette filler |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-6 | Glass pipettes |
| Micr–lectrode Holder | World Precision Instruments, Inc. | MEH3SBW10 |
References
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