Summary
I artikeln beskrivs en elektrofysiologisk metod för att isolera kemiska stimulans till enskilda sensilla via extracellulära, spets-inspelningar under mineralolja.
Abstract
Vi beskriver en ändring av en befintlig spets-inspelningsteknik 1,2 för elektrofysiologi utreda korta, PEG-liknande sensoriska sensilla 3,4. På mitten av ventrala ytan av alla skorpioner är två bihang som kallas pectines, som har täta områden redskap för och chemosensory PEG sensilla 5,6. En metod för att bedöma chemoresponsiveness av dessa sensilla använder en volfram elektrod för extracellularly inspelning neural aktivitet inom en sensillum som flyktiga luktämnen introduceras till den sensoriska fältet 5,7. Begränsningarna av denna metod är bland annat långsamma datainsamling och okontrollerade stimulerande introduktion till och förs ut ur tappen fältet. För att övervinna dessa begränsningar har vi utvecklat en ny spets-inspelning teknik som använder opolära mineralolja som ett medium genom vilket leverera vattenbaserade tastants till enskilda PEG sensilla 8,9. Vi har framgångsrikt tillämpat denna metod för att få sensillar chemoresponses till citronsyra, etanol, och salt. Här beskriver vi den experimentella protokoll för en sådan studie 9. Vi tror att denna nya metod kan vara användbart för att studera svaret egenskaperna hos andra leddjur chemosensory system, inklusive insekter 10, 11 och skaldjur 12.
Protocol
1. Pre-inspelning, Live Animal Förberedelser
- Ta bort skorpionen från sitt hem burken och placera den i en pre-kylt glas behållare, Placera burken med skorpionen i en frysning miljö (-5 ° C) i minst två minuter. Denna tid kan variera beroende på ålder, storlek, art, etc. av de särskilda skorpion under utredning. Men generellt är frysning miljö fasen klar när djuret är orörlig.
- Efter två minuter, ta den immobiliserade skorpionen från kylan glasbehållaren, och placera den ventrala sidan upp på ett objektglas. Säkra Stinger, svans, ben och pedipalps med formbar lera (oljebaserade, Van Aken Plastalina).
- Gör en plattform för att sätta Skorpionens pectines. Justera plattformens längd och bredd beroende på storlek Pecten. Normalt är våra plattformar konstruerat av mikroskop skyddsglas och är ungefär 10 (L) x 18 (B) mm.
- Följ dubbelhäftande tejp till Pecten plattformen, trimning bandet (om nödvändigt) att passa.
- För att göra en pectinal kammare, satte tre av plattformens fyra sidor i på förhand smält vax (vi använder 100% bivax marker) till ett djup av 3-4 mm. Vi smälter vaxet genom att placera marker i ett glas petriskål, som ligger på en värmeplatta. När vax på kanterna av pectinal kammaren är kyld till rumstemperatur, bör detta skapa murar av vax ca 1 mm höga.
- På djuret, hitta den punkt pectinal insättning och placera den FN-vaxade kanten av plattformen (bandets sida-upp) bara bakre till det. Efteråt stabilisera plattformen (så att den inte kommer att flytta längre fram) genom att försiktigt trycka på dess högra och vänstra perifera kanter mot leran som används för att begränsa djurets ben.
- Använd spetsig pincett för att försiktigt placera Pecten eller pectines inne i kammaren. Närmare bestämt, med hjälp av pincett, hålla Pecten längs pectinal ryggraden, och försiktigt föra Pecten ut från under locket glaset och sänk den på självhäftande plattformen golvet. Upprätta en Pecten-till-band obligationen med noggrant sätta press på pectinal ryggraden.
- Nu gäller smält vax (vi använder en förvärmd metallspateln) till FN-vaxade kanten av plattformen. Syftet är dubbelt, för att säkra Pecten och för att fullständigt innesluta kammaren för framtida mineralolja introduktion. Var försiktig vid tillämpning av vax över djurets Pecten, eftersom det är möjligt att skada Pecten med vax som är för varm.
- Den Pecten kammaren konstruktionen är klar. Därefter skapa en likgiltig elektrod samband med djurets hemolymph genom att sätta in en silvertråd mellan två svansen segment.
2. Samtidig Extracellulär inspelning och kemisk stimulering
- Vi förbereder djuret 24 timmar före bedriva extracellulära, spets-inspelningar, vilket bland andra skäl (dvs. djur anpassning till fast läge) ger företagen tid att skräddarsy stimulerande pipetter av en specifik (sensillum-beroende) tip-diameter. Vi använder en mikropipett avdragare för att uppnå sådana specifikationer. Idealet är diametern på pipetter ≈ 2 ìm större än sensillar pordiameter. Vi anpassar våra mikropipett specifikationer detta för varje djur.
- 1 timme före inspelning, lägger vi 5 ìl av mineralolja till pectinal kammaren, dränka Pecten i olja. Sedan position vi djuret under en kraftfull mikroskop, som länge har arbetsavstånd mål och epi-belysning.
- Att kemiskt stimulera PEG sensilla presenterar vi vattenlösning tastants (dvs. citronsyra och salt) genom olja medium. Först använder vi en mikropipett fyllmedel att injicera stimulerande i stimulerande pipetten. Observera: alla stimulerande lösningar skall innehålla en elektrolyt för elektrisk ledningsförmåga.
- Nästa efter att placera stimulerande pipetten på ett mikromanipulator (i inspelningen rigg), sätter inspelningen elektroden i den trubbiga, öppna änden av stimulerande pipetten. Det är viktigt att säkerställa kontakt mellan metall-elektrod och elektrolytisk stimulerande lösning.
- När beredningen är jordade (via likgiltiga elektrod), helt enkelt sänka pipetten genom olja medium och på en sensillar por. Varaktigheten av kemisk stimulering per pectinal sensillum kan variera från så mycket som trettio minuter till så lite som en sekund. Generellt kan vi prov flera pinnar (> 30) per pipett. I händelse av att den stimulerande pipetten blir igensatta med min skräp, helt enkelt byta ut igensatt pipett för en ny, oanvänd pipett.
3. Förbereda ett djur för flera dagar av experiment
- Om djuret ska användas under en längre tid, rekommenderar vi att återanvända pectinal kammaren och ersätta den droppe mineralolja för varje inspelning. Efter en viss dag inspelningen är klar, ta bort djuret från inspelningen set-up och utföra en tvätt mineralolja.
- Specigramvara som särskilt, lägga till ytterligare en droppe (5 l) av mineralolja till kammaren, och ta bort all olja. Detta hjälper till att minimera förekomsten av rester stimulerande, som kan ha läckt ut av pipetten under inspelningen.
- Innan nästa session, lägg en droppe olja som beskrivits tidigare.
4. Representativa resultat:
Beroende på inspelningen utrustning som används (t.ex. särskilda förstärkare, digitalisering hårdvara, etc.), är ett representativt resultat ett extracellulärt inspelning med en S: N ratio på minst 3:1.
Framgångsrik byggandet av mineralolja kammaren är nödvändigt för att isolera kemiska stimulans till enskilda sensilla, eftersom det ger ett medium för att leverera polära (vattenbaserad) kemiska tastants 8. Om det är för lite olja eller ingen alls, kommer stimulerande lösning som sprids från de inspelade sensillum till dess angränsande sensilla, vilket sannolikt kommer att orsaka en långvarig, okontrollerad anfallen av kemisk stimulering 8.
Discussion
Protokollet ovan beskriver hur man förbereder en öde gräsmark skorpion (Paruroctonus utahensis) för elektrofysiologiska studier. Specifikt visar vi hur man bygger en kammare för kontrollerad extracellulära spets-inspelningar av pectinal chemosensory nervceller i olja. Eftersom olja och vatten inte hör ihop, är det möjligt att isolera kemiska stimulering (med vattenbaserad stimulerare) till enstaka sensilla. Det bör betonas att P. utahensis, är en relativt liten djur (≈ 2,5-5 cm) och tillämpa detta protokoll för att större djur kan behöva många stora justeringar, till exempel storleken på djuret plattform, kammare och mängden olja som används. Vi rekommenderar att genomföra pilotstudier för att testa den minsta mängd olja som behövs för kontrollerad leverans av vatten-baserade kemiska stimulantia.
Vidare fann vi ingen effekt av olja på baslinjen neural aktivitet inom pectinal sensilla 8. Detta bör bekräftas av andra modellsystem också, innan en bedömning chemoresponsiveness.
Denna metod kan användas tillsammans med en annan metod för att testa för chemoresponse interaktionseffekter mellan sensilla i sensoriska området. Till exempel är det möjligt att tip-post (i olja) från ett sensillum som vi base-post (via en volfram elektrod) från ett angränsande sensillum 9. En sådan inspelning konfiguration kan användas för att bedöma om inte kemiskt stimulerande ett sensillum påverkar neural aktivitet base-inspelade sensillum. Hittills har ingen testat detta för skorpion pectinal sensilla, och det är fortfarande en öppen fråga för andra chemosensory system också.
För att summera, vi tror att tip-in metoden inom olja framsteg ramen för elektrofysiologiska undersökningar av neurala grunden för leddjur gustation. I detta manuskript ger vi ett protokoll för att förbereda djur för denna metod, och vi hoppas att det ger en fast grund för vidare studier av perifera sensoriska nervsystemet.
Disclosures
Vi har tidigare publicerat dessa metoder i två tidskrifter, Knowlton och Gaffin (2009) och Knowlton och Gaffin (under tryckning).
Acknowledgments
Vi tackar LIFE-fond, University of Oklahoma Grundutbildning möjligheter forskningsprogram och Zoologiska institutionen för finansiering detta arbete. Vi vill också tacka Dr Marielle Hoefnagels för redaktionell hjälp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lift-N-Press tab | Ted Pella, Inc. | 16082 | Doubled-sided adhesive |
| MicroFil | World Precision Instruments, Inc. | MF34G | Micropipette filler |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-6 | Glass pipettes |
| Micr–lectrode Holder | World Precision Instruments, Inc. | MEH3SBW10 |
References
- Hodgson, E. S., Lettvin, J. Y., Roeder, K. D. Physiology of a Primary Chemoreceptor unit. Science. 12, 417-418 (1955).
- Newland, P. L. Taste processing in the insect nervous system. Methods in Insect Sensory Neuroscience. Christensen, T. A. , CRC Press. Boca Raton. 289-318 (2005).
- Foelix, R. F., Müller-Vorholt, G. The fine structure of scorpion sensory organs II. Pecten sensilla. Bull. Br. Arachnol. Soc. 6, 68-74 (1983).
- Carthy, J. D. Fine structure and function of the sensory pegs on the scorpion pecten. Experientia. 22, 89-91 (1966).
- Gaffin, D. D., Brownell, P. H. Response properties of chemosensory peg sensilla on the pectines of scorpions. J. Comp. Physiol. A. 181, 291-300 (1997).
- Wolf, H. The pectine organs of the scorpion, Vaejovis spinigerus: Structure and (glomerular) central projections. Arthropod Struct. Dev. 37, 67-80 (2008).
- Gaffin, D. D., Brownell, P. H. Electrophysiological evidence of synaptic interactions within chemosensory sensilla of scorpion pectines. J. Comp. Physiol. A. 181, 301-307 (1997).
- Knowlton, E. D., Gaffin, D. D. A new approach to examining scorpion peg sensilla: the mineral oil flood technique. J. Arachnol. 37, 379-382 (2009).
- Knowlton, E. D., Gaffin, D. D. A new tip-recording method to test scorpion pecten chemoresponses to water-soluble stimulants. J. Neurosci Methods. , Forthcoming Forthcoming.
- Haupt, S. S. Antennal sucrose perception in the honey bee (Apis mellifera L.): behaviour and electrophysiology. J. Comp. Physiol. A. 190, 735-745 (2004).
- Bland, R. G. Sensilla on the antennae, mouthparts, and body of the larva of the alfalfa weevil, hypera postica (gyllenhal) (Coleoptera : Curculionidae). Int. J. Insect Morphol. Embryol. 12, 261-272 (1983).
- Cate, H. S., Derby, C. D. Hooded Sensilla Homologues: Structural Variations of a Widely Distributed Bimodal Chemomechanosensillum. J. Comp. Neurol. 444, 345-357 (2002).
