الإسفار التكملة ثنائي الجزيء

Summary

توطين التحت خلوية من البروتينات مهم في تحديد لائحة المكانية والزمانية لمن إشارات الخلية. هنا ، نحن تصف تكامل مضان ثنائي الجزيء (BiFC) كوسيلة مباشرة لرصد التفاعلات المكانية من البروتينات في الخلية.

Abstract

تحديد التوزيع التحت خلوية المجمعات إشارة لا بد من فهم أن الإخراج من التعقيد. الأساليب التقليدية مثل مناعي لا تقدم معلومات على توطين المكاني للمجمعات. في المقابل ، BiFC يراقب التفاعل والتقسيم التحت خلوية مجمعات البروتين. في هذه الطريقة ، يتم تقسيم البروتين fluororescent إلى أجزاء غير الفلورسنت الأمينية وكربوكسي المحطة ، التي تنصهر بعد ذلك إلى اثنين من البروتينات المثيرة للاهتمام. تفاعل البروتينات النتائج في إعادة تشكيل fluorophore (الشكل 1) ^1،2. وجود قيود على BiFC أنه بمجرد تشكيل لfluorophore تجزئة معقدة لا رجعة فيه ^3. هذا القيد هو مفيد في الكشف عن التفاعلات عابرة أو ضعيفة ، ولكن ما يحول دون إجراء تحليل للديناميات الحركية المعقدة. تحذيرا إضافيا هو أن flourophore يتطلب إعادة 30min حتى تنضج ويتألق ، النافية مرة أخرى مراقبة التفاعلات الوقت الحقيقي ^4. BiFC هو مثال محدد للتكامل فحص البروتين شظية (PCA) الذي يعمل مراسلا من البروتينات مثل بروتين الفلورية الخضراء المتغيرات (BiFC) ، dihydrofolate مختزلة ، ب اكتاماز ، وluciferase لقياس البروتين : البروتين ^5،6 التفاعلات. طرق بديلة لدراسة البروتين : تفاعلات البروتين في الخلايا وتشمل الطاقة مضان بالرنين شارك في توطين ونقل فورستر (الحنق) ^7. لتوطين المشترك ، والموسومة فردي اثنين من البروتينات إما مباشرة مع fluorophore المناعي أو غير مباشر. ومع ذلك ، فإن هذا النهج يؤدي إلى خلفية عالية من البروتينات غير التفاعل مما يجعل من الصعب تفسير شارك في توطين البيانات. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا للحدود قرار المجهري متحد البؤر ، قد تظهر اثنين من البروتينات المشترك المترجمة دون التفاعل بالضرورة. مع BiFC ، يلاحظ فقط مضان عندما اثنين من البروتينات الفائدة تفاعل. الحنق آخر هو طريقة ممتازة لدراسة البروتين : البروتين التفاعلات ، ولكن يمكن أن يكون تحديا تقنيا. الحنق التجارب تتطلب المانحة ومتقبل لتكون مماثلة من السطوع ورياضيات الكيمياء في الخلية. بالإضافة إلى ذلك ، لا بد من حساب واحد عن طريق التسييل من المانحين في القناة متقبل والعكس بالعكس. بخلاف الحنق ، BiFC ومضان الخلفية قليلا ، وبعد تجهيز البيانات القليل من الصور ، لا يتطلب overexpression عالية ، ويمكن الكشف عن التفاعلات الضعيفة أو عابرة. نقل الطاقة الرنين ضوء بارد (بريت) هي طريقة مشابهة لالحنق باستثناء الجهة المانحة هو انزيم (مثل luciferase) الذي يحفز لتصبح ركيزة bioluminescent مثيرة مما يتسبب المتقبلة. بريت يفتقر المشاكل التقنية عن طريق التسييل ومضان خلفية عالية لكنه يفتقر الى القدرة على توفير المعلومات المكانية نظرا لعدم وجود ركيزة لتوطين المقصورات الخاصة ^8. عموما ، BiFC هو وسيلة ممتازة لتصور التعريب التحت خلوية مجمعات البروتين لاكتساب نظرة ثاقبة يشير مجزأة.

Protocol

ألف BiFC المعايرة

1. اختيار fluorophore هناك fluorophores متعددة ، مثل YFP والزهرة ، التي تعمل بشكل جيد كشركاء الانصهار BiFC (الجدول 1). تاريخ الأمينية وكربوكسي محطة - فينوس قادرون على تشكيل المجمع في 37 درجة مئوية ، في حين أن شظايا BiFC YFP تتطلب الحضانة في مرحلة ما قبل 30 درجة مئوية وذلك لتسهيل تشكيل fluorophore ^2. قد يكون هذا الاحتضان في درجة حرارة منخفضة تغيير بعض العمليات الخلوية وينبغي أن تؤخذ في الاعتبار عند اختيار شظايا. نواقل التفجير فينوس إلى محطة كربوكسي البروتينات المتوفرة من Addgene ( http://www.addgene.org/pgvec1 ؛ seepBiFC - VN173 وpBiFC VC155) جنبا إلى جنب مع ثوابت إضافية لاستخدامها في الضوابط ، وعلى سبيل المثال ، pBiFC - bJunVN173 وpBiFC bFosVC155 - ^2. ناقلات إضافية ، بما في ذلك ناقلات فينوس المطراف الأميني (VN173 وpFLAG - PHA VC155) ، متاحة على الموقع التالي : http://people.pnhs.purdue.edu/ hu1 ~ / .
2. العلامة البروتين من الفائدة. وتنصهر وشظايا BiFC إلى أقاصي الأمينية أو كربوكسي المحطة ، من البروتينات مرشح. بعض البروتينات قد لا تسمح لوضع علامات على طرفي بسبب اضطراب في وظيفة البروتين. على سبيل المثال ، العديد من أعضاء الفصيلة من رأس GTPases يتم تعديل المادة الدهنية في المرفق كربوكسي محطة النافية بالتالي شظايا BiFC في تحقيق هذه الغاية. وهكذا ، فإنه من المهم أن يكون فكرة عن كيفية الحجز على شظايا BiFC قد تؤثر على وظيفة من البروتينات المثيرة للاهتمام. وينبغي إذا كان من غير الواضح كيف علامات البروتين سيؤثر يتم اختبار تركيبات وظيفتها متعددة. بالإضافة إلى جزء BiFC ، قد يتم تضمين رابط الببتيد لزيادة المرونة بين fluorophore مجزأة والبروتينات مرشح. في حين أن الاستنساخ مواقع متعددة (MCS) في ناقلات BiFC ترميز قصيرة تمتد من الأحماض الأمينية التي يمكن أن توفر قدرا كافيا من المرونة ، وRSIAT ، KQKVMNH وlinkers RPACKIPNDLKQKVMNH وقد استخدمت بنجاح في التجارب BiFC ^3،9
3. تحديد شروط ترنسفكأيشن قبل اختبار طفرات متعددة ، وينبغي إجراء تجارب مراقبة قليلة. الأولين تركيبات BiFC التي يجب أن يحاكم واثنين من البروتينات النوع البري التي هي معروفة للتفاعل ونوع واحد البرية والمسخ التي لا تتفاعل. تستخدم هذه المجموعات يتعين عليهما أن كميات مختلفة من اختبار الحمض النووي وتحديد أوقات ترنسفكأيشن الظروف المثلى للكشف عن إشارة BiFC للبروتينات مرشح. نقترح اختبار 0.25ug ، 0.5ug ، 1.0ug كل بناء BiFC لفترة واحدة جيدا 6 طبق بشكل جيد. بعد يوم من الخلايا بواسطة المجهر مراقبة ترنسفكأيشن مضان لتحديد الوقت الأمثل لتحقيق التنمية إشارة. و pBiFC - bJunVN173 وpBiFC - bFosVC155 يبني ² هي الضوابط الإيجابية مفيدة للBiFC وتتوفر من Addgene (انظر أعلاه). بالإضافة ، يجب إجراء تحليل لطخة غربية لتأكيد المساواة في التعبير يبني. وينبغي اختيار الأوضاع ويلاحظ ان هذه هي الملاحظة إشارة الفلورية بين نوعين من البروتينات الطبيعية ولكن القليل لعدم وجود إشارة بين نوع من البروتينات البرية ومتحولة. أخيرا ، فمن الأفضل للحفاظ على التعبير البروتين عند أدنى مستوى ممكن لمنع أي التفاعلات غير محددة.
4. بالإضافة إلى ذلك تحديد ما إذا كان من شظايا BiFC يغير التعريب من البروتينات التي تهم كل بناء BiFC يحتوي إما على سطحه أو العلامة حاتمة FLAG. transefected Immunostain الخلايا HA على حد سواء أو FLAG علامة حاتمة فضلا جيدا للبروتين الذاتية (إن أمكن) لتحديد ما إذا كانت العلامة BiFC يؤثر توطين البروتينات المثيرة للاهتمام.

وباء التصفيحات ترنسفكأيشن من الخلايا

1. ومطلي الخلايا COS (1.3x10 ⁵⁾ على كل كوب واحد أسفل لوحة ماتيك وبئرين لوحة 6 - جيدا لكل عينة. يسمح للخلايا لتسوية بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. ويمكن أيضا أنواع الخلايا التي هي بديل أكثر ملاءمة لمصلحة مرشح من بروتينات يمكن استخدامها.
2. تعد السلطات الوطنية المعينة لترنسفكأيشن. نحن نستخدم عادة Lipofectamine (Invitrogen) لtransfections COS. ومع ذلك ، قد كواشف أخرى تكون أكثر ملائمة للخط الخلوي من الفائدة. منذ سيتم تقسيم الخليط ترنسفكأيشن بين كوب واحد الطبق السفلي وبئرين لوحة 6 - جيدا ، واستخدام كمية مناسبة من الحمض النووي لحساب هذا الانقسام. مخفف من الحمض النووي في 250uL DMEM المصل (SF) مجانا. إضافة CFP على مبلغ 1 / 5 من السلطات الوطنية المعينة BiFC مجموع كعنصر تحكم ترنسفكأيشن. لالكمي BiFC ، سيتم تحليل الخلايا فقط التي هي ايجابية للCFP عن وجود إشارة BiFC. علما بأن أطياف CFP سوف تتداخل مع بعض أزواج BiFC في الجدول رقم 1 ، وبالتالي عنصر تحكم ترنسفكأيشن البديلربما هناك حاجة. تمييع Lipofectamine في 250uL SF DMEM (10uL Lipofectamine/1ug من الحمض النووي). مزيج من الحمض النووي والتخفيفات Lipofectamine. يحضن في درجة حرارة الغرفة ل20min.
   ملاحظة : Lipofectamine : نسبة الحمض النووي يمكن أن تختلف تبعا لنوع من الخلايا. استخدام الأسلوب المناسب لترنسفكأيشن خط خلية من الفائدة.
3. شطف الخلايا 2X مع DMEM SF الدافئة. إضافة 2mL من DMEM SF إلى كل لوحة من الزجاج أو أسفل جيدا طبق 6 - جيدا.
4. تقسيم كل خليط ترنسفكأيشن بالتساوي بين كوب واحد الطبق السفلي وبئرين من صحن 6 - جيدا.
5. احتضان خلايا عند درجة 37 ل5hrs.
6. إزالة واستبدال وسائل الاعلام ترنسفكأيشن الكامل مع وسائل الاعلام (FBS DMEM +10 ٪).
7. الخلايا احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. سوف طول ترنسفكأيشن التالية الحضانة تختلف تبعا لمستويات التعبير من البروتينات المثيرة للاهتمام. حضانة لفترات طويلة قد يؤدي إلى التفاعل غير محددة حتى هذه الخطوة سوف تحتاج إلى أن تحدد تجريبيا.

جيم إعداد خلايا للتصوير

1. ويتم فحص الخلايا في البداية تحت المجهر epifluorescent لضمان السيطرة الإيجابية الفلورسنت. إذا لم يكن كذلك ، قد يكون من الضروري السماح للخلايا وقتا إضافيا عند 37 درجة مئوية حتى لاحظ إشارة.
2. شطف الخلايا 3X مع برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.4). إلى الخلايا في وعاء زجاجي القاع إضافة بارافورمالدهيد 2 ٪ (7.4 درجة الحموضة). إصلاح الخلايا 10min على الجليد. شطف الخلايا 3X مع برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.4). تخزين الخلايا في 4 درجات مئوية مغطاة PBS 1mL (الرقم الهيدروجيني 7.4). الخلايا لا يجب أن تكون ثابتة للتصوير ، ولكن بمجرد شظايا BiFC بإصلاح fluorophore سليمة فإنه لا رجعة فيه تحليل وبالتالي منع التفاعلات الحيوية ^3. أيضا ، أن نضع في الاعتبار أن الخلايا غير المثبتة سوف تستمر في تطوير الإشارة. ليز الخلايا في الطبق 6 - جيدا ، وأن يستعدوا للتحليل لطخة lysates الغربية. من المهم أن يتم إعداد كافة الخلايا في نفس الوقت بحيث الخلايا lysed تمثل الخلايا المصورة.

دال خلايا التصوير

1. وسيتم احتساب كثافة مضان لكل خلية. تأكد من الخلايا صورة فردية.
2. أدرج CFP كعنصر تحكم tranfection ويتم اختيار الخلايا CFP الإيجابية الوحيدة لتحليل الإشارات BiFC. يمكننا أن نجعل من افتراض أنه إذا transfected الخلية مع CFP ، هو transfected أيضا مع ثوابت BiFC. هذا النهج يضمن أن الخلايا التي تفتقر التقط اشارة BiFC سلبية نظرا لعدم وجود تفاعل بين البروتينات التي تهم وليس بسبب عدم وجود واحد أو كلا بنيات التعبير BiFC في تلك الخلية.
3. نستخدم LSM زايس مجهر 510 مبائر التصوير الخلية. عند استخدام هذا المجهر من المهم للحفاظ على التكبير ، والثقب ، واكتساب كاشف ، مكبر للصوت إزاحة ، حجم الإطار ، وسرعة المسح الضوئي ، ومتوسط ​​المسح الضوئي ، والليزر السلطة متناسقة. عند استخدام أي نظام التصوير من المهم للحفاظ على إعدادات ثابتة بحيث الاستشعاع للمقارنة بين العينات. أيضا ، عند قياس مضان من المهم أن لا يتم المشبعة بكسل.

هاء تحديد مقدار الإسفار

1. قد يكون كميا مضان باستخدام أي برنامج التصوير. نحن نستخدم ImageJ وهو متاح مجانا من المعاهد الوطنية للصحة (http://rsb.info.nih.gov/ij/). فتح ملفات الصور في ImageJ. انتقل إلى قياسات AnalyzeSet. خانات الاختيار للمنطقة ومتوسط ​​القيمة في مربع رمادي القياسات.
2. باستخدام أداة "الاختيار اليد الحرة ، ورسم الخطوط العريضة حول حافة الخلية بأكملها في القناة CFP.
3. ترك هذا المخطط في المكان ، والتحول إلى القناة YFP. انتقل إلى AnalyzeMeasure.
   رمادي متوسط ​​القيمة هو مجموع القيم الرمادية من كل بكسل في اختيار مقسوما على عدد من بكسل (أي متوسط ​​كثافة مضان في مجال الخلية).
4. لكل صورة رسم دائرة في القناة YFP في المنطقة التي لا تحتوي على الخلية. أخذ القياس لهذه المنطقة الخلفية. طرح الخلفية من كل صورة.
5. متوسط ​​قيمة متوسط ​​رمادي ناقص الخلفية لكافة الخلايا المصورة في عينة واحدة. وسوف يكون هذا هو متوسط ​​كثافة مضان لسكان من الخلايا. نقترح أن يكون كميا حوالي 60 خلايا على مدى ثلاث تجارب.

F. نتائج الممثل :

مختبرنا يركز على البروتين السقالات متعددة المجال ، intersectin (ITSN) التي تتفاعل مع بروتينات عديدة لتنظيم متعددة المسارات البيوكيميائية ويشير ^{10،11،12،13،14.} ITSN يحتوي على اثنين من تناظر Eps15 (EH) المجالات ، وهي منطقة ملفوف ، ملفوف ، وخمسة SRC تناظر 3 (SH3) المجالات. ويعد شكل الإسوي من ITSN يحتوي أيضا تناظر DBL (DH) وpleckstrin تناظر (PH) في المجالات التي تعمل كعامل الحفل تبادل النوكليوتيدات جوانين لCdc42 ^15. يعزز هذا الهيكل وحدات البروتين : بروتين تفاعلات ويجعل ITSN مرشحا مثاليا للتجارب BiFC. يمكن للتوطين التحت خلوية من ITSN تغيير شركائها ملزمة وبالتالي تغيير المسارات التي ينظمها ITSN (unpublisهد البيانات). مؤخرا ، أظهرت أن مختبرنا ITSN ينظم بقاء الخلايا العصبية من خلال تنظيم لPI3K رواية من الدرجة الثانية ، PI3K C2β - ^11. الأمينية ، محطة برو الغنية مجال C2β - PI3K يحتوي على موقعين ملزمة للنطاقات SH3 ITSN ل. استخدام المشترك مع ITSN مناعي والمسوخ اقتطاع PI3K - C2β أثبتنا أن SH3A ITSN والتفاعل مع المجالات SH3C المنطقة الأميني من محطة C2β - PI3K. المقبل ، استخدمنا BiFC لتصور التعريب التحت خلوية من هذا المجمع. وتنصهر ITSN إلى محطة الأمينية فينوس (pFLAG - VN173) ، ويبني PI3K - C2β تنصهر في النهاية كربوكسي لكوكب الزهرة (PHA - VC155). كما تحكم آخر سلبي ، وتنصهر الببتيد غير محددة لPHA - VC155. شكلت VN - ITSN وVC - PI3K C2β - مجمع BiFC مع توزيع نقط (الشكل 2A ، لوحات العليا). انخفض الطفرات في المجال برو الغنية PI3K - C2β التي تعرقل التعاون ترسيب ITSN وPI3K C2β - إشارة BiFC (الشكل 2A ، وانخفاض لوحات) ^11. وكان هذا الاختلاف في إشارة BiFC بين ITSN واثنين من البروتينات PI3K - C2β ليس بسبب الاختلافات في التعبير البروتين (الشكل 2B).

. الشكل 1 في BiFC ، يتم تقسيم fluorophore (في هذه الحالة فينوس) في الأمينية (VN) -- وكربوكسي (VC) ، تاريخ المحطة. وتنصهر هذه الغايات لاثنين من البروتينات المثيرة للاهتمام. عندما تتفاعل البروتينين ، وشظايا وVN VC إعادة المنتسبين مما أدى إلى إعادة تشكيل fluorophore ومضان في مواقع التفاعل. BiFC هو مثال محدد للتكامل فحص البروتين شظية (PCA) يستخدم لقياس البروتين : البروتين التفاعلات ^5.

الشكل 2. ITSN وPI3K - C2β تشكيل BiFC المعقدة. ألف VN - الموسومة كان ITSN المشترك tranfected مع VC - الموسومة WT - PI3K C3β أو مجال البرولين الغنية متحولة (PI3K - C2β والسلطة الفلسطينية). وشكل ITSN WT - PI3K C2β مجمع (الخضراء). وقد استخدم CFP (الحمراء) كعنصر تحكم ترنسفكأيشن باء أجري لطخة غربية لإظهار التعبير المتساوي للبنيات. والموسومة HA الرأسمالي الموسومة يبني.

الجدول رقم 1 ، وهناك عدة ناقلات التي تتوافق مع BiFC. YN155 : 1 - 155aa من YFP ؛ YC155 : 155 238aa من YFP ؛ YN173 : 1 - 172aa من YFP ؛ YC173 ، 173 - 238aa من YFP ؛ VN155 : 1 - 154aa فينوس ؛ VC155 : فينوس 155-238 ؛ VN173 : 1 - 172aa فينوس ؛ VC173 : 173 238aa فينوس ؛ CN155 1 ​​- 154aa من CFP ؛ CC155 155 238aa من CFP ، GN173 : 1 - 172aa من GFP ، CitN155 : 1 - 155aa من سيترين ، CitC155 : 155 من 238aa السيترين ، CitN173 : 1 - 172aa من سيترين ، CitC173 : 173 238aa من سيترين ، CerN173 : 1 - 172aa للأزرق ^2،3،9.

Discussion

BiFC هو وسيلة ممتازة لتصور البروتين : تفاعلات البروتين في الخلايا كلها وتحديد توطين التحت خلوية من هذه المجمعات. مزايا BiFC فقط هي التي تتفاعل البروتينات هي الفلورسنت ، واستقرت تفاعلات عابرة ، وبعد معالجة البيانات التصوير هو الحد الأدنى. اثنين من مساوئ هذه الطريقة هي الوقت لنضوج fluorophore وعدم الرجوع عن fluorophore المعقدة. ويمكن وفقا لبعض التطبيقات يمكن استخدام هذا اللارجعة باعتبارها ميزة. على سبيل المثال ، يمكن للمرء استخدام انزيم ومنشط an هذا الانزيم في مجمع BiFC ، مما أدى إلى تنشيط التأسيسية. يمكن للمرء ثم تحديد ما يتم تعيينهم لهذه البروتينات المعقدة. وعلاوة على ذلك ، والرجوع عن مجمع BiFC يسمح لتحديد التفاعلات الضعيفة أو عابرة. الضوابط المناسبة مهمة لتفسير تجارب BiFC. لا ينبغي أن ناقلات فارغة BiFC أن تستخدم هذه الضوابط ونتيجة الكواشف في مضان الخلفية عالية. وتشمل الضوابط الصحيحة باستخدام طفرة في واحد من البروتينات ذات الاهتمام ما هو معروف لمنع تفاعل البروتينات اثنين. وهو بروتين لا علاقة لها أنه لا ينبغي ويمكن أيضا معقدة مع البروتينات التي تهم المستخدم. من المهم أيضا أن يتم إجراء تحليل لطخة غربية لضمان التعبير عن ثوابت مختلفة تساوي وجود خلافات في إشارة الفلورسنت ليست بسبب اختلاف مستويات بروتين تعبير. ويمكن التعبير أيضا أن تؤدي إلى ارتفاع غير محددة التفاعلات ومضان ، ويجب بالتالي إبقاء مستويات التعبير منخفضة نسبيا.

BiFC هو الأسلوب العملي الذي يتم الجمع بسهولة مع تقنيات الفلورية الأخرى. على سبيل المثال ، قد تكون مجتمعة مع BiFC مناعي القياسية المشترك لدراسة توطين المجمعات trimolecular الرغم من أن هذا النهج لا يزال يخضع لحدود قرار مبائر المجهر. تضافرت مع دراسات حديثة BiFC الحنق للسماح للفحص من المجمعات trimolecular من عوامل النسخ ^16. لهذا التطبيق ، يتم استخدام البروتين CFP يوصف بانه الجهة المانحة ، ويستخدم المجمع BiFC كما متقبل (أي YFP ، والزهرة). يسمح هذا النهج لرصد الزماني للمجمع البروتين وبروتين التفاعل الثالث من الفائدة. هذه التركيبات من التقنيات تسمح لبراعة كبيرة في تطبيق تكنولوجيا BiFC لتحديد البروتين : تفاعلات البروتين. تحديد توطين مجمعات البروتين في الخلية لا بد من فك رموز العمليات الفيزيولوجية. وهكذا ، BiFC يمثل أداة ممتازة في مساعدة هذا الفهم.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Cellgro	10-013
Fetal bovine serum	Cellgro	35-011-CV
Glass Bottom Microwell dishes	Matek	P35G-1.5-14C
6-well dishes	Falcon BD	35-3846
Lipofectamine	Invitrogen	18324020
PBS	Cellgro	21-031-CV
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Confocal Microscope	Carl Zeiss, Inc.	LSM510 META