Summary
प्रोटीन की subcellular स्थानीयकरण spatio-अस्थायी संकेतन सेल के विनियमन का निर्धारण करने में महत्वपूर्ण है. यहाँ, हम कक्ष में प्रोटीन की स्थानिक बातचीत की निगरानी के लिए एक सरल तरीका के रूप में bimolecular प्रतिदीप्ति complementation (BiFC) का वर्णन.
Protocol
ए BiFC अंशांकन
- एक fluorophore चुनें YFP और शुक्र जैसे एकाधिक fluorophores, कि BiFC संलयन भागीदारों (तालिका 1) के रूप में अच्छी तरह से काम करते हैं. वीनस के एमिनो और carboxy टर्मिनल समाप्त होता है 37 ° C पर एक जटिल प्रपत्र, जबकि YFP BiFC टुकड़े 30 ° C पर एक पूर्व ऊष्मायन की आवश्यकता है क्रम में fluorophore 2 गठन की सुविधा के लिए कर रहे हैं. एक कम तापमान पर यह ऊष्मायन कुछ सेलुलर प्रक्रियाओं को बदलने और ध्यान में रखा जाना चाहिए जब टुकड़े को चुनने हो सकता है. प्रोटीन की टर्मिनस - carboxy fusing वीनस के लिए वैक्टर Addgene (से उपलब्ध हैं http://www.addgene.org/pgvec1 नियंत्रण के रूप में उपयोग करने के लिए अतिरिक्त constructs, उदाहरण के लिए, के साथ साथ, seepBiFC VN173 और pBiFC- VC155) pBiFC bJunVN173 और pBiFC bFosVC155 2. एमिनो टर्मिनल वीनस वैक्टर (pFLAG VN173 और PHA-VC155) सहित अतिरिक्त वैक्टर, निम्न साइट पर उपलब्ध हैं: http://people.pnhs.purdue.edu/ hu1 ~ / .
- ब्याज की प्रोटीन टैग BiFC टुकड़े उम्मीदवार प्रोटीन के अमीनो या carboxy टर्मिनल छोर तक जुड़े हुए हैं. कुछ प्रोटीन टैगिंग के लिए या तो प्रोटीन समारोह के विघटन के कारण अंत में अनुमति नहीं हो सकती. उदाहरण के लिए, रास GTPases की superfamily के कई सदस्यों carboxy टर्मिनस कि अंत में BiFC टुकड़े के इस प्रकार precluding लगाव पर संशोधित लिपिड हैं. इस प्रकार, यह महत्वपूर्ण है कैसे BiFC टुकड़े के अनुलग्नक हित के प्रोटीन के समारोह को प्रभावित कर सकता है कुछ विचार है. यदि यह स्पष्ट नहीं है टैगिंग कैसे एक प्रोटीन को प्रभावित करेगा अपने समारोह के कई संयोजनों परीक्षण किया जाना चाहिए. BiFC टुकड़ा के अलावा, एक पेप्टाइड linker खंडित fluorophore और उम्मीदवार प्रोटीन के बीच लचीलेपन को बढ़ाने के शामिल हो सकता है. जबकि BiFC वैक्टर में एकाधिक क्लोनिंग साइटों (एमसीएस) छोटी एमिनो एसिड फैला सांकेतिक शब्दों में बदलना है कि पर्याप्त लचीलापन, RSIAT, KQKVMNH, और RPACKIPNDLKQKVMNH linkers प्रदान कर सकता है सफलतापूर्वक किया गया है BiFC 3,9 प्रयोगों में इस्तेमाल किया
- अभिकर्मक शर्तों का निर्धारण कई म्यूटेंट परीक्षण से पहले, कुछ नियंत्रण के प्रयोगों का प्रदर्शन किया जाना चाहिए . पहले दो BiFC संयोजन है कि कोशिश की जानी चाहिए दो जंगली प्रकार का प्रोटीन है कि बातचीत के लिए जाना जाता है और एक जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती कि बातचीत नहीं कर रहे हैं. इन दो संयोजन का प्रयोग, डीएनए और अभिकर्मक समय के विभिन्न राशियों के उम्मीदवार प्रोटीन के लिए एक BiFC संकेत का पता लगाने के लिए इष्टतम स्थितियों का निर्धारण करने के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए. हम एक 6 अच्छी तरह से पकवान की एक अच्छी तरह से एकल के लिए 0.25ug, 0.5ug, प्रत्येक BiFC निर्माण के 1.0ug परीक्षण का सुझाव देते हैं. अभिकर्मक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी से मॉनिटर कोशिकाओं संकेत के विकास के लिए इष्टतम समय निर्धारित के बाद दिन. pBiFC bJunVN173 और pBiFC bFosVC155 2 constructs BiFC लिए उपयोगी सकारात्मक नियंत्रण कर रहे हैं और Addgene (ऊपर देखें) से उपलब्ध हैं. इसके अलावा, पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए constructs के बराबर अभिव्यक्ति की पुष्टि किया जाना चाहिए. स्थितियां ऐसी है कि एक फ्लोरोसेंट संकेत दो जंगली प्रकार प्रोटीन लेकिन कोई संकेत के लिए थोड़ा के बीच मनाया जाता है जंगली और प्रकार उत्परिवर्ती प्रोटीन के बीच मनाया जाता है चुना जा चाहिए. अंत में, यह सबसे अच्छा है कम के रूप में संभव के रूप में में प्रोटीन अभिव्यक्ति रखने के लिए किसी भी गैर विशिष्ट बातचीत को रोकने के.
- यदि BiFC टुकड़े के अलावा ब्याज की प्रोटीन का स्थानीयकरण बदल निर्धारित प्रत्येक BiFC का निर्माण या तो एक हा या झंडा मिलान टैग शामिल हैं.. Immunostain दोनों हा या झंडा मिलान टैग के रूप में अच्छी तरह के रूप में अच्छी तरह से (यदि संभव हो तो) अंतर्जात प्रोटीन के लिए निर्धारित है अगर BiFC टैग हित के प्रोटीन के स्थानीयकरण को प्रभावित करता है के लिए कोशिकाओं transefected.
बी और कोशिकाओं के चढ़ाना अभिकर्मक
- COS कोशिकाओं (5 1.3x10) एक गिलास नीचे Matek थाली और नमूना प्रति एक 6 अच्छी तरह से थाली के दो कुओं पर प्रत्येक चढ़ाया जाता है. कोशिकाओं रातोंरात 37 डिग्री सेल्सियस को व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दें वैकल्पिक सेल प्रकार है कि ब्याज की उम्मीदवार प्रोटीन के लिए अधिक प्रासंगिक हैं भी इस्तेमाल किया जा सकता है.
- अभिकर्मक के लिए DNAs तैयार. आम तौर पर हम COS transfections के लिए Lipofectamine (Invitrogen) का उपयोग. हालांकि, अन्य अभिकर्मकों ब्याज की सेल लाइन के लिए अधिक उपयुक्त हो सकता है. चूंकि अभिकर्मक मिश्रण एक गिलास नीचे पकवान और 6 अच्छी तरह से एक थाली के दो कुओं के बीच विभाजित किया जाएगा, इस विभाजन के लिए खाते में डीएनए की उचित राशि का उपयोग. सीरम मुक्त DMEM (एस एफ) के 250uL में डीएनए पतला. 1 / 5 एक अभिकर्मक नियंत्रण के रूप में कुल BiFC DNAs की राशि पर CFP जोड़ें. BiFC मात्रा का ठहराव के लिए, केवल कोशिकाओं जो CFP के लिए सकारात्मक रहे हैं एक BiFC संकेत के उपस्थिति के लिए विश्लेषण किया जाएगा. ध्यान दें कि CFP स्पेक्ट्रा तालिका 1 में BiFC जोड़े में से कुछ के साथ ओवरलैप जाएगा, इसलिए एक वैकल्पिक अभिकर्मक नियंत्रणशायद जरूरत है. 250uL एस एफ DMEM (डीएनए के 10uL Lipofectamine/1ug) में Lipofectamine पतला. डीएनए और Lipofectamine dilutions मिक्स. 20min के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
नोट: Lipofectamine: डीएनए अनुपात कोशिका प्रकार के आधार पर भिन्न हो सकते हैं. ब्याज की सेल लाइन के लिए उपयुक्त अभिकर्मक विधि का उपयोग करें. - गर्म एस एफ DMEM के साथ 2x कोशिकाओं कुल्ला. प्रत्येक गिलास नीचे या 6 अच्छी तरह से एक डिश की अच्छी तरह से थाली करने के लिए एस एफ DMEM के 2ml जोड़ें.
- एक गिलास नीचे पकवान और 6 अच्छी तरह से एक डिश के दो कुओं के बीच प्रत्येक अभिकर्मक मिश्रण समान रूप से विभाजित.
- 5hrs पर 37 ° C के लिए कोशिकाओं का सेते हैं.
- अभिकर्मक मीडिया निकालें और पूरा मीडिया के साथ की जगह (DMEM 10% FBS).
- 37 पर सेते रातोंरात कोशिकाओं डिग्री सेल्सियस ऊष्मायन निम्नलिखित अभिकर्मक की लंबाई हित के प्रोटीन की अभिव्यक्ति के स्तर के आधार पर अलग अलग होंगे. लम्बे समय तक ऊष्मायन गैर विशिष्ट बातचीत में परिणाम तो यह कदम empirically निर्धारित किया जा आवश्यकता होगी हो सकता है.
सी. तैयार कक्ष की इमेजिंग के लिए
- कक्ष शुरू epifluorescent करने के लिए सुनिश्चित करें कि सकारात्मक नियंत्रण फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे की जांच कर रहे हैं. यदि नहीं, तो यह संकेत डिग्री सेल्सियस जब तक मनाया जाता है 37 बजे कोशिकाओं को अतिरिक्त समय की अनुमति आवश्यक हो सकता है.
- पीबीएस (7.4 पीएच) के साथ 3x कोशिकाओं कुल्ला. गिलास नीचे डिश में कोशिकाओं के लिए 2% paraformaldehyde (7.4 पीएच) जोड़ें. बर्फ पर 10min के लिए कोशिकाओं को ठीक करें. पीबीएस (7.4 पीएच) के साथ 3x कोशिकाओं कुल्ला. 4 में स्टोर कोशिकाओं डिग्री सेल्सियस 1ml पीबीएस (7.4 पीएच) के साथ कवर किया. कक्ष इमेजिंग के लिए तय नहीं है, लेकिन एक बार BiFC टुकड़े एक अक्षुण्ण fluorophore यह इस प्रकार को रोकने के गतिशील 3 बातचीत के अपरिवर्तनीय विश्लेषण में सुधार. इसके अलावा, ध्यान में रखना है कि unfixed कोशिकाओं के लिए संकेत का विकास जारी रहेगा. 6 अच्छी तरह से पकवान में कोशिकाओं lyse और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए lysates तैयार. यह महत्वपूर्ण है कि सभी कोशिकाओं को एक ही समय में तैयार कर रहे हैं इतना है कि lysed कोशिकाओं imaged कोशिकाओं के प्रतिनिधि हैं.
डी. इमेजिंग कोशिकाओं
- प्रतिदीप्ति तीव्रता सेल प्रति गणना की जाएगी. छवि व्यक्तिगत कोशिकाओं के लिए सुनिश्चित करें.
- CFP एक tranfection नियंत्रण के रूप में शामिल किया गया था और केवल CFP सकारात्मक कोशिकाओं BiFC संकेतों के विश्लेषण के लिए चुने गए हैं. हम धारणा है कि यदि कक्ष CFP साथ ट्रांसफ़ेक्ट है, यह भी BiFC constructs के साथ ट्रांसफ़ेक्ट है बनाते हैं. इस दृष्टिकोण सुनिश्चित करता है कि imaged कोशिकाओं जो BiFC संकेत कमी नकारात्मक ब्याज की प्रोटीन और नहीं एक के अभाव के कारण या उस कक्ष में दोनों BiFC अभिव्यक्ति constructs के बीच बातचीत की कमी के कारण हैं.
- हम सेल इमेजिंग के लिए एक Zeiss LSM 510 confocal खुर्दबीन का उपयोग करें. जब इस माइक्रोस्कोप का उपयोग यह ज़ूम, pinhole, डिटेक्टर लाभ, ऑफसेट प्रवर्धक, फ्रेम आकार, स्कैन गति, स्कैन औसत, और लेजर बिजली अनुरूप रखने के लिए महत्वपूर्ण है. जब किसी भी इमेजिंग प्रणाली का उपयोग करते हुए यह महत्वपूर्ण है सेटिंग्स को लगातार इतना रखना है कि प्रतिदीप्ति नमूनों के बीच तुलनीय है. इसके अलावा, जब प्रतिदीप्ति बढ़ाता यह महत्वपूर्ण है कि पिक्सल संतृप्त नहीं कर रहे हैं.
ई. प्रतिदीप्ति बढ़ाता
- प्रतिदीप्ति किसी भी इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. हम ImageJ जो NIH (http://rsb.info.nih.gov/ij/) से आसानी से उपलब्ध है का उपयोग. ImageJ में छवि फ़ाइलों को खोलें. AnalyzeSet माप करने के लिए जाओ. क्षेत्र के लिए बक्से की जाँच करें और माप बॉक्स में ग्रे मूल्य मतलब.
- 'मुफ्त हाथ चयन उपकरण का उपयोग, CFP चैनल में पूरे सेल के किनारे के आसपास एक रूपरेखा आकर्षित.
- जगह में इस रूपरेखा को छोड़कर, YFP चैनल में बदलाव करें. AnalyzeMeasure करने के लिए जाओ.
मीन ग्रे मूल्य पिक्सेल की संख्या (यानी, सेल के क्षेत्र में प्रति औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता) द्वारा विभाजित चयन में सभी पिक्सल के ग्रे मूल्यों का योग है. - प्रत्येक छवि के लिए एक क्षेत्र है कि एक सेल शामिल नहीं करता है में YFP चैनल में एक वृत्त खींचना. पृष्ठभूमि के रूप में इस क्षेत्र के लिए एक माप ले लो. प्रत्येक छवि से पृष्ठभूमि घटाएँ.
- औसत मीन ग्रे पृष्ठभूमि शून्य से सभी एक नमूना में imaged कोशिकाओं के लिए मूल्य. यह औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता कक्षों की आबादी के लिए किया जाएगा. हम तीन प्रयोगों से अधिक के बारे में 60 कोशिकाओं मात्रा निर्धारित किया जा सुझाव जाएगा.
एफ प्रतिनिधि परिणाम:
हमारी प्रयोगशाला बहु - डोमेन मचान प्रोटीन, (ITSN) intersectin है जो कई प्रोटीन के साथ सूचना का आदान प्रदान कई जैव रासायनिक और संकेतन रास्ते को विनियमित 10,11,12,13,14 पर केंद्रित है. ITSN दो Eps15 (एह) अनुरूपता डोमेन, एक क्षेत्र coiled-coiled, और पांच एसआरसी 3 अनुरूपता डोमेन (SH3) शामिल हैं. ITSN की अब isoform भी डबल रूम (DH) अनुरूपता और कॉन्सर्ट में pleckstrin समरूपता (पीएच) कि अधिनियम guanine 15 Cdc42 के लिए nucleotide मुद्रा कारक के रूप में डोमेन शामिल हैं. इस मॉड्यूलर संरचना प्रोटीन को बढ़ावा देता है: प्रोटीन बातचीत और ITSN BiFC प्रयोगों के लिए एक आदर्श उम्मीदवार बनाता है. ITSN के subcellular स्थानीयकरण अपनी बाध्यकारी भागीदारों में परिवर्तन और इसलिए ITSN (unpublis द्वारा विनियमित रास्ते बदल सकते हैंhed डेटा). हाल ही में, हमारी प्रयोगशाला का प्रदर्शन किया है कि ITSN एक उपन्यास वर्ग द्वितीय PI3K, PI3K-11 C2β के विनियमन के माध्यम से neuronal अस्तित्व को नियंत्रित. एमिनो टर्मिनल PI3K - C2β के समर्थक अमीर डोमेन ITSN SH3 डोमेन के लिए दो बाध्यकारी साइटों में शामिल है. ITSN और PI3K C2β truncation म्यूटेंट के साथ सह - immunoprecipitation का उपयोग हम दिखा दिया कि ITSN SH3A और SH3C डोमेन एमिनो टर्मिनल PI3K C2β के क्षेत्र के साथ बातचीत. अगला, हम BiFC इस्तेमाल करने के लिए इस परिसर के subcellular स्थानीयकरण कल्पना. ITSN वीनस (pFLAG VN173) और PI3K C2β constructs के अमीनो टर्मिनस वीनस (PHA-VC155) टर्मिनस - carboxy इनकार इनकार किया गया था. एक और नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, एक गैर विशिष्ट पेप्टाइड PHA-VC155 इनकार किया गया था. VN-ITSN और कुलपति PI3K - C2β टोकना वितरण (चित्रा 2A, ऊपरी पैनल) के साथ एक BiFC जटिल गठन किया था. PI3K - C2β कि ITSN और PI3K - C2β के सह वर्षा बाधित प्रो अमीर डोमेन में उत्परिवर्तनों BiFC (चित्रा 2A, कम पैनल) सिग्नल 11 की कमी हुई. ITSN और दो PI3K C2β प्रोटीन के बीच BiFC संकेत में प्रोटीन अभिव्यक्ति में मतभेद (चित्रा 2B) की वजह से यह अंतर नहीं था.
. चित्रा 1 BiFC में, एक fluorophore (इस मामले वीनस में) एमिनो (वी.एन.) में विभाजित है - और carboxy (वीसी) टर्मिनल समाप्त होता है. इन समाप्त होता है ब्याज की दो प्रोटीनों के लिए जुड़े हुए हैं. जब दो प्रोटीन बातचीत, वी.एन. और कुलपति टुकड़े पुनः सहयोगी fluorophore और बातचीत के स्थलों पर प्रतिदीप्ति के पुनर्गठन में जिसके परिणामस्वरूप. BiFC प्रोटीन टुकड़ा complementation (पीसीए) परख प्रोटीन को मापने के लिए प्रयोग किया जाता का एक विशिष्ट उदाहरण है प्रोटीन बातचीत 5:.
चित्रा 2 ITSN और PI3K - C2β फार्म का एक BiFC जटिल. वी.एन. ए - टैग ITSN कुलपति टैग PI3K C3β WT या प्रोलाइन अमीर डोमेन के साथ सह tranfected उत्परिवर्ती (PI3K - C2β-PA). ITSN और WT फार्म PI3K - C2β एक जटिल (हरा). CFP (लाल) एक अभिकर्मक नियंत्रण बी constructs के बराबर अभिव्यक्ति का प्रदर्शन एक पश्चिमी धब्बा प्रदर्शन किया गया था के रूप में इस्तेमाल किया गया था. कुलपति - टैग constructs हा टैग कर रहे हैं.
तालिका 1 वहाँ कई वैक्टर कि BiFC के साथ संगत कर रहे हैं हैं. YN155: YFP के 1 - 155aa; YC155: YFP के 155 238aa; YN173: 1 YFP के 172aa; YC173, YFP 238aa के 173; VN155: 1 वीनस के 154aa; VC155: 155-238 वीनस; VN173: शुक्र का 1 172aa; VC173: 238aa - शुक्र के 173; CN155 CFP की 1-154aa; CC155 238aa - CFP के 155 GN173: 1 GFP के 172aa, CitN155: 1 सिट्रीन के 155aa, CitC155: 155 238aa सिट्रीन, CitN173: सिट्रीन के 1 - 172aa CitC173: सिट्रीन के 173 238aa, CerN173: 2,3,9 आसमानी 1 172aa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
पूरे कोशिकाओं में प्रोटीन बातचीत और इन परिसरों के subcellular स्थानीयकरण का निर्धारण: BiFC प्रोटीन दृश्यमान करने के लिए एक शानदार तरीका है. BiFC के लाभ कर रहे हैं कि केवल बातचीत प्रोटीन फ्लोरोसेंट हैं, क्षणिक बातचीत स्थिर रहे हैं, और इमेजिंग डेटा के पद प्रसंस्करण कम है. इस विधि के दो नुकसान fluorophore और fluorophore परिसर के irreversibility के लिए परिपक्वता के समय कर रहे हैं. कुछ अनुप्रयोगों के तहत इस irreversibility एक लाभ के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, एक BiFC परिसर में एक और उस एंजाइम की एंजाइम एक उत्प्रेरक का उपयोग, विधान सक्रियण में जिसके परिणामस्वरूप हो सकता है. क्या प्रोटीन इस परिसर के लिए भर्ती कर रहे हैं एक तो निर्धारित सकता है. इसके अलावा, BiFC परिसर के irreversibility कमजोर या क्षणिक बातचीत की पहचान के लिए अनुमति देता है. उचित नियंत्रण BiFC प्रयोगों की व्याख्या के लिए महत्वपूर्ण हैं. खाली BiFC वैक्टर नियंत्रण के रूप में उच्च पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति में इन अभिकर्मकों परिणाम के रूप में नहीं किया जाना चाहिए. उचित नियंत्रण ब्याज की प्रोटीन है कि दो प्रोटीन की बातचीत ब्लॉक करने के लिए जाना जाता है में एक परिवर्तन का उपयोग कर शामिल हैं. एक असंबंधित प्रोटीन है कि ब्याज की प्रोटीन के साथ जटिल नहीं भी चाहिए हो सकता है इस्तेमाल किया जा. यह भी महत्वपूर्ण है कि पश्चिमी धब्बा विश्लेषण करने के लिए अलग constructs की है कि अभिव्यक्ति सुनिश्चित करने के लिए किया जाता है बराबर है और फ्लोरोसेंट संकेत में है कि मतभेद प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर पर अलग कारण नहीं हैं. उच्च अभिव्यक्ति भी गैर विशिष्ट बातचीत और प्रतिदीप्ति करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, इसलिए अभिव्यक्ति के स्तर अपेक्षाकृत कम रखा जाना चाहिए.
BiFC एक व्यावहारिक तरीका है कि आसानी से अन्य फ्लोरोसेंट तकनीक के साथ संयुक्त है. उदाहरण के लिए, BiFC मानक सह स्थानीयकरण immunofluorescent trimolecular परिसरों की जांच के साथ संयुक्त किया जा सकता है हालांकि इस दृष्टिकोण अभी भी confocal खुर्दबीन का संकल्प सीमा के अधीन है. हाल के अध्ययनों से BiFC साथ प्रतिलेखन 16 कारकों के trimolecular परिसरों की जांच के लिए अनुमति देने के लिए झल्लाहट संयुक्त है. इस आवेदन के लिए, एक CFP टैग प्रोटीन दाता के रूप में प्रयोग किया जाता है और BiFC जटिल स्वीकर्ता (यानी YFP, वीनस) के रूप में प्रयोग किया जाता है. इस दृष्टिकोण एक प्रोटीन परिसर के अस्थायी निगरानी और ब्याज की एक तिहाई बातचीत प्रोटीन के लिए अनुमति देता है. प्रोटीन बातचीत: तकनीक के इन संयोजनों BiFC करने के लिए प्रोटीन का निर्धारण प्रौद्योगिकी के अनुप्रयोग में महान बहुमुखी प्रतिभा के लिए अनुमति देते हैं. कक्ष में प्रोटीन परिसरों का स्थानीयकरण परिभाषित शारीरिक प्रक्रियाओं का गूढ़ रहस्य के लिए आवश्यक है. इस प्रकार, BiFC इस समझ को सहायता में एक उत्कृष्ट उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
ITSN, PI3K - C2β, और नियंत्रण इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल वैक्टर लेखकों से अनुरोध पर उपलब्ध और गैर - वाणिज्यिक प्रयोजनों के लिए ही हैं,. लेखकों कृपया सलाह और O'Bryan प्रयोगशाला में BiFC प्रोटोकॉल स्थापित करने में इस्तेमाल किया अभिकर्मकों प्रदान करने के लिए डा. चांग देंग हू स्वीकार करते हैं कामना करता हूं. काव फाउंडेशन जेरोम Lejeune से धन द्वारा समर्थित किया गया था. O'Bryan प्रयोगशाला में कार्य एनआईएच (HL090651), (PR080428) DOD, सेंट Baldrick फाउंडेशन फाउंडेशन और जेरोम Lejeune से अनुदान द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Cellgro | 10-013 | |
| Fetal bovine serum | Cellgro | 35-011-CV | |
| Glass Bottom Microwell dishes | Matek | P35G-1.5-14C | |
| 6-well dishes | Falcon BD | 35-3846 | |
| Lipofectamine | Invitrogen | 18324020 | |
| PBS | Cellgro | 21-031-CV | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Confocal Microscope | Carl Zeiss, Inc. | LSM510 META |
References
- Kerppola, T. K. Visualization of molecular interactions by fluorescence complementation. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 449-456 (2006).
- Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions. Biotechniques. 40, 61-66 (2006).
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol Cell. 9, 789-798 (2002).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Michnick, S. W., Remy, I., Campbell-Valois, F. X., Vallee-Belisle, A., Pelletier, J. N. Detection of protein-protein interactions by protein fragment complementation strategies. Methods Enzymol. S328, 208-230 (2000).
- Michnick, S. W., MacDonald, M. L., Westwick, J. K. Chemical genetic strategies to delineate MAP kinase signaling pathways using protein-fragment complementation assays (PCA). Methods. 40, 287-293 (2006).
- Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends Biochem Sci. 32, 407-414 (2007).
- Ciruela, F. Fluorescence-based methods in the study of protein-protein interactions in living cells. Curr Opin Biotechnol. 19, 338-343 (2008).
- Hu, C. D., Kerppola, T. K. Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis. Nat Biotechnol. 21, 539-545 (2003).
- Martin, N. P. Intersectin regulates epidermal growth factor receptor endocytosis, ubiquitylation, and signaling. Mol Pharmacol. 70, 1643-1653 (2006).
- Das, M. Regulation of neuron survival through an intersectin-phosphoinositide 3'-kinase C2beta-AKT pathway. Mol Cell Biol. 27, 7906-7917 (2007).
- Mohney, R. P. Intersectin activates Ras but stimulates transcription through an independent pathway involving. JNK. J Biol Chem. 278, 47038-47045 (2003).
- Tong, X. K., Hussain, N. K., Adams, A. G., O'Bryan, J. P., McPherson, P. S. Intersectin can regulate the Ras/MAP kinase pathway independent of its role in endocytosis. J Biol Chem. 275, 29894-29899 (2000).
- Adams, A., Thorn, J. M., Yamabhai, M., Kay, B. K., O'Bryan, J. P. Intersectin an adaptor protein involved in clathrin-mediated endocytosis, activates mitogenic signaling pathways. J Biol Chem. 275, 27414-27420 (2000).
- O'Bryan, J. P., Mohney, R. P., Oldham, C. E. Mitogenesis and endocytosis: What's at the INTERSECTIoN? Oncogene. 20, 6300-6308 (2001).
- Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. Visualization of AP-1 NF-kappaB ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 151-156 (2008).
