Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

رسم الخرائط وتطبيق التعبير Flippase محسن شرك في اليرقات والكبار ذبابة الفاكهة CNS

Published: June 3, 2011 doi: 10.3791/2649
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2, 1, 1, 1, 1
1Department of Zoology, University of Oklahoma - Norman, 2Department of Biology, Brandeis University

Summary

نحن تصف Flippase بفعل القمع المتعدد الجوانب Gal80/Gal4 (FINGR) الأسلوب ، مما يسمح للأنسجة محددة FLP لتحديد أنماط التعبير Gal80. أينما Gal4 والتداخل FLP ، يتم تشغيل Gal4 التعبير على (Gal80 انقلبت الخروج) أو إيقاف (Gal80 المعكوسة في) الأسلوب FINGR هي متعددة للتحليل نسيلي ورسم خرائط الدوائر العصبية.

Abstract

الأسلوب الثنائي Gal4 / UAS قوية للتلاعب الجيني والدوائر العصبية في ذبابة الفاكهة. لمعظم الدراسات العصبية الحيوية ، ومع ذلك ، نادرا ما يكون التعبير Gal4 الأنسجة محددة بما فيه الكفاية للسماح للارتباط دقيق الحلبة مع قراءات السلوكية. للتغلب على هذه العقبة الرئيسية ، ونحن وضعت مؤخرا طريقة لتحقيق FINGR أكثر تقييدا ​​Gal4 التعبير في الأنسجة من الاهتمام. الأسلوب FINGR من ثلاثة عناصر : 1) نظام Gal4/UAS التقليدية ؛ 2) مجموعة من الأدوات Gal80 FLP / FRT بوساطة تحويل ؛ و 3) محسن شرك FLP (ET - FLP). يستخدم Gal4 لتحديد الدوائر العصبية الأساسية من الاهتمام. التقشير وGal4 مع UAS - المستجيب ، مثل UAS - TS UAS MJD78Q أو شي ، وينظم نشاط الخلايا العصبية ، التي هي بدورها تتجلى في إحداث تغييرات في السلوك الطيران. يمكن أن تكون إضافية مع UAS - المراسل مثل UAS - GFP ، الدائرة العصبية التي ينطوي عليها سلوك معين في وقت واحد محدد للتحليل الصرفي. لGal4 خطوط عريضة مع التعبير ، ويمكن أن يقتصر Gal4 التعبير باستخدام متكاملتين Gal80 - تحويل الأدوات : حوض P> Gal80> ('الوجه خارج') وحوض P> وقف> Gal80 ('في الوجه"). أخيرا ، يمكن للمحققين بدوره Gal80 أو خارجها ، على التوالي ، مع مساعدة من الأنسجة الخاصة ET - FLP. في الوجه في الوضع ، سوف Gal80 Gal4 قمع التعبير أينما وGal4 ET - FLP تتقاطع. في وضع الوجه إلى الخارج ، وسوف Gal80 Gal4 تخفيف القمع في الخلايا التي Gal4 FLP والتداخل. كلا النهجين تمكين تقييد عدد الخلايا في الدوائر Gal4 محددة ، ولكن في نمط العكسية. الأسلوب FINGR متوافق مع مجموعة واسعة من Gal4 خطوط الطيران في المجتمع وتنوعا للغاية لتحليل نسيلي التقليدية وخرائط الدوائر العصبية. في هذا البروتوكول ، ونحن لشرح رسم خرائط لأنماط التعبير في FLP ET FLPx2 تحديد خطوط وفعالية من الأسلوب FINGR في خلايا مستقبلة للضوء. وينبغي أن مبدأ الأسلوب FINGR أن تنطبق أيضا على غيرها من الكائنات نموذج الجينية التي تستخدم Gal4/UAS ، Gal80 وFLP / FRT.

Protocol

1. سلالات ذبابة الفاكهة

  1. Gal4 السائق :
    GMR - Gal4 ، والذي يعبر Gal4 في خلايا مستقبلة للضوء.
  2. خطوط UAS
    UAS - MJD78Q (أو UAS - polyQ) ، والذي يسبب ضمور خلايا العصبية في التعبير عن Gal4.
    UAS - GFP ، والذي يعبر في GFP خلايا Gal4 الإعراب.
  3. خطوط FLP
    EY - FLP ، والذي يعبر في FLP مبصرات ومجموعات فرعية من مناطق الدماغ.
    ET - FLPx2 الخطوط ، والتي هي شرك محسن خطوط تحتوي على نسختين من FLP (FLP - IRES - FLP). لقد ولدت لنا ~ 1000 ET - FLP خطوط (بوم وآخرون ، 2010) ، الذي أنماط التعبير لا يزال يتسم. هنا ، نحن تصف توصيف لنمط من التعبير حدد ET - FLPx2 في نظام أخلاقي اليرقات والذبابة العصبي المركزي (CNS).
  4. مراسل FLP
    YW ، أكتين P> CD2> Gal4 ؛ UAS - GFP (Pignoni وZipursky ، 1997) ، الذي يتبع نمط التعبير عن ET - FLPx2 خلال أكتين P> Gal4 ؛ UAS - GFP على FLP بوساطة من الختان تهجيني CD2>.
  5. يكمل أحدهما الآخر ، Gal80 تحويل الأدوات
    الحوض P> Gal80> (غوردون وسكوت ، 2009) ، وبناء على الوجه ، والذي يعبر constitutively Gal80 في جميع الأنسجة يقودها المروج تويولين قوية. عند FLP بوساطة إعادة التركيب ، وانقلبت> Gal80 الخروج ويتم إنهاء Gal80 التعبير فقط في FLPx2 - ET - معربا عن الأنسجة.
    الحوض P> وقف> Gal80 (بوم وآخرون ، 2010) ، والآخر في بناء ، والذي لا يعبر عن Gal80 في ظل ظروف طبيعية. يتم تشغيل Gal80 التعبير على مروج من قبل إلا في تويولين ET - FLPx2 ، معربا عن الأنسجة التي تقلب إلى FLP> إيقاف وتقلب في Gal80.
  6. الذباب لاختبار النشاط FLP في مجمع العين
    GMR - Gal4 ، UAS - polyQ ؛ الحوض P> وقف> Gal80 (بوم وآخرون ، 2010) ، والتي قد تتحول والعينين ناقصة الصباغ. في FLP ، معربا عن خلايا مستقبلة للضوء ، يتم تشغيل polyQ التعبير قبالة الوجه التالي Gal80 في.
    GMR - Gal4 ، UAS - polyQ ؛ (بوم وآخرون ، 2010) حوض P> Gal80> ، الذي له عينان العادي. في FLP ، معربا عن خلايا مستقبلة للضوء ، يتم تشغيل polyQ التعبير على الوجه التالي Gal80 التدريجي.

2. الكواشف

الفوسفات مخزنة المالحة (PBS ، 1X) ، ودرجة الحموضة 7.4.
4 ٪ بارافورمالدهيد (PFA) ، مخففة في برنامج تلفزيوني من 16 ٪ PFA ، EM الصف (القط # 15710 ، والعلوم الميكروسكوب الالكتروني ، هاتفيلد ، والسلطة الفلسطينية)
PBT ، 1XPBS تحتوي على 0.1 ٪ تريتون - X 100 (سيجما)
لمكافحة Elav (MAB ، 9F8A9 ، الدراسات التنموية ورم هجين الضفة وجامعة أيوا) البقع جميع الخلايا العصبية في ذبابة الفاكهة ،
مكافحة الريبو (ماب 8D12 ؛ التنموي ورم هجين دراسات البنك الدولي ، جامعة ولاية ايوا) بقع الخلايا الدبقية في ذبابة الفاكهة.
الكسا 594 الدجاج ضد الضد الماوس الثانوي (Invitrogen)

3. تعيين نمط التعبير عن خطوط FLPx2 محسن شرك (* خطوات حاسمة)

  1. جمع الإناث العذارى من YW ، أكتين P> CD2> Gal4 ؛ خط UAS - GFP للذكور وعبر خطوط ET - FLPx2 الفردية. في السابق بمثابة مراسل GFP للتعبير أنسجة ET - FLP.
  2. * تشريح يتجول 3 الثالثة اليرقات F1 طور مرحلي ، الإبقاء على الجهاز العصبي المركزي (أي المخ والاعصاب والنخاع بطني ، VNC) وجدار الجسم ، والإصلاح لمدة 1 ساعة في PFA 4 ٪ على الجليد ، وغسل 3X مع الثلج الباردة PBS تليها 3X يغسل مع PBT.
    تشريح
    1. إزالة 3 تجول اليرقات الثالثة F1 طور مرحلي ووضعها في صحن Sylgard نظيفة (35 ملم × 10 ملم طبق بتري مليئة 2 غرام من Sylgard -- المختلطة وفقا لتعليمات صناعة).
      1. إزالة بقايا الطعام مع الفرشاة
    2. ملء الطبق مع الثلج الباردة 1XPBS ومكان على الجليد لتخدير اليرقات
    3. عقد السنانير فم اليرقة مع زوج من الملقط والاستيلاء على بشرة قرب منتفس الأمامي يمتد مع زوج آخر من الملقط وقشر بشرة في نهاية الخلفي. وسيلحق الجهاز العصبي المركزي إلى الفم السنانير جنبا إلى جنب مع الغدد اللعابية ، والأمعاء ، وأقراص تخيلي.
    4. إزالة الأنسجة الزائدة وأقراص تخيلي المحيطة الجهاز العصبي المركزي.
    5. نقل الجهاز العصبي المركزي في برنامج تلفزيوني مليئة 3 طبق بيركس جيدا.
      1. ويمكن استخدام غيض siliconized ماصة P200 لتجنب تجفيف الأنسجة.
    6. الإصلاح لمدة 1 ساعة في 200 ميكرولتر من PFA 4 ٪ على الجليد.
      1. ضمان مغمورة تماما في الجهاز العصبي المركزي PFA.
        1. إذا كان الجهاز العصبي المركزي يتحرك ، وهذا يشير عادة ليست هذه هي الجهاز العصبي المركزي تنظيفها بشكل صحيح من الأنسجة المحيطة بها.
    7. غسل 3X مع الثلج الباردة PBS تليها يغسل 3X مع PBT.
  3. * تشريح الجهاز العصبي المركزي من الذباب F1 الكبار.
    1. تخدير الذباب مع CO 2 أو مكان الذباب الموجود داخل قارورة فارغة على الجليد لمدة 10 دقيقة.
    2. مكان الكبار الذباب في صحن زجاج 95 ٪ EtOH مملوءة على الجليد لمدة 30 ثانية.
    3. نقل الذباب الكبار في صحن الزجاج مملوءة 1XPBS على الجليد.
      1. غسل 3X مع 1X PBS الجليد الباردة لإزالة بقايا EtOH
    4. مكان ذبابة في Sylga 35mmالطبق الثالث مليئة 1X PBS الجليد الباردة
    5. مكان الجانب البطني مواجهة القلم وإدراج حشرة صغيرة (دبابيس minutiens 0.1 ملم) في منتصف البطن.
      1. باستخدام زوج من الاستمرار على قاعدة ملقط في الساقين وإزالة الساقين مع زوج آخر من الملقط.
    6. إزالة إهاب الرأس
      1. بينما الاستيلاء على خرطوم مع زوج واحد من ملقط ، ومكان آخر تحت العين وقشر بشرة نحو خط منتصف الظهرية من الرأس تطير.
      2. الاستيلاء على العين الأخرى وإزالة إهاب المتبقية على الجانب الآخر.
      3. باستخدام الملقط حادة و / أو شحذ إبرة التنغستن وإزالة الأنسجة المحيطة بالمخ القصبة الهوائية
        1. سوف تنظيف غير لائق من القصبة الهوائية نتيجة قوية في صناعة السيارات في مضان ، وعرقلة GFP التعبير ، والسماح بتعويم الدماغ خلال تحديد
    7. VNC تشريح
      1. إزالة إهاب الصدري
        1. ابتداء من نهاية الخلفي من القفص الصدري ، ملقط مكان اثنين على كل جانب من 3 preepisternum الثالثة (أي الاستيلاء على قاعدة رجليه الخلفيتين).
        2. إهاب منفصلة بلطف بعيدا عن خط المنتصف بطني ، كرر هذا حتى تصل إلى قاعدة العنق.
        3. تنتشر بلطف شطري إهاب الصدري تعريض فنك
      2. إزالة المقبل في البطن من القفص الصدري. بينما باستخدام زوج من ملقط لعقد الصدر في قاعدة المحطة الثانية ، واستخدام زوج آخر من ملقط للاستيلاء على البطن بالقرب من sternite 1 البطن وسحب البطن قبالة.
      3. لإزالة VNC من الأنسجة المحيطة الصدري. عقد في منطقة العضد مع زوج من الملقط ومع زوج آخر من المسيل للدموع لطيف بعيدا ملقط غالبية الذبيحة الصدري.
      4. عند هذه النقطة يجب أن يكون هناك حلقة من النسيج الضام المحيطة الضام عنق الرحم (الرقبة). باستخدام اثنين ملقط المسيل للدموع الحلبة إربا.
      5. إزالة أي نوع من الأنسجة الزائدة الصدري المحيطة فنك
    8. نقل الدماغ وفنك إلى 9 رفاه طبق بيركس 1X PBS تحتوي على الجليد
      1. ويمكن استخدام غيض siliconized ماصة P200 لتجنب تجفيف الأنسجة
  4. * إصلاح الجهاز العصبي المركزي للبالغين لمدة 1 ساعة في PFA 4 ٪ على الجليد وغسل 3X مع الثلج الباردة برنامج تلفزيوني و3X مع PBT.
  5. احتضان إعداد الجهاز العصبي المركزي أو الجهاز العصبي المركزي للبالغين واليرقات جدار الجسم عند 4 درجات مئوية خلال الليل مع الأجسام المضادة لخلايا عصبية إما (المضادة للElav ، 1:10) أو الدبقية (anti-Repo. 1:10). غسل إعداد 5X مع PBT.
  6. احتضان مع إعداد أخلاقي أو اليرقات مع الدجاج 594 اليكسا ضد الضد الماوس الثانوي (1:100) في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة ، ويغسل مع إعداد برنامج تلفزيوني.
  7. تحميل CNS اليرقات أو لا أخلاقي على شريحة. للحفاظ على الشكل الطبيعي للجهاز العصبي المركزي ، واستخدام حلقة بلاستيكية على شكل O (بدون تشفير تسمية التسليح ، شركة آفري دينيسون ، مكتب المنتجات ، بريا ، كاليفورنيا) على الشريحة كجسر مصغرة لوقف انزلاق الغطاء.
  8. التحضير لدراسة أنماط التعبير وGFP Elav (أو الريبو) تحت المجهر الفلورسنت.

4. تطبيق أداتين Gal80 - تحويل تكميلية في القمع في Gal4 مبصرات

  1. التقليب Gal80 خارج الحوض عبر P> ​​Gal80> (الشكل 5A).
    1. جمع الذكور من GMR - Gal4 ، UAS - polyQ ؛ الحوض P> Gal80> الخط. علما بأن مجمع عيون طبيعية في هذه الذباب.
    2. تتزاوج مع EY - FLP العذارى.
    3. جمع الذباب F1 ودراسة النمط الظاهري العين.
  2. التقليب في Gal80 عبر الحوض P> وقف> Gal80 (الشكل 5B).
    1. جمع GMR - Gal4 ، UAS - polyQ ؛ الحوض P> وقف> Gal80 الذباب الذكور ودراسة النمط الظاهري العين. لاحظ المنحطة والعينين ناقصة الصباغ في هذه الذباب مقابل سلالات النوع البري (كانتون - S)
    2. تتزاوج مع EY - FLP العذارى ؛
    3. جمع الذباب F1 ودراسة النمط الظاهري العين.
  3. حدد ET - FLPx2 خطوط مع التعبير في خلايا مستقبلة للضوء

ويمكن تكرار الخطوات 4.1 و 4.2 باستخدام ET - FLPx2 الخطوط التي تعبر عن FLP في مجموعة فرعية من خلايا مستقبلة للضوء. بدلا من ذلك ، إما GMR - Gal4 ، UAS - polyQ ؛ الحوض P> وقف> Gal80 الذباب أو GMR - Gal4 ، UAS - polyQ ؛ الحوض P> يمكن عبورها Gal80> الذباب لخطوط ET - FLPx2 الفردية للكشف عن خطوط التي تعبر عن FLP في خلايا مستقبلة للضوء. قيمة ET - FLPx2 خطوط فقط هي تلك التي أعرب FLP في مجموعة فرعية واحدة أو خلايا مستقبلة للضوء (الشكل 6).

5. ممثل النتائج

ويمكن التعبير عن نمط خط ET - FLPx2 محددة درست بسهولة وموثقة في يرقات الذباب F1 أو الكبار مشتقة من عبور بين YW ، أكتين P> CD2> Gal4 ؛ UAS GFP - ET - العذارى وFLPx2 الذكور (الشكل 1) . عادة ، 3-5 يعيد للحيوانات F1 يتم تشريح ودراسة لتحديد استنساخ للنمط التعبير FLP (بوم وآخرون ، 2010). (الشكل 3 و 4).

أظهرت النتائج في الشكل 7 توضيح فعالية Gal80 الوجه في الوجه والتدريجي في نظم القمع المتعدد الجوانب من Gal4 تأشب FLP بوساطة التالية. الحوض P> وقف> Gal80 بناء لا يبدو أن أي تعبير المتسرب من Gal80 (استنادا إلى انحطاط موحدة وتصبغ مبصرات) ، ومع ذلك هو 100 ٪ فعالة في التقليب في Gal80 بمساعدة eyFLP لقمع GMR - Gal4 واستعادة العين لمباراة عادية (الشكل 7A). على العكس من ذلك ، ف الحوض> Gal80> يقمع تماما GMR - Gal4 قبل إدخال eyFLP. الوجه التالي Gal80 التدريجي ، GMR - Gal4 محركات UAS - polyQ التعبير ، مما يؤدي إلى أن تنحل والعينين ناقصة الصباغ (الشكل 7B). في هذا المثال ، استخدمنا FLP عموم photorecetor لرسم خريطة "دارات" للمبصرة لكنها لم تدرس العواقب السلوكية. باستخدام أساليب مماثلة مع خطوط ذات الصلة Gal4 سلوكيا ، ونحن جزء معين من الدائرة - Gal4 CCAP تنظيم الجناح التوسع في الذباب الكبار (بوم وآخرون ، 2010). نحن نعتقد أن الأسلوب FINGR ستكون قيمة في مساعدة فهمنا للأساس العصبية للسلوك.

الشكل 1
الشكل 1. ويمكن النظر في نمط التعبير عن خط FLPx2 ET نمط التعبير FLP (الاهليليجات الأزرق) من خط ET - FLPx2 يحددها عبور ET - FLPx2 الذكور (أعلى اليسار) مع CD2 أكتين> P> Gal4 ؛ UAS - GFP البكر (أعلى اليمين). وأعاق كل مكان أكتين P> Gal4 التعبير في الأنثى الأبوية ادراج (المثلثات الرمادية) FRT تسلسل يحيط CD2. في ذرية F1 ، والمكوس FLP تسلسل CD2 ، والسماح أكتين P> Gal4 إلى محرك UAS - GFP التعبير.

الشكل 2
الشكل 2. نمط التعبير عن خط ET - FLPx2 في نظام أخلاقي واليرقات العصبي المركزي. هذه الصور تصوير الجهاز العصبي المركزي (الدماغ والحبل البطني العصب ، VNC) تشريح من نسل YW المنتجة من التزاوج ، أكتين P> CD2> Gal4 ؛ UAS - GFP الآباء إلى خط ET - 173A FLPx2. من خلال إعادة مزج خارج> كاسيت> CD2 ، FLP ينشط أكتين P> GAL4 التعبير (التعبير يترتب على ذلك من UAS - GFP). وبالتالي ، فإن نمط GFP تقارير FLP ، معربا عن الخلايا. لوحة ويظهر التعبير FLP اليرقات نمط حين وحة B يظهر نمط التعبير الكبار في خط 173A.

الشكل 3
الشكل 3. توصيف أنواع الخلايا التي تعبر flippase في FLPx2 ET - 688A الخط رقم ألف ، صورة مركبة من ثابت F1 3 يرقة طور مرحلي الثالثة ملطخة REPO المضاد من تقاطع بين خط ET FLPx2 # 688A والإبلاغ Flippase خط GFP. دينار بحريني ، والتكبير عالية (زايس بخطة لامزيغ 63x النفط) الرأي الذي أخذ من نهاية الخلفي لفنك من اليرقات 3 طور مرحلي الثالثة.

الشكل 4
الشكل 4. توصيف أنواع الخلايا داخل الجسم فطر الخط ET FLPx2 - # 150. AC ، صورة عالية التكبير (63x الغمر النفط) من الجسم من فطر اليرقة F1 الثابتة طور مرحلي 3 ملطخة REPO للسامية.

الشكل 5
الشكل 5. من التوضيح Gal80 استراتيجيات انعكاس في وانعكاس المغادرة. أ في استراتيجية الوجه التدريجي ، تويولين المروج يحركها Gal80 (توب P> Gal80>) constitutively نشطة ، مما أدى إلى قمع GMR - Gal4 والنمط الظاهري العين البرية من نوع (العين الحمراء). تتم إزالة هذا القمع من خلال إدخال FLP (الأرجواني) ، والتي سوف الوجه Gal80 خارج (وسط ، الحمراء) والسماح GMR - Gal4 إلى محرك UAS - polyQ التعبير. هذه النتائج في ضمور خلايا مستقبلة للضوء (يتضح من النقاط البيضاء في العين). باء. في متبادلة للاستراتيجية السابقة ، وتوقف تويولين المروج يحركها Gal80 التعبير FRT (رمادي المثلث) يحيط "وقف" كودون. في غياب Gal80 ، GMR - Gal4 بربط UAS - polyQ تسبب تنكس الخلايا العصبية في خلايا مستقبلة للضوء (يتضح من النقاط البيضاء في العين). عن طريق عبور GMR - Gal4 ، UAS - polyQ ؛ الحوض P> وقف> GAL80 الذكور مع الإناث البكر التي تعبر FLP في خلايا مستقبلة للضوء ، FLP (الأرجواني) وحفز إعادة التركيب في المواقع FRT ، باستئصال "التوقف" كودون (وسط ، أحمر) ، وبالتالي السماح لGal80 التعبير وقمع GMR - Gal4. هذا وتحتفظ تنكس عصبي في خلايا مستقبلة للضوء (يتضح من عدم وجود ثهايت النقاط في العين).

الشكل 6
الشكل 6. تطبيق الأسلوب FINGR في التقليب Gal80 خارج باستخدام ET - 688A FLPx2 الخط # ذرية F1 من كرة عرضية بين الخط FLPx2 ET - 688A # عذراء الى GMR - Gal4 ، UAS - polyQ ؛ tubP> GAL80 الذكور. نقص الصباغ في منتصف ommatidia العين يمثل التعبير FLP في خط # 688A. في هذا المجال أعفي Gal80 قمع GMR - Gal4 Gal4 السماح لحملة UAS - polyQ.

الشكل 7
الشكل 7. تطبيق الأسلوب FINGR في التقليب Gal80 أو التصغير لتتقاطع في Gal4 مبصرات. ألف الحوض P> وقف> Gal80 متخاذلا في النظام يقيد GAL4 التعبير بطريقة تعتمد على FLP. في GMR - Gal4 ، UAS - polyQ ؛ الحوض P> وقف> GAL80 الذباب ، وتتحول خلايا مستقبلة للضوء وناقصة الصباغ (يطير إلى اليسار). بعد إدخال eyFLP ، وأعرب عن Gal80 في خلايا مستقبلة للضوء ، مما أسفر عن القمع الكامل GMR - Gal4 ، والتي بدورها بإيقاف polyQ التعبير وتنتج بعيون الذباب العادي (ذبابة اليمين). باء الحوض P> Gal80> الوجه ان نظام يعمل في الموضة العكس كما الحوض P> وقف> Gal80 متخاذلا في النظام. الحوض P> Gal80> constitutively يقمع GAL4 ويقمع التعبير عن polyQ (يسار يطير ، مع عيون العادي). بعد إدخال eyFLP ، هو انعكاس Gal80 انطلاقا من خلايا مستقبلة للضوء ، والتخفيف من قمع GMR - Gal4 وتحول على polyQ التعبير. هذا يؤدي إلى الذباب مع تتدهور ناقصة الصباغ والعينين (ذبابة اليمين).

Discussion

وقد تم على نطاق واسع في النظام Gal4/UAS ويستخدم بنجاح من قبل Drosophilists للدراسات البيولوجية المختلفة (العلامة التجارية وPerrimon ، 1993 ؛ دافي ، 2002). حتى الآن ، وقد ولدت المجتمع يطير آلاف يحركها المروج ومحسن شرك خطوط Gal4. ومن نقاط القوة الرئيسية للأسلوب FINGR هو أنه متوافق مع نظام Gal4/UAS ، مما يجعل من الممكن توسيع نطاق كبير في قوة Gal4 في الدراسات ذبابة الفاكهة.

المهم تطبيق واحد من الأسلوب هو FINGR الدوائر العصبية الكامنة تهذيب السلوك من خلال Gal4/Gal80 التقاطع. قد تتضمن هذه السلوكيات ، ولكن لا تقتصر على والتعلم والذاكرة ، والتودد ، والنوم ، وإيقاع الساعة البيولوجية. ويمكن أيضا الأسلوب FINGR أن تستخدم لرسم خريطة للخلايا العصبية الحرجة التي تكون عرضة لأمراض التنكس العصبي في نمذجة الإنسان الاعصاب مثل الزهايمر والتصلب الوحشي الضموري (ALS) ، وأمراض الشلل الرعاش. وبالمثل ، قد يتم تعيينها من بؤر الخلايا العصبية أو الدوائر العصبية حاسمة للكوكايين وساطة ، والكحول ، وغيرها من إدمان المخدرات باستخدام أسلوب FINGR. وتجدر الإشارة إلى أن Gal4s الشرطي (Osterwalder وآخرون ، 2001 ؛ الرومانية وآخرون ، 2001..) ويمكن استخدامها مع طريقة FINGR من أجل السيطرة الزمنية الدوائر العصبية والسلوكيات. ويمكن تعديل أدوات - Gal80 تحويل باستخدام Gal80 حساسة للحرارة (Gal80 TS ، ماغواير وآخرون ، 2003) إنتاج الحوض P> وقف> Gal80 نهاية الخبر أو ف الحوض> Gal80 TS> ، مضيفا المزيد من المرونة الزمانية التلاعب في الدائرة. أبعد من الجهاز العصبي ، وطريقة FINGR ينطبق بالتساوي على تقييد Gal4 التعبير في مجموعات فرعية من الخلايا ما إذا كان هو الجناح أو الساق.

وسوف خطوط ET - FLPx2 يكون مصدرا قيما لجميع الأحياء ذبابة الفاكهة مهتمة FRT / FLP التحليل القائم على نسيلي (شو وروبن ، 1993) ، بما في ذلك MARCM (لي ولوه ، 1999). ومن المتوقع أيضا أن بعض خطوط ET - FLPx2 قد يحل محل heatshock - FLP للاستنساخ وتكرار لتكرار التحليلات المورفولوجية والسلوكية. مثل خطوط Gal4 محسن شرك ، فإن معظم ET - FLPx2 خطوط من غير المحتمل أن يتم التعبير عن وتحديدا في الخلايا من مصلحة احد. وأعرب معظم خطوط FLP في خلايا الفائدة وغيرها من الخلايا في الأنسجة أو كذلك. ومع ذلك ، فإن عدم وجود "خصوصية نسيج" على حد سواء وGal4 ET FLPx2 لا يشكل مصدر قلق كبير للأسلوب FINGR طالما منطقتهم متداخلة أمر مرغوب فيه لإجراء تجربة معينة. وقد صمم لتحويل FINGR البلدين واسع "في نظم واحد المكرر.

الأساليب هو موضح في هذه البروتوكولات هي المعيار وليس كما ينبغي استنساخه. الخطوات الرئيسية التي تتطلب الاهتمام تحذيرية واحد يتم اختيار واستخدام ومثبت. وينبغي تجنب مثبتات أخرى من منهاج العمل لأنها سوف يشفي GFP الإشارة. لاحظنا أيضا أنه لا ينبغي أن تستخدم طبق تشريح للتثبيت مع PFA لتجنب احتمال أن لا يكون التعبير FLP تفيد تقارير موثوق بها عن طريق GFP.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

نشكر صندوق داخلي من جامعة أوكلاهوما (لBZ) ، ومنح من المؤسسة القومية للعلوم (IOS - 1025556 ، لBZ و RAB) لدعم TRF ، الرب ، XP ، AAO ، MLW ، المستخلصات ، وهذه البحوث. منحة المعاهد الوطنية للصحة (RO1 NS060878 ، لBZ) دعما جزئيا RAB. RAB يعترف بوجود NRSA المعاهد الوطنية للصحة (T32 NS07292) منحة تدريبية لمنح جامعة برانديز ، ومنحة المعاهد الوطنية للصحة (RO1 GM21473) منحت لقاعة جيفري في برانديز ، لدعم المراحل الأولى من هذه الدراسة. نشكر جيفري قاعة تشجيعات لسموه المتواصل لهذا المشروع. نشكر الدكتور كريستين سكوت لتزويدنا الحوض ف سلالة>> Gal80.

References

  1. Bohm, R. A., Welch, W. P., Goodnight, L. K., Cox, L. W., Henry, L. G., Gunter, T. C., Bao, H., Zhang, B. A genetic mosaic approach for neural circuit mapping in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 16378-16383 (2010).
  2. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  3. Bruno, B., Holbro, N., Reichert, H. Polycomb group genes are required for neural stem cell survival in postembryonic neurogenesis of Drosophila. Development. 134, 1091-1099 (2007).
  4. Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. , 34-341 (2002).
  5. Gordon, M. D., Scott, K. Motor control in a Drosophila taste circuit. Neuron. 61, 373-384 (2009).
  6. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
  7. McGuire, S. E., Le, P. T., Osborn, A. J., Matsumoto, K., Davis, R. L. Spatiotemporal rescue of memory dysfunction in Drosophila. Science. 302, 1765-1768 (2003).
  8. Osterwalder, T., Yoon, K. S., White, B. H., Keshishian, H. A conditional tissue specific transgene expression system using inducible GAL4. Proc Natl Acad Sci USA. 98, 12596-12601 (2001).
  9. Pignoni, F., Zipursky, S. L. Induction of Drosophila eye development by decapentaplegic. Development. 124, 271-278 (1997).
  10. Roman, G., Endo, K., Zong, L., Davis, R. L. P[Switch], a system for spatial and temporal control of gene expression in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 12602-12607 (2001).
  11. Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117, 1223-1237 (1993).

Tags

علم الأعصاب ، العدد 52 ، UAS ، Gal4 ، Gal80 ، Flippase ، FRT ، وتحليل نسيلي ، سلوك ، وذبابة الفاكهة
رسم الخرائط وتطبيق التعبير Flippase محسن شرك في اليرقات والكبار<em> ذبابة الفاكهة</em> CNS
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Fore, T. R., Ojwang, A. A., Warner,… More

Fore, T. R., Ojwang, A. A., Warner, M. L., Peng, X., Bohm, R. A., Welch, W. P., Goodnight, L. K., Bao, H., Zhang, B. Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS. J. Vis. Exp. (52), e2649, doi:10.3791/2649 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter