Kartläggning och tillämpning av Enhancer-fällan Flippase uttryck i larvformer och vuxna Drosophila CNS

Summary

Vi beskriver en Flippase-inducerad intersektionella Gal80/Gal4 förtryck (FINGR)-metoden, vilket gör att vävnadsspecifika FLP att avgöra Gal80 uttryck mönster. Varhelst Gal4 och FLP överlappar varandra, är Gal4 uttryck påslagen (Gal80 flippade ut) eller av (Gal80 vänt in). Den FINGR Metoden är mångsidig för klonal analys och neurala kretsar kartläggning.

Abstract

Den Gal4 / UAS binära metoden är kraftfull för gen och neurala kretsar manipulation i Drosophila. För de flesta neurobiologiska studier är dock Gal4 uttryck sällan vävnadsspecifika tillräckligt för att möjliggöra exakt korrelation av kretsen med beteendeproblem avläsning. För att lösa detta stora hindret, utvecklade vi nyligen FINGR metod för att uppnå en mer restriktiv Gal4 uttryck i vävnaden av intresse. Den FINGR Metoden har tre komponenter: 1) det traditionella Gal4/UAS systemet, 2) en uppsättning av FLP / FRT-medierad Gal80 konvertering verktyg, och 3) förstärkare-fällan FLP (ET-FLP). Gal4 används för att definiera den primära neurala kretsen av intresse. Paring de Gal4 med en UAS-effektor, såsom UAS-MJD78Q eller UAS-Shi ^TS, reglerar neuronala aktivitet, som i sin tur visar sig i förändringar i gylfen beteende. Med en extra UAS-reporter som UAS-GFP, den neurala kretsen som deltar i specifikt beteende kan samtidigt kartläggas för morfologisk analys. För Gal4 linjer med bred uttryck kan Gal4 uttryck begränsas med hjälp av två kompletterande Gal80-konvertering verktyg: badkar ^P> Gal80> ("flip out") och badkar ^P> stopp> Gal80 ("flip i"). Slutligen kan utredarna vända Gal80 på respektive av, med hjälp av vävnad-specifika ET-FLP. I flip-i läge kommer Gal80 undertrycka Gal4 uttryck varhelst Gal4 och ET-FLP korsar varandra. I flip-ut-läge, kommer Gal80 lindra Gal4 förtrycket i celler där Gal4 och FLP överlappar varandra. Båda strategierna gör det möjligt för begränsningen av antalet celler i Gal4 definierade kretsar, men i ett omvänt mönster. Den FINGR Metoden är kompatibel med den stora samlingen av Gal4 linjer i gylfen samhället och mångsidig för traditionella klonal analys och neurala kretsar kartläggning. I detta protokoll visar vi kartläggningen av FLP uttryck mönster i att välja ET-FLPx2 linjer och effektiviteten i FINGR metoden i ljusmätare celler. Principen för FINGR Metoden bör också tillämpas på andra genetiska modellorganismer som Gal4/UAS, Gal80 och FLP / FRT används.

Protocol

1. Drosophila stammar

1. Gal4 drivrutin:
   GMR-Gal4, som uttrycker Gal4 i ljusmätare celler.
2. UAS linjer
   UAS-MJD78Q (eller UAS-polyQ), som orsakar neurala degeneration i Gal4-uttryckande celler.
   UAS-GFP, som uttrycker GFP i Gal4-uttryckande celler.
3. FLP linjer
   EY-FLP, som uttrycker FLP i fotoreceptorer och i delmängder av hjärnan.
   ET-FLPx2 linjer som förstärkare-fällan rader som innehåller två kopior av FLP (FLP-IRES-FLP). Vi har genererat ~ 1000 ET-FLP linjer (Bohm et al., 2010), vars uttryck mönster är ännu inte beskrivas. Här beskriver vi karakterisering av uttrycket mönster av att välja ET-FLPx2 i larv och vuxen flyga centrala nervsystemet (CNS).
4. FLP reporter
   YW, aktin ^P> CD2> Gal4, UAS-GFP (Pignoni & Zipursky, 1997), som rapporterar uttryck mönster av ET-FLPx2 genom aktin ^P> Gal4, UAS-GFP på FLP-medierad Rekombination excision av> CD2.
5. Två kompletterande Gal80-konvertering verktyg
   Tub ^P> Gal80> (Gordon & Scott, 2009), flip-out konstruera, som konstitutivt uttryck Gal80 i alla vävnader drivs av en stark tubulin promotor. Vid FLP-medierad rekombination, är> Gal80 vänds ut och Gal80 uttryck är upp endast i ET-FLPx2 som uttrycker vävnader.
   Tub ^P> stopp> Gal80 (Bohm et al., 2010), luckan-in konstruktion, som inte uttrycker Gal80 under normala förhållanden. Gal80 uttryck sätts på av tubulin initiativtagaren endast i ET-FLPx2-uttrycker vävnader där FLP flippar ut> stoppar och vänder i Gal80.
6. Flugor för att testa FLP aktivitet i föreningen ögat
   GMR-Gal4, UAS-polyQ, badkar ^P> stopp> Gal80 (Bohm et al, 2010.), Som har degenererat och depigmented ögon. I FLP-uttryckande photoreceptor celler är polyQ uttryck avstängd efter Gal80 flip-in.
   GMR-Gal4, UAS-polyQ, (. Bohm et al, 2010) badkar ^P> Gal80>, som har normala ögon. I FLP-uttryckande photoreceptor celler är polyQ uttryck påslagen efter Gal80 flip-out.

2. Reagenser

Fosfatbuffrad saltlösning (PBS, 1X), pH 7,4.
4% paraformaldehyd (PFA), som spätts i PBS från 16% PFA, EM betyg (Cat # 15.710, Electronic Mikroskopi vetenskaper, Hatfield, PA)
PBT, 1XPBS innehållande 0,1% Triton-X 100 (Sigma)
Anti-Elav (MAB, 9F8A9; utvecklingsstudier Hybridoma Bank, University of Iowa), fläckar alla nervceller i Drosophila.
Anti-Repo (mAb 8D12, utvecklingsstudier Hybridoma Bank, University of Iowa) fläckar gliaceller i Drosophila.
Alexa 594 kycklingen mot mus sekundär antikropp (Invitrogen)

3. Kartläggning uttrycket mönster av förstärkare-fällan FLPx2 linjer (* viktiga steg)

1. Samla jungfrur kvinnor från YW, aktin ^P> CD2> Gal4, UAS-GFP linje och kors för att män av enskilda ET-FLPx2 linjer. Den förstnämnda fungerar som ett GFP reporter för vävnad uttryck för ET-FLP.
2. * Dissekera vandrande 3: _e INSTAR F1 larver, behålla CNS (dvs hjärnan och ventral nerven sladden, VNC) och kroppen väggen, fix för 1 timme i 4% PFA på is, tvätta 3X med iskall PBS följt av 3X tvättar med PBT.
   Dissection
   1. Ta bort vandrande 3: ^e INSTAR F1 larver och placera dem i en ren Sylgard maträtt (35 mm x 10 mm petriskål fylld med 2 gram Sylgard - blandad enligt tillverka instruktioner).
      1. Ta bort matrester med pensel
   2. Fyll skålen med iskalla 1XPBS och lägg på is för att bedöva larverna
   3. Håll munnen krokar med en larv med en pincett och ta tag i nagelband nära förlänga främre spiracle med en annan pincett och skala nagelband mot den bakre änden. CNS kommer att knytas till munnen krokar tillsammans med spottkörtlar, tarm och imaginal skivor.
   4. Ta bort överflödig vävnad och imaginal skivor kring CNS.
   5. Överför CNS i en PBS-fyllt 3 och Pyrex maträtt.
      1. En silikoniserad P200 pipettspetsen kan användas för att undvika uttorkning vävnaden.
   6. Fix för 1 timme i 200 l 4% PFA på is.
      1. Se till att CNS är helt nedsänkt i PFA.
         1. Om CNS flottar, tyder detta typiskt att CNS inte är ordentligt rengjord från den omgivande vävnaden.
   7. Tvätta 3X med iskall PBS följt av 3X tvättar med PBT.
3. * Dissekera CNS hos vuxna F1 flugor.
   1. Bedöva flyger med CO ₂ eller placera flugor som finns inuti en tom flaska på is i 10 minuter.
   2. Placera vuxna flugor i en 95% EtOH fyllda glasskål på is i 30 sek.
   3. Överför vuxna flugor i en 1XPBS fylld glasskål på is.
      1. Tvätta 3X med iskall 1X PBS för att avlägsna rester EtOH
   4. Placera en fluga till en 35mm Sylgard fat fyllt med iskallt 1X PBS
   5. Placera den ventrala sidan uppåt och för in en liten insekt penna (minutiens stift 0,1 mm) halvvägs in i buken.
      1. Med hjälp av en pincett håller basen på benen och ta bort benen med en annan pincett.
   6. Ta bort huvudet nagelbanden
      1. Medan tag i snabel med en pincett, placera en annan under ögat och skala nagelband mot ryggens mittlinje av flugan huvudet.
      2. Ta det andra ögat och ta bort de kvarvarande nagelbanden på andra sidan.
      3. Med vassa pincett och / eller slipas volfram kanylen avlägsnas trakeal vävnad som omger hjärnan
         1. Felaktig rengöring av luftstrupe kommer att resultera i starka auto-fluorescens, hindrar GFP uttryck, och låta hjärnan att flyta under fastställande
   7. VNC Dissection
      1. Ta bort bröstkorg nagelbanden
         1. Börjar på den bakre änden av bröstkorgen, placera två pincett på varje sida av den 3: ^e preepisternum (dvs ta tag i botten på bakbenen).
         2. Försiktigt separera nagelbanden bort från den ventrala mittlinjen linjen, upprepa detta tills du når botten av halsen.
         3. Försiktigt spred de två halvorna av bröstkorg nagelband utsätta VNC
      2. Nästa bort buken från bröstkorgen. När du använder en pincett för att hålla bröstkorgen vid det andra benet basen, använd en annan pincett att ta tag i buken nära 1: a buken sternite och dra i magen av.
      3. För att ta bort VNC från den omgivande bröst vävnad. Håll humeral området med en pincett och med en annan pincett mjuka Riv bort majoriteten av bröstkorg kadaver.
      4. På denna punkt bör det finnas en ring av bindväv som omger livmoderhalsen bindväv (nacken). Med hjälp av två pincett riva ringen isär.
      5. Ta bort överflödigt bröstkorg vävnad som omger VNC
   8. Överför hjärnan och VNC till 9-väl Pyrex maträtt som innehåller 1X PBS på is
      1. En silikoniserad P200 pipettspetsen kan användas för att undvika uttorkning vävnaden
4. * Fäst vuxna CNS under 1 timme i 4% PFA på is och tvätta 3X med iskall PBS och 3X med PBT.
5. Inkubera vuxna CNS beredning eller larver CNS och kroppen vägg i 4 ° C över natten med antikroppar mot antingen nervceller (anti-Elav, 1:10) eller Glia (anti-Repo. 1:10). Tvätta beredningen 5X med PBT.
6. Inkubera med vuxna eller larver beredning med Alexa 594 kycklingen mot mus sekundär antikropp (1:100) i rumstemperatur i 2 timmar och tvätta beredningen med PBS.
7. Montera larver eller vuxna CNS på en bild. Att bevara den naturliga formen i CNS, använd en O-formad plastring (Clear Reinforcement Label, Avery Dennison, Office Products, Brea, CA) i bilden som en mini-bridge att skjuta locket halka.
8. Undersök förberedelse för GFP och Elav (eller Repa) uttryck mönster i ett fluorescerande mikroskop.

4. Tillämpningen av två kompletterande Gal80-konvertering verktyg i förtryck Gal4 i fotoreceptorer

1. Vända Gal80 ut via badkar ^P> Gal80> (Figur 5A).
   1. Samla hanar från GMR-Gal4, UAS-polyQ, badkar ^P> Gal80> linje. Observera att sammansatta ögon är normala i dessa flugor.
   2. Parar sig med EY-FLP oskulder.
   3. Samla F1 flugor och undersöka ögat fenotyp.
2. Vända Gal80 in via badkar ^P> stopp> Gal80 (Figur 5B).
   1. Samla GMR-Gal4, UAS-polyQ, badkar ^P> stopp> Gal80 manliga flugor och undersöka ögat fenotyp. Notera degenererade och depigmented ögon i dessa flugor jämfört med vild typ stammar (Kanton-S)
   2. Parar sig med EY-FLP oskulder;
   3. Samla F1 flugor och undersöka ögat fenotyp.
3. Välj ET-FLPx2 linjer med uttryck i ljusmätare celler

Steg 4,1 och 4,2 kan upprepas med ET-FLPx2 linjer som uttrycker FLP i en delmängd av ljusmätare celler. Alternativt, antingen GMR-Gal4, UAS-polyQ, badkar ^P> stopp> Gal80 flugor eller GMR-Gal4, UAS-polyQ, badkar ^P> Gal80> flugor kan korsas till enskilda ET-FLPx2 linjerna till skärmen för linjer som uttrycker FLP i fotoreceptor celler. Värdefulla ET-FLPx2 linjer är de som bara uttrycka FLP i en delmängd eller enstaka celler fotoreceptor (Figur 6).

5. Representativa resultat

Uttrycket mönster av ett specifikt ET-FLPx2 line lätt kan undersökas och dokumenteras i F1 larver eller vuxna flugor härrör från korsning mellan YW, aktin ^P> CD2> Gal4, UAS-GFP oskulder och ET-FLPx2 hanar (Figur 1) . Vanligtvis replikerar tre till fem F1 djur dissekeras och undersökas för att fastställa reproducerbarhet FLP uttrycket mönster (Bohm et al., 2010). (Figur 3 & 4).

Resultaten visas i figur 7 illustrerar effekten av Gal80 flip-in och flip-out system i intersektionella förtrycket av Gal4 efter FLP-medierad rekombination. Badkaret ^P> stopp> Gal80 konstruera tycks inte ha någon läckande uttryck för Gal80 (baserat på enhetliga degeneration och färgpigmenten i fotoreceptorer), och ändå är det 100% effektivt vända Gal80 in med hjälp av eyFLP att undertrycka GMR- Gal4 och återställa ögat till det normala framträdanden (Fig. 7A). Tvärtom, badkar ^P> Gal80> fullt förtrycker GMR-Gal4 före införandet av eyFLP. Efter Gal80 flip-out,, GMR-Gal4 driver UAS-polyQ uttryck som leder till degenerera och depigmented ögon (Fig. 7B). I detta exempel använde vi en pan-photorecetor FLP att kartlägga ljusmätare "kretsar" men inte undersöka beteendemässiga konsekvenser. Att använda liknande metoder med beteendemässigt relevant Gal4 linjer, kartlade vi en del av CCAP-Gal4 krets reglerar vinge expansion i vuxna flugor (Bohm et al., 2010). Vi tror att FINGR metoden kommer att vara värdefullt i att bistå vår förståelse av neuronala grund av beteende.

Figur 1. . Undersöka uttryck mönster av en ET-FLPx2 line FLP uttrycket mönster (blå ovaler) från en ET-FLPx2 line kan bestämmas genom att korsa en ET-FLPx2 hane (överst till vänster) med en aktin ^P> CD2> Gal4, UAS- GFP virgin (överst till höger). Ubiquitous Actin ^P> Gal4 uttryck i föräldraförsäkringen kvinnor hindras av införandet av FRT flankerade (grå trianglar) CD2 sekvens. I F1-avkomman, FLP kommer punktskatter på CD2 sekvensen, som möjliggör Actin ^P> Gal4 att köra UAS-GFP uttryck.

Figur 2. Expression mönster av en ET-FLPx2 rad i larver och vuxna centrala nervsystemet. Dessa bilder skildrar det centrala nervsystemet (hjärnan och ventrala nerv sladd, VNC) dissekerat från avkomman produceras från parning YW, aktin ^P> CD2> Gal4, UAS-GFP föräldrar till ET-FLPx2 173A linje. Genom rekombination ut> CD2> kassett, aktiverar FLP aktin ^P> GAL4 uttryck (den därav uttrycket av UAS-GFP). Därför rapporterar GFP mönstret FLP-uttryckande celler. Panel A visar larver mönstret FLP uttryck medan panelen B visar den vuxna uttrycket mönster i linje 173A.

Figur 3. Karakterisering av celltyper som uttrycker flippase i ET-FLPx2 Line # 688A. A, en sammansatt bild av en fast F1-3: ^e INSTAR larv färgats med anti-REPO från en korsning mellan ET-FLPx2 raden # 688A och en GFP Flippase rapportering linje. BD, En hög förstoring (Zeiss Plan-Apochromat 63x olja) uppfattning tagen från den bakre änden av en VNC från en 3: ^e INSTAR larver.

Figur 4. Karakterisering av celltyper i svampen kroppen av ET-FLPx2 Line # 150. AC, En hög förstoring bild (63x oljeimmersion) av svamp kroppen från en fast F1 3:e INSTAR larv färgade med anti-repa.

Figur 5. Illustration av Gal80 Flip-och Utfällbart strategier. A. I utfällbart strategi tubulin promotor driven Gal80 (Tub ^P> Gal80>) är konstitutivt aktiv, vilket resulterar i förtryck av GMR-Gal4 och en vildtyp öga fenotyp (röda ögon). Detta förtryck tas bort genom införandet av FLP (lila), som kommer vända Gal80 ut (mitten, röd) och låt GMR-Gal4 att köra UAS-polyQ uttryck. Detta resulterar i fotoreceptor celldegeneration (illustrerad av vita prickar i ögat). B. I den ömsesidiga av den tidigare strategin är tubulin promotor drivs Gal80 uttryck avbryts av FRT (grå triangel) flankeras "stopp" kodon. I avsaknad av Gal80, binder GMR-Gal4 till UAS-polyQ orsakar neuronal degeneration i fotoreceptorer (illustrerad av vita prickar i ögat). Genom att korsa GMR-Gal4, UAS-polyQ, badkar ^P> stopp> GAL80 män med Virgin kvinnor som uttrycker FLP i photoreceptor cellerna, FLP (lila) kommer att katalysera rekombination vid FRT platser excising det "stopp" kodon (mitten, röd), vilket möjliggör Gal80 uttryck och undertryckande av GMR-Gal4. Detta förbehåller sig neurodegeneration i ljusmätare celler (illustreras av bristen på wHite prickar i ögat).

Figur 6. Tillämpningen av FINGR metod vända Gal80 med hjälp av ET-FLPx2 Line # 688A F1-avkomma från en korsning mellan ET-FLPx2 raden # 688A jungfru att GMR-Gal4, UAS-polyQ;. TubP> GAL80 hane. Bristen på pigment i mitten av ögat ommatidia representerar FLP uttryck i linje # 688A. Inom detta område Gal80 undertryckande av GMR-Gal4 var lättad att låta Gal4 att köra UAS-polyQ.

Figur 7. Tillämpningen av FINGR metod vända Gal80 in eller ut för att skära Gal4 i fotoreceptorer. A. badkar ^P> stopp> Gal80 flip-in-system begränsar GAL4 uttryck i en FLP-beroende sätt. I GMR-Gal4, UAS-polyQ, badkar ^P> stopp> GAL80 flugor, är ljusmätare celler degenerera och depigmented (vänster flyga). Efter införandet av eyFLP är Gal80 uttrycks i photoreceptor celler, vilket resulterar i full förtrycket av GMR-Gal4, vilket i sin tur stänger av uttryck polyQ och producerar flugor med normala ögon (rätt fluga). B. badkar ^P> Gal80> flip -out-system fungerar i motsatt sätt som i badkaret ^P> stopp> Gal80 flip-in-system. Tub ^P> Gal80> konstitutivt förtrycker GAL4 och undertrycker uttryck för polyQ (vänster flyga, med normala ögon). Efter införandet av eyFLP är Gal80 vänt ut från photoreceptor celler, lindra undertryckandet av GMR-Gal4 och vända på uttrycket polyQ. Detta leder till flugor med degenerera och depigmented ögon (rätt fluga).

Discussion

Det Gal4/UAS Systemet har i stor utsträckning och framgångsrikt används av Drosophilists för olika biologiska studier (Brand & Perrimon, 1993, Duffy, 2002). Hittills har flugan gemenskap genererat tusentals promotor-driven och förstärkare-fällan Gal4 linjer. En stor styrka i FINGR metoden är att den är kompatibel med Gal4/UAS, vilket gör det möjligt att avsevärt utöka makt Gal4 i Drosophila studier.

En viktig tillämpning av FINGR metoden är att finjustera nervbanor underliggande beteende genom Gal4/Gal80 korsning. Dessa beteenden kan inkludera, men är inte begränsade till, inlärning och minne, frieri, sömn och dygnsrytm. Den FINGR Metoden kan också användas för att kartlägga de kritiska nervceller som är benägna att neurodegeneration i modellering mänskliga neurodegenerativa sjukdomar som Alzheimers, amyotrofisk lateralskleros (ALS) och Parkinsons sjukdomar. På liknande sätt kan härdar av nervceller eller nervbanor avgörande för att förmedla kokain, alkohol och andra drogberoende kartläggas med hjälp av FINGR metoden. Det bör noteras att villkorlig Gal4s (Osterwalder et al, 2001;.. Roman et al, 2001) kan användas med FINGR metod för att få tidsmässig styrning av nervbanor och beteenden. Ändring av Gal80-konvertering verktyg med hjälp av ett temperaturkänsligt Gal80 (Gal80 ^ts, McGuire et al., 2003) kan producera badkar ^P> stopp> Gal80 ^TS eller badkar ^P> Gal80 ^ts>, vilket ytterligare temporal flexibilitet i kretsen manipulation. Bortom nervsystemet är FINGR metoden tillämpas på samma sätt att begränsa Gal4 uttryck i delmängder av celler om det är vingen eller benet.

ET-FLPx2 linjer kommer att bli en värdefull resurs för alla Drosophila biologer intresserade i FRT / FLP-baserade klonal analys (Xu & Rubin, 1993), inklusive MARCM (Lee & Luo, 1999). Det förväntas också att en del ET-FLPx2 rader kan ersätta heatshock-FLP för att producera reproducerbara kloner och vid upprepade morfologiska och beteendemässiga analyser. Som förstärkare-fällan Gal4 linjer, de flesta ET-FLPx2 linjer är osannolikt att uttrycks specifikt i cellerna i ett intresse. De flesta linjer kommer att uttrycka FLP i cellerna i intresse och i andra celler eller vävnader också. Däremot kommer avsaknaden av "vävnadsspecificitet" av både Gal4 och ET-FLPx2 inte vara ett stort bekymmer för FINGR metoden så länge som deras överlappande området är önskvärd för ett visst experiment. FINGR är konstruerad för att slå två "brett" system till en raffinerad ett.

De metoder som illustreras i dessa protokoll är ganska standard och bör vara reproducerbara. De stora varnande steg som kräver en uppmärksamhet är val och användning av fixativ. Fixeringsmedel än PFA bör undvikas eftersom de kommer att släcka GFP signal. Vi har också noterat att dissekera skålen inte bör användas för fixering med PFA för att undvika möjligheten att FLP uttrycket inte tillförlitligt skall rapporteras av GFP.