Summary
هذا المقال يصف التقنية القياسية الغربي النشاف الإجراء باستخدام الكهربائي NuPAGE المتاحة تجاريا مصغرة جل النظام من Invitrogen.
Abstract
التنشيف الغربي (أو immunoblotting) هو إجراء المختبر القياسية السماح للمحققين للتحقق من التعبير عن بروتين ، وتحديد القيمة النسبية للحاضر البروتين في عينات مختلفة ، وتحليل نتائج التجارب المشتركة مناعي. في هذا الأسلوب ، يتم الكشف عن بروتين الهدف مع الأضداد ابتدائية معينة في عينة معينة من جناسة الأنسجة أو استخراج. ويتحقق وفقا لفصل البروتين الوزن الجزيئي باستخدام تغيير طبيعة SDS - PAGE. بعد نقلها إلى غشاء ، هو بحث البروتين الهدف مع الأضداد ابتدائية معينة والكشف عنها بواسطة لمعان كيميائي.
منذ الوصف الأول ، وقد مرت هذه التقنية الغربي النشاف العديد من التحسينات ، بما في ذلك المواد الهلامية مسبقة الصنع ومعدات صديقة للمستخدم. في مختبرنا ، اخترنا لاستخدام الكهربائي NuPAGE المتاحة تجاريا من نظام Invitrogen. وهو الرقم الهيدروجيني المبتكرة محايدة ، متقطع SDS - PAGE ، مسبقة الصنع مصغرة هلام النظام. هذا النظام يقدم العديد من المزايا التقنية Laemmli التقليدية بما في ذلك : أ) حياة أطول الجرف من المواد الهلامية مسبقة الصنع تتراوح بين 8 أشهر إلى سنة 1 ؛ الثاني) فصل مجموعة واسعة من الأوزان الجزيئية 1-400 كيلو دالتون تبعا لنوع من الجل المستخدمة ؛ والثالث) وزيادة التنوع (مجموعة من نسبة مادة الأكريلاميد ، ونوع من الهلام ، وتركيبة الأيونية للالعازلة على التوالي).
الإجراء الموضح في هذه المقالة الفيديو يستخدم نظام مكرر تريس العازلة المتقطعة مع 4-12 ٪ مكرر تريس التدرج المواد الهلامية وزارة التربية والعلم تشغيل العازلة ، وكمثال على كيفية تنفيذ وصمة عار للغرب باستخدام الكهربائي NuPAGE Invitrogen النظام. في المختبر لدينا ، لقد حصلنا على نتائج جيدة وقابلة للتكرار للتطبيقات الحيوية المختلفة باستخدام هذا الأسلوب الغربي النشاف.
Protocol
هلام الكهربائي
الملاحظة الفنية : قبل بدء هذا الإجراء ، وعينات من البروتين الخاص بك جاهزة.
خلال هذه الخطوة الأولى ، يتم فصل البروتينات في العينة وفقا لوزنها الجزيئي باستخدام تغيير طبيعة الكهربائي للهلام بولي أكريلاميد (PAGE). نموذج NuPAGE LDS ® الاحتياطي محملة دوديسيل سلفات ليثيوم (LDS) يحتفظ البروتينية في حالة التشويه والتحريف بمجرد تسخين عينة البروتين على 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. يستخدم عامل قوي في تخفيف بالتزامن لإزالة هيكل الثانوي والجامعي (DTT ، لكسر السندات ثاني كبريتيد). بالإضافة إلى ذلك ، أصبحت مغطاة البروتينات في عينة LDS سالبة الشحنة وبالتالي التحرك من خلال شبكة من هلام الأكريلاميد نحو القطب موجبة الشحنة. يسمح هذا الفصل وفقا للوزن الجزيئي (كيلو دالتون تقاس ، كيلو دالتون).
ويمكن العثور مفصلة خطوة بخطوة لإعداد البروتوكولات العينة وإجراء PAGE على موقع Invitrogen 2 ، أو في دليل تقني NuPAGE 3
نصائح تقنية
- في NuPAGE Invitrogen مكرر تريس نظام discontinous العازلة ، والتنقل الكهربي للبروتينات ونطاق الفصل اللاحق للجيل يعتمد على عاملين اثنين : أ) تركيز acrylamid من هلام (مع تركيز أكبر الأكريلاميد يؤدي إلى تحسين دقة أقل الوزن الجزيئي البروتينات) والثاني) وايون زائدة من المنطقة العازلة على التوالي ، أو اجتماعات الأطراف زارة التربية والعلم. لاختيار التشكيلة المناسبة لنطاق الفصل الذي ترغب في تحقيقه ، تشير إلى التخطيط للهجرة جل 1. فإن سمك هلام وعدد الآبار تعتمد على حجم وكمية من العينات التي كنت تخطط لتحميل ، على التوالي.
- عند تحميل العينات في آبار الخاص للهلام ، ويتم حجز ما لا يقل عن مسار واحد للعلامة الوزن الجزيئي (أو سلم). هذه المعايير بروتين متاحة تجاريا من عدة شركات وعادة ما تتألف من مزيج من البروتينات ذات الأوزان الجزيئية ملطخة محددة ، وذلك لتشكيل فرق مرئية تسمح لك لمتابعة تقدم عملية الترحيل. اختيار مجموعة من الأوزان الجزيئية والتي تتوافق مع قرار الجل الخاص.
- لتحقيق نمط الهجرة لطيفة وحتى ونحن نوصي جميع الآبار التحميل من الجل الخاص مع حجم مماثل من عينة أو نموذج LDS 1X العازلة.
نقل
ملاحظة فنية : قبل الشروع في خطوة نقل ، نقل اعداد العازلة (1X مع الميثانول 10 ٪) وقبل بارد إلى 4 درجات مئوية في غرفة باردة.
من أجل جعل الوصول إلى الكشف عن البروتينات الأجسام المضادة ، يتم نقلهم بواسطة electroblotting من الجل على غشاء النيتروسليلوز. ويستند ملزمة البروتين على التفاعلات مسعور ، فضلا عن التفاعلات بين تهمة الغشاء والبروتين.
(ويمكن أيضا البولي فينيل فلوريد (PVDF) غشاء تستعمل كبديل. وفي هذه الحالة ، غشاء PVDF يجب أن يكون قبل الرطب في الميثانول 30 ثانية على الأقل قبل الاستخدام.)
ويمكن الاطلاع على مفصلة خطوة بخطوة الإجراء بروتوكول نقل في اشارة 4 إذا كنت تستخدم بيو راد البسيطة العابرة لطخة خلية نقل الكهربي ، أو في الإشارات 2-3 إذا تم تجهيز المختبر الخاص مع XCell الثاني في Invitrogen ل™ لطخة وحدة نمطية.
نتيجة لهذه العملية ، ويتعرض البروتينات على سطح طبقة رقيقة وعلى استعداد للكشف. يمكن التحقق من فعالية والتوحيد الشامل للنقل البروتين من الهلام إلى الغشاء بواسطة لتلطيخ الشقائقية عكسها غشاء صباغة.
الشقائقية S تلطيخ الداخلي (اختياري) :
- بعد نقل البروتينات ، مكان الغشاء في علبة الحضانة (البروتينات التي تواجه متابعة).
- إضافة ما يكفي من تلطيخ الشقائقية S لتغطية الغشاء واحتضان ما لا يقل عن 30 ثانية مع الإثارة لطيف.
- شطف الغشاء بالماء المقطر حتى خلفية واضحة.
- يزيل اللون الغشاء مع تشغيل الماء المقطر لمدة 2-3 دقائق.
- مكان الغشاء في محلول الحجب (أنظر أدناه).
التقنية النصائح :
- نوصي العلامات الغشاء الخاص مع قلم رصاص قبل نقل البروتين في النظام للدلالة على الجانب التي تعرض لها كل من البروتينات والتوجه من العينات الخاصة بك.
- ويمكن استخدام كلا الشقائقية S تلطيخ وعلامات لخفض الوزن الجزيئي الغشاء بعد لبحث نقل أجزاء مختلفة مع الأجسام المضادة الناتجة
مناعي :
ملاحظة فنية : يتم توفير هذا الإجراء مناعي كدليل فقط. قد تكون مطلوبة لتحسين كل نملةويمكن الاطلاع على معلومات محددة في معظم اوراق البيانات من الأجسام المضادة المتاحة تجاريا (مثل العمل التخفيف ، وفترة حضانة ، الخ) ؛ ibody.
خلال هذه العملية الأخيرة ، وسوف يتم الكشف عن بروتين هدف معين باستخدام الأجسام المضادة ، وسوف تبدو وكأنها شريط على الفيلم. موقف الفرقة تعتمد على الوزن الجزيئي للبروتين المستهدف ، في حين أن كثافة الموجات يعتمد على مقدار من البروتين الحاضر الهدف.
عادة ، يتم تحقيق ذلك بعد ثلاثة substeps :
- حظر : لتجنب التفاعلات غير محددة من الجسم المضاد مع غشاء (وغطت مساحة تزيد على الغشاء بمحلول مخفف من بروتين عامة).
- التحقيق : تم الكشف عن بروتين معين الفائدة الأساسي الأضداد . بعد غسل جسم غير منضم الأولية بعيدا ، يتعرض الغشاء إلى الضد مختلفة مرتبطة مراسل الانزيم ، البيروكسيداز الفجل (HRP). ويوجه هذا الجسم المضاد الثانوي ضد جزء أنواع معينة من الأجسام المضادة الأولية (مثل جسم مضاد المضادة للأرنب الثانوية وربط أي جسم الأرانب مصدرها الأساسي).
- الكشف : يتم استخدام عامل chemiluminescent باعتبارها الركيزة التي من شأنها أن luminesce عندما تتعرض للHRP على الضد الثانوية. هذا التفاعل ينتج التلألؤ في مكان وبما يتناسب مع كمية البروتين المصرية. ثم يتم الكشف على ضوء بواسطة الأفلام الفوتوغرافية.
ويرد عامة خطوة بخطوة الإجراء أدناه. ويمكن الاطلاع على الإجراءات التفصيلية الأخرى في ECL بلس الغربية دليل الكشف عن التنشيف تعليمات الكواشف 5 أو أكثر في ورقة البيانات المصاحبة للأضداد متاحة تجاريا. فترة حضانة ، التخفيف الأضداد ، ومنع والحلول يغسل يجب أن تكون تجريبيا الأمثل لكل الأجسام المضادة.
مناعي الداخلي :
- كتلة الربط غير محددة من قبل تفرخ مع حجم ما يكفي من حل PBS الكازين 1 ٪ حجب لتغطية كامل الغشاء. مكان على الكرسي الهزاز على الأقل 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- احتضان الغشاء مع الأجسام المضادة الأساسي الخاص بك (المحددة لهذا البروتين من الفائدة). وينبغي أن تضعف الجسم المضاد الرئيسي في عرقلة الحل. بالنسبة لمعظم الأجسام المضادة ، ويتحقق الربط الكامل الحضانة بعد 1-2 ساعات في درجة حرارة الغرفة في إطار التحريض لطيف. بدلا من ذلك ، يمكن تنفيذ الخطوة الحضانة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية لزيادة اشارة الى نسبة الضوضاء.
- إزالة الحل (تجاهل أو الاحتفاظ في 4 درجات مئوية إلى -20 درجة مئوية للاستخدام المتكرر) وتغسل بسرعة الغشاء مرة واحدة. ثم 3X10 دقائق مع برنامج تلفزيوني ، 0.05 ٪ توين 20 (PBST) في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز قوي.
- احتضان الغشاء مع الضد HRP - يقترن الثانوية المخفف في عرقلة الحل. اختيار الأضداد التي تعترف مفتش جزء من الأنواع حيث تم رفع الأجسام المضادة الأولية. يتم تنفيذ الحضانة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في إطار التحريض لطيف.
- تجاهل حل بسرعة ، ويغسل الغشاء مرة واحدة. ثم 3X10 دقيقة مع PBST في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز قوي.
- شروع في الكشف عن chemiluminescent وفقا لتعليمات الصانع. نستخدم ECL بلس الغربية الكواشف التنشيف من الرعاية الصحية GE (أنظر المرجع 5 لتعليمات محددة).
- مكان الغشاء الخاص في التفاف ساران أو الحقيبة ومكان تصوير الإشعاع الذاتي داخل الكاسيت. تأكد من استنزاف أي السائل الزائد وإزالة جميع فقاعات الهواء.
- يعرض الفيلم الفوتوغرافي لغشاء في غرفة مظلمة. تبدأ الساعة 1 دقيقة ، والتعرض للضبط وفقا لشدة الإشارة المطلوبة.
التقنية النصائح :
- ويتحقق حجب غير محددة وملزمة بوضع الغشاء في محلول مخفف من البروتين. نستخدم عادة الكازين 1 ٪ ، ولكن الأبقار مصل الزلال (BSA ~ 2 ٪) أو منزوع الدسم الحليب الجاف (~ 5 ٪) يمكن استخدامها كبديل.
- ويمكن استخدام تريس مخزنة المالحة (TBS) في جميع أنحاء الداخلي بدلا من برنامج تلفزيوني. ونحن نوصي باستخدام TBS إذا كنت تخطط لتحقيق الغشاء الخاص مع الضد phosphospecific.
- استعمال يتوهج في الظلام ملصق (على سبيل المثال ، في Stratagene Glogos ® II علامات Autorad) استغلالها في الجزء السفلي من شريط تصوير الإشعاع الذاتي سوف تساعدك على محاذاة فيلمك الخاص والأغشية خلال الخطوة التحليل.
تحليل
الآن بعد أن كنت قد عرضت الفيلم الخاص بك ، فسوف ندرك أنه من الناحية العملية ، وليس كل الغرب تكشف عن البروتين والفرقة واحد لطيفة. Additionaقد تظهر أيضا ل العصابات بسبب الربط غير محدد من الأجسام المضادة في المرحلتين الابتدائية والثانوية. ويمكن تخفيض هذه إشارة الخلفية عن طريق تحسين إجراءات مناعي. بالإضافة إلى ذلك ، سوف عنصر التحكم المناسب (على سبيل المثال ، خلايا untransfected ، سيرنا الخلايا المعالجة ، الخ) تكون مفيدة لتحديد خصوصية الضد الخاص والموقع الدقيق للبروتين الهدف على الغشاء.
بعد وضع العلامات على الفيلم موقف العصابات الملطخة البروتين القياسية من الغشاء ، مؤامرة سجل كل من الوزن الجزيئي معايير البروتين (المحور الصادي) ضد الحركة النسبية المقابلة (محور س). الحركة النسبية (RF) هو مصطلح يستخدم لنسبة البروتين المسافة انتقلت من نقطة المنشأ (أعلى من هلام) نسبة إلى المسافة التي تتبع صبغ أو علامة منخفضة الوزن الجزيئي انتقلت (الجبهة هلام) . تحديد خط انحدار المنحنى القياسي في الحصول على قيم الميل والتقاطع ذ. ويقدر وزن جزيئي معروف (حجم) من البروتين تستهدفها وذلك باستخدام الترددات اللاسلكية وتعديل المعادلة التالية :
سجل الوزن الجزيئي = (المنحدر) (التنقل أو بعلي من البروتين المستهدفة) + التقاطع y
(أنظر المرجع 6 للحصول على تعليمات مفصلة).
تؤخذ تقريبية مستوى التعبير عن طريق مقارنة شدة الموجات من البروتين لهذا الهدف من البروتين الهيكلي (على سبيل المثال ، أو تويولين أكتين) أو الجين المنتج التدبير المنزلي مثل GAPDH. هذا يجب أن يسمى "السيطرة تحميل" لن تتغير بين العينات وكشف باستخدام الأجسام المضادة المحددة الأولية. قد تكون صورة لمزيد من التحليل من قبل لتقييم كثافة النسبية لكمية البروتين وتلطيخ قياس النتائج من حيث الكثافة البصرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الإجراء المعروض هنا يستخدم الجل مكرر تريس مع MES تشغيل العازلة كمثال على تغيير طبيعة الصفحة باستخدام الكهربائي Invitrogen Novex NuPAGE النظام. بالإضافة إلى ذلك ، هذا النظام هلام مسبقة الصنع يسمح فصل البروتين تحت تغيير طبيعة أو عدم تغيير طبيعة الظروف ، وكذلك يستوعب مجموعة واسعة من الأوزان الجزيئية (1-200 كيلو دالتون عن المواد الهلامية مكرر تريس إلى 36-400 كيلو دالتون للتريس - خلات المواد الهلامية). اعتمادا على التجربة الخاصة بك ، يمكنك اختيار لمتابعة جزء فقط من هذا الاسلوب الغربي النشاف وصفها هنا واستخدامها مباشرة إجراءات تلطيخ هلام (مثل الفضة أو تلطيخ Coomassie) أو وسيلة بديلة مناعي (على سبيل المثال ، أو اللونية فلوري).
نحن نستخدم بشكل روتيني الكهربائي Invitrogen Novex NuPAGE النظام في مختبرنا لمختلف التطبيقات ، يمكن العثور على بعض الأمثلة منها في المراجع 7-9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة ومؤسسة هيويت E. جورج الزمالة (CNN).References
- Gel Migration chart: . , http://www.invitrogen.com/etc/medialib/en/filelibrary/pdf.Par.99253.File.dat/O-063575-NuPage_fin.pdf Forthcoming.
- Complete western-blot protocol from the Invitrogen website. , https://commerce.invitrogen.com/index.cfm?fuseaction=iProtocol.unitSectionTree&treeNodeId=A2C5758BC7C3438B01378A0940376C8E Forthcoming.
- NuPAGE technical guide. , http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/nupage_tech_man.pdf Forthcoming.
- Instruction Manual, Mini Trans-Blot Cell. , http://www.bio-rad.com/cmc_upload/0/000/013/280/M1703930E.pdf Forthcoming.
- ECL Plus Western blotting detection reagents instruction. , http://www5.gelifesciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/139B41E53EDC6210C1256EB40044ACE3/$file/RPN2132PL_Rev_D_2006_web.pdf Forthcoming.
- Estimation of protein molecular weights by SDS gel electrophoresis, GE Healthcare Website. , http://www1.gelifesciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/elpho_applications~elpho_applications_1d_protein_analysis~elpho_sds_page~Elpho_1D_SDS+PAGE+2+Estimation+of+protein+molecular+weights+by+SDS+gel+electrophoresis+~3.+Procedure Forthcoming.
- Yeromin, A. V., et al. Molecular identification of the CRAC channel by altered ion selectivity in a mutant of Orai. Nature. 443, 226-229 (2006).
- Zhang, S. L., et al. Store-dependent and -independent modes regulating CRAC channel activity of human Orai1 and Orai3. J. Biol. Chem. 283, 17662-17671 (2008).
- Penna,, et al. The CRAC channel consists of a tetramer formed by Stim-induced dimerization of Orai dimers. Nature. , Forthcoming.
