Summary
这篇技术文章介绍了一个标准的程序，使用市售NuPAGE电泳迷你凝胶体系自Invitrogen Western印迹。
Abstract
免疫印迹（或免疫印迹）是一个标准的实验室程序，调查核实的一种蛋白质的表达，确定不同样品中的蛋白质目前的相对量，和免疫共沉淀实验分析结果。在此方法中，检测到目标蛋白质与特定抗体在组织匀浆或提取样品。根据分子量的蛋白质的分离是通过使用变性的SDS - PAGE。转移到膜后，靶蛋白的探测与特定的抗体，通过化学发光法检测。
自第一次描述，Western印迹技术已发生了一些改进，包括预制凝胶和用户友好的设备。在我们的实验室中，我们选择使用自Invitrogen市售NuPAGE电泳系统。这是一个创新的中性pH值，不连续的SDS - PAGE，预制小凝胶体系。该系统提出了一个较长的保质期从8个月至1年不等的预制凝胶ii）一个广泛的分离范围从1到400 kDa的分子量不同的类型，包括传统Laemmli技术的几个优势：一）凝胶使用;及iii）更大的灵活性（丙烯酰胺的比例，凝胶型，和运行缓冲液的离子组成范围）。
在这个视频文章中描述的程序利用了4-12％，二，三梯度凝胶和MES运行说明如何使用Invitrogen公司NuPAGE电泳系统进行免疫印迹的缓冲区，双三不连续缓冲系统。在我们的实验室中，我们已取得了良好的和可重复的结果，采用Western印迹方法的各种生化应用。
Protocol
凝胶电泳
技术说明 ：在启动程序之前，您的蛋白质样品准备。
在这第一步，样品中的蛋白质，根据其分子量使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离。锂十二烷基硫酸钠（LDS）中加载NuPAGE ® LDS样品缓冲液保持在变性状态，多肽，蛋白质样品已在70 ° C加热10分钟一次。强还原剂配合使用，以消除二级和三级结构（数码地面电视，打破二硫键）。此外，样品的蛋白质成为带负电荷的摩门教覆盖，并因此带正电的电极通过丙烯酰胺凝胶网状走向。根据分子量（公斤道尔顿，KDA测量），这使得他们的分离。
的Invitrogen公司网站2上可以找到详细的一步一步的样品制备和网页程序的协议，或在NuPAGE 技术指导3。
技术秘诀
- Invitrogen公司NuPAGE双三不连续缓冲系统，电泳迁移率的蛋白质和随后的凝胶分离范围取决于两个因素：一）acrylamid凝胶浓度（与更大的丙烯酰胺的浓度，导致较低的分辨率更好分子量的蛋白质）和ii）运行缓冲液，公开资讯观测站或MES尾随离子。要选择适当的组合，你想实现的分离范围，是指凝胶迁移图1。凝胶的厚度和井数将取决于您计划分别加载，样品的数量和数量。
- 当你加载到您的样品的凝胶井，至少有一条车道被保留为分子量标记（或梯形）。这些蛋白质标准市售的几家公司，通常由一个有定义的分子量染色蛋白质的混合物，使之形成可见光波段，使您能够按照移民进度。选择一个兼容凝胶决议的分子量范围。
- 为了实现好，甚至迁移模式，我们建议您凝胶井装上一个类似的样品或1X LDS样品缓冲量。
转让
技术说明 ：转让步骤开始之前，准备转移的缓冲液（用10％甲醇1X）和预冷却到4 ° C的寒冷的房间。
为了使抗体检测的蛋白质，他们转移到硝酸纤维素膜，凝胶electroblotting。基于疏水相互作用，以及负责膜和蛋白质之间的相互作用蛋白结合。
（聚偏二氟乙烯（PVDF）膜也可以被用来作为一种替代，在这种情况下，聚偏氟乙烯膜需要在甲醇预湿，使用前至少30秒。）
一个详细的一步一步的协议的传输过程中可以发现在参考文献4，如果您使用Bio - Rad公司的小型跨印迹电泳转移细胞，或引用2-3，如果您的实验室是配备与Invitrogen公司的XCell II™吸干模块。
作为这一过程的结果，暴露在一个薄的表面层的蛋白质，并准备进行检测。可以检查可逆丽春红染料膜染色的蛋白质从凝胶转移到膜的均匀性和整体效益。
丽春红S染色程序（可选）：
- 转移的蛋白质后，放置在孵化盘膜（蛋白质朝上）。
- 加入足够的丽春红S染色覆盖膜，轻轻摇动孵育至少30秒。
- 用蒸馏水冲洗膜，直到背景清晰。
- Destain运行2-3分钟，蒸馏水膜。
- 将膜在封闭液（见下文）。
技术提示：
- 我们建议你的膜蛋白转移前的铅笔标签，以表示在其中的蛋白质被暴露的侧面和您的样品的方向。
- 丽春红S染色和分子量标记可以用来探测不同的抗体产生的部分削减后的转印膜
免疫检测：
技术说明 ：这种免疫检测过程只作为指引。优化可能需要为每个蚂蚁ibody;具体的信息可以发现在大部分市售的抗体数据表（例如，工作液，培养时间等）。
在这最后的过程中，目标蛋白质将使用特定抗体检测，并会出现作为一个乐队在胶片上。乐队中的位置是依赖靶蛋白的分子量，而带的强度取决于靶蛋白目前量上。
通常，这是后三个子步骤实现：
- 阻塞：为了避免与非特异性抗体的相互作用的膜（膜的多余的空间是用一个通用的蛋白质的稀溶液覆盖）。
- 探讨：感兴趣的蛋白质是由一个特定的初级抗体检测。冲走后未结合的抗体，膜接触到不同的抗体与记者酶 ， 辣根过氧化物酶 （HRP）。这个二级抗体是针对物种的特定部分抗体（ 如抗兔二抗将绑定到任何兔源抗体）。
- 检测：化学发光剂作为基质，将暴露时，发光二级抗体的HRP。这种反应产生发光的地方，在探测蛋白质的量成比例。然后检测到的光感光胶片。
下面提供一个通用的一步一步的程序。其他详细的程序中可以找到的ECL Plus西方印迹检测试剂说明书5，或在最所附数据表市售的抗体。孵化时间，抗体的稀释，和封锁和清洗解决方案，每个抗体凭经验优化。
免疫检测程序：
- 阻止非特异性结合，培育足够的体积PBS 1％酪蛋白阻塞的解决方案，以覆盖整个膜。放在摇杆在室温下至少30分钟或4℃过夜° C。
- 孵育与您的主要的抗体（蛋白质利益的具体）的膜。应在封闭液稀释的主要抗体。对于大多数的抗体，实现完整的具有约束力的潜伏期1-2个小时后在室温下轻轻摇动下。此外，孵化步骤可以进行4℃过夜° C至增加信噪比。
- 删除的解决方案（丢弃或保持在4 ° C至-20 ° C的重复使用），快速洗膜一次。然后用PBS，0.05％吐温20（PBST）在室温下剧烈摇晃3X10分钟。
- 孵育膜与HRP耦合二次封闭液稀释的抗体。选择抗体识别的提出的主要抗体是其中的物种的IgG部分。潜伏期是在室温下轻轻摇动的温度为1小时。
- 丢弃的解决方案和快速洗膜一次。然后在室温下剧烈摇晃PBST 3X10分钟。
- 根据制造商的指令，继续进行化学发光检测。我们使用从通用电气医疗集团（具体说明见参考文献5）的ECL Plus Western印迹检测试剂。
- 请将您的膜保鲜膜，或邮袋和内的放射自显影盒。确保排出多余的液体，并删除所有气泡。
- 使感光胶片膜在黑暗的房间。开始1分钟的曝光时间，并根据所需的信号强度进行调整。
技术提示：
- 阻断非特异性结合，是通过放置在稀溶液中的蛋白质膜。我们通常使用1％的酪蛋白， 但牛血清白蛋白（〜2％BSA）或不脱脂奶粉（〜5％），可以作为替代使用。
- 可用于整个过程，而不是PBS的Tris缓冲液（TBS）。我们推荐使用的TBS如果您计划您的膜探针与磷酸抗体。
- 利用辉光在黑暗的贴纸（如Stratagene的Glogos ® II Autorad标记）的放射自显影盒的底部挖掘，将帮助您对齐在分析步骤中，您的电影和你的膜。
分析
现在你已经暴露了你的电影，你会发现，在实践中，并非所有的西部片揭示蛋白质作为一个漂亮的单波段。 AdditionaL波段也可能出现由于小学和中学的抗体非特异性结合。优化免疫检测程序，可以减少这种背景信号。此外，适当的控制（例如，未转染细胞，siRNA处理的细胞等）将是有益的，以确定您的抗体的特异性和靶蛋白膜的确切位置。
胶片上的标记后染蛋白膜的标准带的位置，画出每个分子量的日志 对他们的相对移动（X轴）（y轴）的蛋白质标准。相对流动性（RF）的蛋白质，从它的起源点（凝胶的顶部）的相对距离跟踪染料或低分子量标记移动的距离比使用的术语，提出（凝胶前） 。确定的标准曲线，获得斜率和截距值的回归线。未知靶蛋白（分子量大小），估计使用其Rf和修改了以下方程：
日志分子量=（斜率）（靶蛋白的流动性或RF）+ Y轴截距
（详细说明见参考文献6）。
通过比较靶蛋白的峰强度的结构蛋白（如微管蛋白或肌动蛋白）或如GAPDH看家基因产品的表达水平近似。这种所谓的“加载控制”，不应该改变和样品之间透露使用特定的抗体。图像可能会进一步通过密度测量，以评估蛋白表达的相对量，光密度的量化结果进行分析。
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Discussion
这里介绍的程序使用双三凝胶与MES作为使用Invitrogen公司NuPAGE NOVEX电泳系统变性PAGE的例子运行缓冲区。此外，这个预制凝胶系统允许下变性或非变性条件以及蛋白质分离，容纳了广泛的分子量范围（1-200 kDa的双三凝胶为36-400 kDa的三醋酸凝胶）。根据你的实验，你可以选择只遵循此处描述的Western印迹技术的一部分，使用直接凝胶染色程序（例如，银或考马斯染色）或其他免疫检测方法（例如，比色法或荧光）。
我们经常使用Invitrogen公司NuPAGE NOVEX电泳系统在我们的各种应用实验室，其中的一些例子可以发现，在引用7-9。
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Acknowledgments
这项工作是由来自美国国立卫生和乔治E ·休伊特基金会奖学金（美联社）研究院的拨款支持。References
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- Complete western-blot protocol from the Invitrogen website. , https://commerce.invitrogen.com/index.cfm?fuseaction=iProtocol.unitSectionTree&treeNodeId=A2C5758BC7C3438B01378A0940376C8E Forthcoming.
- NuPAGE technical guide. , http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/nupage_tech_man.pdf Forthcoming.
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