Western blotting Använda Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Summary

Denna tekniska artikeln beskrivs ett standard western-blotting med kommersiellt tillgängliga NuPAGE elektrofores Mini-Gel system från Invitrogen.

Abstract

Western blotting (eller immunoblotting) är en standard laboratorium förfarande som medger utredare för att kontrollera uttrycket av ett protein, bestämma den relativa mängden av det protein som finns i olika prover och analysera resultaten av samarbetet immunoprecipitation experiment. I denna metod är ett målprotein upptäckas med en specifik primära antikroppen i ett visst prov av vävnad homogenatet eller utdraget. Protein separation enligt molekylvikt uppnås med hjälp av denaturering SDS-PAGE. Efter överföring till ett membran, är det målprotein sonderade med en specifik primär antikropp och upptäcks av kemiluminiscens.

Sedan den första beskrivningen, har den västra-analys tekniken genomgått flera förbättringar, inklusive prefabricerade geler och användarvänlig utrustning. I vårt laboratorium har vi valt att använda kommersiellt tillgängliga systemet NuPAGE elektrofores från Invitrogen. Det är ett innovativt neutralt pH, diskontinuerlig SDS-PAGE, pre-cast mini-gel-system. Detta system ger flera fördelar jämfört med de traditionella Laemmli tekniken inbegripet i) en längre hållbarhet av prefabricerade geler från 8 månader till 1 år, ii) en bred separation rad molekylvikter 1 till 400 kDa beroende på typ av gel som används, och iii) större flexibilitet (utbud av akrylamid procent, typ av gel, och det joniska sammansättningen av löpande buffert).

Det förfarande som beskrivs i den här videon artikeln utnyttjar Bis-Tris diskontinuerlig buffert system med 4-12% Bis-Tris gradient geler och MES löpande buffert, som en illustration till hur man utför en västerländsk blot med Invitrogen systemet NuPAGE elektrofores. I vårt laboratorium har vi fått goda och reproducerbara resultat för olika biokemiska tillämpningar med denna western-analys metod.

Protocol

Gelelektrofores

Teknisk anmärkning: Innan du börjar förfarandet har ditt protein prover redo.

Under detta första steg, är de proteiner i provet separeras beroende på molekylvikt med hjälp av denaturering elektrofores polyakrylamidgelelektrofores (sida). Den NuPAGE ® LDS Sample buffert laddad med Litium Dodecyl Sulfate (LDS) upprätthåller polypeptider i ett denaturerad tillstånd när proteinet prov har upphettats vid 70 ° C i 10 minuter. Ett starkt reduktionsmedel används tillsammans för att ta bort sekundär och tertiär struktur (DTT, att bryta disulfid obligationer). Dessutom blir prov proteiner som ingår i den negativt laddade LDS och därmed flytta genom akrylamid maska ​​i gelen mot den positivt laddade elektroden. Detta gör att deras separation enligt molekylvikt (mätt i kilo Dalton kDa).

Detaljerade steg-för-steg-protokoll för provberedning och sidan förfarande kan hittas på Invitrogen hemsidan ^2, eller i NuPAGE TEKNISK GUIDE ^3.

Tekniska tips

1. I Invitrogen NuPAGE Bis-Tris diskontinuerlig buffert system, är den genom elektrofores rörlighet proteiner och den efterföljande separationen utbud av gelen beroende på två faktorer: i) acrylamid koncentrationen av gelen (med större akrylamid koncentration som resulterade i bättre upplösning av lägre molekylvikt proteiner) och ii) den avslutande jon den löpande buffert, MOPS eller MES. För att välja rätt kombination för separation område som du vill uppnå, se Gel Migration diagram ^1. Tjockleken på gelen och antalet brunnar beror på volymen och mängden av prover som du planerar att ladda, respektive.
2. När du läser in dina prover i brunnar i gelen är minst ett körfält reserverat för en molekylviktsmarkör (eller stege). Dessa protein standarder är kommersiellt tillgängliga från flera företag och normalt bestå av en blandning av färgade proteiner ha definierat molekylvikt, så att de utgör synliga band som gör att du kan följa migrationen framsteg. Välj en rad molekylvikter som är kompatibel med din gel upplösning.
3. För att uppnå en fin och även migrations mönster rekommenderar vi ALLA brunnarna på din gel med en liknande volym av prov eller 1X LDS prov buffert.

Överföring

Teknisk anmärkning: Innan du börjar överföringen steg, förbereda övergången buffert (1X med 10% metanol) och pre-cool till 4 ° C i ett kallt rum.

För att göra de proteiner tillgänglig för påvisande av antikroppar, de överförs av electroblotting från gelen på en nitrocellulosa membran. Proteinbindningen är baserad på hydrofoba interaktioner, och samspel laddning mellan membranet och protein.

(Polyvinylidenfluorid (PVDF) membran kan också användas som ett alternativ. I så fall måste PVDF membran som ska pre-vått i metanol i minst 30 sekunder före användning.)

En detaljerad steg-för-steg-protokollet av överföringen förfarandet finns i referens 4 om du använder Bio-Rad Mini Trans-Blot Elektroforesisk Transfer Cell, eller i referenserna 2-3 om din Labbet är utrustat med Invitrogen s XCell II ™ Blot modul.

Som ett resultat av denna process är de proteiner som exponeras på ett tunt ytskikt och redo för upptäckt. Den enhetlighet och övergripande effektivitet av överföring av protein från gelen till membranet kan kontrolleras genom den reversibla Ponceau S dye membranfärgning.

Ponceau S färgningsproceduren (valfritt):

1. Överför proteiner, placera membranet i en inkubationstid fack (proteiner uppåt).
2. Lägg tillräckligt Ponceau S Staining att täcka membranet och inkubera i minst 30 sekunder under försiktig omrörning.
3. Skölj membranet med destillerat vatten tills bakgrunden är klar.
4. Avfärga membranet med rinnande vatten i 2-3 minuter.
5. Placera membranet i blockerande lösningen (se nedan).

Tekniska tips:

1. Vi rekommenderar märkning din membran med en penna innan protein överförs för att beteckna den sida där de proteiner utsattes och orientering dina prover.
2. Båda Ponceau S färgning och molekylära markörer vikt kan användas för att skära membranet efter överföring för sondering den resulterande delar med olika antikroppar

Immunodetection:

Teknisk anmärkning: Detta immunodetection förfarande föreskrivs som riktlinjer. Optimering kan krävas för varje myraibody, specifik information kan hittas i de flesta datablad av kommersiellt tillgängliga antikroppar (t.ex. arbetar utspädning, inkubationstid, etc.).

Under denna sista processen kommer målprotein påvisas med en specifik antikropp och visas som ett band på filmen. Placeringen av bandet är beroende av molekylvikt av målet protein, medan bandet intensiteten beror på mängden av målprotein närvarande.

Normalt är detta uppnås efter tre delsteg:

1. Blockering: För att undvika icke-specifika interaktioner av antikroppen med membran (överskottet utrymme på membranet är täckt med en utspädd lösning av ett generiskt protein).
2. Probing: Proteinet av intresse upptäcks av en specifik primär antikropp . Efter den obundna primära antikroppen tvättas bort, är membranet utsätts för en annan antikropp kopplad till reportern enzym , pepparrotsperoxidas (HRP). Denna sekundära antikroppen är riktad mot den artspecifika delen av den primära antikroppen (t.ex. en anti-kanin sekundär antikropp binder till någon kanin källkod-primär antikropp).
3. Detektion: En kemiluminiscent medel används som ett substrat som kommer luminesce när det utsätts för HRP på den sekundära antikroppen. Denna reaktion ger luminiscens på plats och i proportion till den mängd sonderade protein. Ljuset är då upptäcks av fotografisk film.

Ett generiskt steg-för-steg finns nedan. Andra detaljerade förfaranden finns i behörighetslistan Plus Western blotting Detection Reagenser bruksanvisningen ⁵ eller i de flesta datablad som medföljer kommersiellt tillgängliga antikroppar. Inkubationstid, antikroppar utspädning, och blockera och lösningar tvätta måste vara empiriskt optimeras för varje antikropp.

Immunodetection förfarande:

1. Blockera den icke-specifik bindning genom inkubering med tillräcklig volym av PBS 1% kasein blockerande lösningen till att omfatta hela membranet. Placera på en rocker i minst 30 minuter i rumstemperatur eller över natten vid 4 ° C.
2. Inkubera membran med din primära antikroppen (specifika för proteinet av intresse). Den primära antikroppen bör spädas i blockerande lösningen. För de flesta antikroppar, är fullständig bindande uppnås efter 1-2 timmar inkubation vid rumstemperatur under försiktig omrörning. Alternativt kan inkuberingssteget ske över natten vid 4 ° C för att öka signal-brus-förhållande.
3. Ta bort lösningen (kassera eller hålla vid 4 ° C till -20 ° C för upprepad användning) och snabbt tvätta membranet gång. Sedan 3x10 minuter med PBS, 0,05% Tween 20 (PBST) vid rumstemperatur med kraftig omskakning.
4. Inkubera membran med en HRP-kopplad sekundär antikropp spätts i blockerande lösningen. Välj en antikropp som känner igen IgG del av arter där den primära antikroppen togs upp. Inkubationen sker under 1 timme vid rumstemperatur under försiktig omrörning.
5. Kassera lösningen och snabbt tvätta membranet gång. Sedan 3x10 minuter med PBST vid rumstemperatur med kraftig omskakning.
6. Fortsätt till kemiluminiscent upptäckt enligt tillverkarens instruktioner. Vi använder ECL Plus Western blotting Detection Reagenser från GE Healthcare (se referens 5 för specifika instruktioner).
7. Placera membranet i Saran omslag eller en påse och lägg in en autoradiografi kassett. Se till att dränera överflödig vätska och ta bort alla luftbubblor.
8. Exponera fotografisk film till membran i ett mörkt rum. Börja med en 1 minut exponeringstid och anpassa efter önskad signalstyrka.

Tekniska tips:

1. Blockering av icke-specifik bindning uppnås genom att placera membranet i en utspädd lösning av protein. Vi använder vanligtvis 1% kasein, men bovint serumalbumin (~ 2% BSA) eller fettfri torrmjölk (~ 5%) kan användas som ett alternativ.
2. Tris-saltlösning (TBS) kan användas under hela förfarandet i stället för PBS. Vi rekommenderar att du använder TBS om du planerar att söka av din membran med phosphospecific antikropp.
3. Användningen av en glöd-in-the-dark klistermärke (t.ex. Stratagene är Glogos ® II Autorad Markörer) knackade i botten av autoradiografi kassetten kommer att hjälpa dig att anpassa din film och din membran under analysen steg.

Analys

Nu när du har utsatt din film, kommer du att inse att i praktiken inte alla Westerns avslöja protein som en trevlig enda band. Additional band kan också visas på grund av icke-specifik bindning av både primära och sekundära antikroppar. Denna bakgrund signal kan minskas genom att optimera immunodetection förfarande. Dessutom kommer en lämplig kontroll (t.ex. untransfected celler, siRNA-behandlade celler, etc) vara användbart för att bestämma specificiteten av dina antikroppar och den exakta platsen för målproteinet på membranet.

Efter märkning på filmen positionen av de färgade banden protein standard från membranet, tomt loggen varje molekylvikt av proteinet standarder (y-axeln) mot motsvarande relativa rörlighet (x-axel). Relativ rörlighet (RF) är den term som används för kvoten av avståndet proteinet har flyttat från sin utgångspunkt (toppen av gel) i förhållande till avståndet spårning dye eller en låg molekylviktsmarkör har flyttat (gelen framsidan) . Bestäm regressionslinjen av standardkurvan för att erhålla värden för lutning och y-axeln. Den okända molekylvikt (storlek) av din målprotein uppskattas med hjälp av RF och följande ändrade ekvation:

log molekylvikt = (lutning) (rörlighet eller Rf av målprotein) + y-axeln

(Se referens 6 för detaljerade instruktioner).

Expression nivå approximationer tas genom att jämföra bandet intensitet målprotein den i ett strukturellt protein (t.ex. tubulin eller aktin) eller en städning gen produkt som GAPDH. Denna så kallade "loading kontroll" bör inte förändras mellan prov och avslöjas med hjälp av en specifik primär antikropp. Bilden kan analyseras ytterligare genom densitometri för att utvärdera den relativa mängd protein färgning och kvantifiera resultat i form av optisk densitet.

Discussion

Förfarandet som presenteras här används en Bis-Tris gel med MES löpande buffert som ett exempel på denaturering sidan med hjälp av Invitrogen NuPAGE Novex elektrofores system. Dessutom ger detta prefabricerade gel systemet protein separation i denaturering eller icke-denaturering villkor samt rymmer ett brett spektrum av molekylvikt (1 till 200 kDa för BIS-Tris geler till 36-400 kDa för Tris- Acetat geler). Beroende på ditt experiment kan du välja att följa bara en del av västra-analys teknik som beskrivs här och använda direkt förfaranden gel färgning (t.ex. silver eller Coomassie färgning) eller en alternativ immunodetection metod (t.ex. kolorimetriska eller fluorescerande).

Vi rutinmässigt använder Invitrogen NuPAGE Novex elektrofores system i vårt laboratorium för olika tillämpningar, kan några exempel som finns i referenserna 7-9.