Разбор и 2-Фотон изображений периферических лимфатических узлов у мышей

Summary

Двухфотонное изображений обнаружила лимфоцитов моторики и клеточных взаимодействий внутри лимфатических узлов под базальных условиях и во время иммунного ответа ^1. Здесь мы демонстрируем приемных передачи Т-клеток, изоляция лимфатических узлов и изображений подвижность CD4 + Т-клеток в эксплантированных лимфатических узлов.

Abstract

Двухфотонное изображений показал, элегантной хореографии моторики и клеточных взаимодействий внутри лимфатических узлов под базальных условиях и при инициировании иммунного ответа ^1. Здесь мы представляем методы для приемных передачи меченых Т-клеток, изоляция лимфатических узлов и изображений подвижность CD4 + Т-клеток в лимфатических узлах эксплантированных как впервые описал в 2002 году ^2. Двухфотонное визуализации клеток иммунной системы требует, чтобы клетки флуоресцентно помечены, либо окрашиванием красителем трекер ячейки или, выражая флуоресцентного белка. Мы демонстрируем приемных процедура передачи инъекционных клетки, полученные от доноров мышам в хвостовую вену животного-реципиента, где они домой лимфоидных органах в течение примерно 15-30 мин. Проиллюстрируем изоляции лимфатических узлов и описывать методы для обеспечения правильного монтажа вырезали лимфатических узлов. Другие факторы, такие как надлежащего оксигенации перфузии среды, температуры и мощности лазерного излучения обсуждаются. Наконец, мы представляем 3D изображения видео наивных CD4 + T-клетки, обладающие устойчивой моторики состоянии при температуре 37 ° C.

Protocol

1. Приемные передачи ячеек:

Хвостовую вену или внутриглазной инъекции являются подходящие методы для введения клеточных трекер меченных или флуоресцентный белок, экспрессирующих лимфоцитов. В этом видео. мы демонстрируем приемных передачи клеток хвоста инъекции вены.

a. Материалы

CD4 + T-клетки помечены 1,4 мкМ CFSE в течение 30 минут при температуре 37 º C, промывают два раза, и ресуспендировали в 100 мкл RPMI-1640. Клетки загружаются в стерильных 28 калибр инсулиновый шприц для инъекций. Число клеток используется, зависит от эксперимента делается. Как правило, 5 млн. Т-клетки достаточно для простых T визуализации клеток. Грызун фиксатор для мыши, необходимых для предотвращения повреждения животных и самому себе.

b. Защита животных

Мыши обеспечивается для приемных передаче медленно поддержку животных в грызун фиксатор (см. видео) и закрытия открытого конца трубки, осторожно удручает поршень. Не отпускать мыши хвост во время этого процесса, так как некоторые мелкие животные могут повернуться в фиксатор. Этот метод предотвращает животное от ранив себя и от перемещения во время инъекции. При настройке грызунов фиксатор, не толкать поршень в дальнейшем, чем это необходимо держать животное прыгает вперед. Кроме того, не толкать поршень против животного, и не оставляйте животное в фиксатор в течение длительного периода времени.

c. Визуализация хвостовую вену

Осторожно потяните за хвост к Вам так, чтобы она слегка завернуты за указательный палец и провел против внутренней части пальцев на большой палец. Определить хвост вены расположены по обе стороны стойки, хвост. Визуализация способствует потеплению хвост с теплой водой, затем протирки с этанолом.

d. Инъекции клеток

Когда вены была расположена, вставьте шприц конической стороной вверх под небольшим углом к ​​параллельным вены. Как-то в вену, слегка нажмите поршень, если вы находитесь в вену не должно быть никакого сопротивления инъекции. Если есть какие-либо сопротивление, удалите шприц и попробуйте еще раз в другом месте.

Если вы находитесь в вену, медленно снижают поршень, пока инъекция завершена. Хвост не должен стать растянутый во время инъекции. Если это произойдет, это будет означать, что игла не находится в вене. Есть возможность "потерять" вены во время инъекции. Если это произойдет, удалить иглу и попробовать свои инъекцию в другом месте. Если вам нужно попытаться более одной инъекции, то лучше двигаться хвостом вверх к теле мыши от первоначального места инъекции. Планируйте заранее к этому, начав дистально на хвосте, чтобы обеспечить себе место для еще одной попыткой приемных передачи.

e. После инъекции соображений

После инъекции завершен, небольшой обратный поток крови из вены произойдет. Аккуратно нажмите месте инъекции с очистки протрите до остановки кровотечения. Удалите поршень и дайте животному идти вперед, из фиксатор, мягко держась за хвост.

Всегда проверяйте с вашим животным комитет помощи и протоколы использования животных, чтобы вы в состоянии соблюдения. Важно, чтобы практиковать этот метод несколько раз, прежде чем пытаться реальном эксперименте.

2. Изоляция лимфатических узлов

Выделение лимфатических узлах в течение двух изображений фотона требует тщательного удаления правильный узел лимфы из окружающих тканей.

a. Выбор и расположение периферических лимфатических узлов

Выбор лимфатических узлов для работы с изображениями, будет зависеть от экспериментальных целей. Имейте в виду, местной инфекции или инъекции осушение лимфатические узлы, и выбрать соответствующий узел для обработки изображений. Статья Ван ден Брок и соавт. Описывает местоположение и морфология мышиной лимфатических узлов подробно ^3. В этом видео, мы демонстрируем иссечение шесть крупных периферических лимфатических узлов, которые подходят для изоляции ячейки или изображений.

b. Удаление лимфатических узлов:

Имейте в виду, целостность тканей при удалении лимфатических узлов. Будьте осторожны, чтобы не разрыв капсулы или каким-либо образом повредить структуру лимфатических узлов. Потеря лимфатических узлов структурной целостности пойдет на компромисс эксперимента. В случае необходимости, удалить жир с поверхности лимфатических узлов с мелкими рассекает (# 5 Дюмон) щипцы при вскрытии микроскопом. Лимфатические узлы не должны иметь никаких оставшихся жира на поверхности узла, так как это скроет изображение при рассеянии света.

Правильное удаление лимфатических узлов также является важным технику на практике, прежде чем первый реальный эксперимент.

3. Лимфатические НодУстановка электронных изображений и соображения

Лимфатического узла должно быть закреплен на этапе визуализации, которое в данном случае состоит из встраиваемые камеры. Утепленный, кислородно-перфузии СМИ подается в камеру с одной стороны с использованием перистальтического насоса и встроенный нагреватель, и она выходит через вниз-градуированных канал в сборную камеру с вакуумной трубки в колбу сбора отходов. В нашей системе, лимфатических узлов погружен в 37 ° C средствах массовой информации и супер-озарен медицинского назначения карбогена (5% CO _2, 95% O _2). Температура перфузии СМИ должны быть записаны как можно ближе к лимфатических узлов, как это возможно. Ваш конкретной системы может потребовать изменения скорости потока средств массовой информации и сценографии, чтобы приспособить столик микроскопа и объективным.

a. Лимфатических узлов визуализации установки:

Как показано на видео, мы обеспечиваем лимфатических узлов, сначала прикрепив ее, медуллярный стороной вниз (к изображению Т или В-клеток зон с использованием прямой микроскоп) для пластиковых покровное, разрезать на соответствующий размер. Важно использовать нетоксичное ткань клеем (мы используем VetBond ™ от компании 3M Corporation).

Покровное закреплен в текучей среды путем размещения небольшой мазок силиконовой смазки на нижней стороне крышки скольжения, то придерживаясь этого стекла базе камеры изображений.

b. 2-Фотон изображений соображения:

Ряд факторов может привести к лимфоциты, чтобы остановить движение: температура, которая является слишком высокой или слишком низкой; избыток мощности лазера, сжатие или иным повреждением лимфатических узлов, и недостатка кислорода. Ущерб из-за чрезмерной мощности лазерного или температуры> ~ 39 ° C является необратимым.

Если клетки тусклые, она, как правило, лучше увеличить коэффициент усиления детектора или клеточной маркировке протокол, а не использовать более высокую мощность лазера для визуализации клеток. Оптимизация маркировки или выражение флуоресцентные белки могут быть необходимы для вступления флуоресценции выше уровня фона флуоресценции. С разумной усиления и настройки мощности лазера, около двух журналов сдвиг флуоресценции выше базового уровня (измеряется с помощью проточной цитометрии) является разумным для клеточной визуализации.

С перестраиваемых двухфотонного лазера, длина волны используются для возбуждения должна быть немного меньше, чем в два раза однофотонной возбуждения максимум флуорофора будучи в образ. В двух-фотонного экспериментов с использованием более одного знака или флуоресцентный белок может быть необходимо, чтобы экспериментировать с длиной волны возбуждения используется для поиска оптимальных настроек для обеих этикетках. Двухфотонного возбуждения может быть также использована для изображения структуры эндогенного коллагена, воспользовавшись внутренней синий генерации второй гармоники. Генерация второй гармоники (ГВГ) имеет место, когда два фотона объединены в материальной и испускают один фотон удвоенной частотой оригинальные фотонов. В тканях, двухфотонного возбуждения происходит, когда свет, падающий лазерный перпендикулярно высокоупорядоченных структуры белка, такие как коллаген.

Практические вопросы, связанные с двухфотонного изображения были обсуждены в режиме предварительного просмотра отзывов ^{4, 5.}

Discussion

В этом видео мы покажем, протокол процедуры для приемных передачи клетки и лимфатических узлов изоляции и подготовка необходимых для работы с изображениями лимфоцитов подвижность в периферических лимфатических узлов. Двухфотонное изображений имеет несколько преимуществ по сравнению с конфокальной микроскопии в обоих эксплантированных тканей (как показано здесь) и в прижизненной препаратов. Следует отметить, что использование инфракрасного возбуждения минимизирует рассеяние света и позволяет для работы с изображениями ~ 300 мкм под капсулу лимфатического узла и глубже в некоторых тканях ^4. Более того, многофотонное возбуждение ограничивается фокус цель, сводя к минимуму фото отбеливание и повреждение тканей из стороны фокальной плоскости. Как и с любой новой техники, однако, двухфотонного изображения не является панацеей и ее ограничения и потенциальные подводные камни должны иметь в виду, ^5. Среди них есть требование, что - за исключением внутренних сигналов, таких как генерация второй гармоники на коллаген-клеток заинтересованности должны быть помечены флуоресцентно внешних зондов или выражением флуоресцентных белков. Впечатление, таким образом, создал, что эти меченые клетки плавают в черной пустоте, тогда как на самом деле они погружены в и взаимодействовать с ними сложных условиях структурных элементов и множество других немеченого, невидимые клеток.

В шесть лет с момента введения двухфотонного визуализации для иммунологии, эта методика позволила исследователям адрес давние вопросы по визуализации непосредственно в интактных живых тканях процессов, включая межклеточных взаимодействий, подвижность клеток и локализации, сотовой сигнальных путей и цитотоксических убийство событий. Поле быстро превратилась за первоначальный феноменологические описания и количественного анализа вместе с компьютерного моделирования и моделирования в настоящее время начинают иметь смысл, как, казалось бы, хаотическое сотовой движения и взаимодействия внутри лимфатических узлов приводит к эффективной иммунной реакции. Этот прогресс был детально рассмотрен в недавней публикации ^1, в котором перечислены более 100 статей, описывающих применение двух-фотонной микроскопии для immunoimaging.