Summary
기술은 운동하는 동안 포유류의 뉴런의 생체내 생리적 반응을 수량과의 연결 형태, neurochemical 표현형 및 시냅스 microcircuitry와 신경 세포의 생리 신원을 확인하도록 설명되어 있습니다.
Abstract
개별 뉴런과의 연결 회로에서 함수의 역할은 감각과 운동 기능의의 연결 메커니즘을 이해하는 데 필수적입니다. 동물은 운동하는 동안 정적 1,2 또는 레코드 세포의 연결 활동을하는 동안 sensorimotor 메커니즘 대부분의 조사는 뉴런 중 하나가 검사에 의존하고 있습니다. 3,4를 이러한 연구는 sensorimotor 기능을 위해 근본적인 배경을 제공하는 동안, 그들 중 기능적 정보를 평가하지 이것은 운동 중에 발생하거나 완전히 신경의 해부, 생리 및 neurochemical 표현형을 특징하는 능력에 제한됩니다. 기술은 생체내 운동의 기간 동안 개별 뉴런의 광범위한 특성을 허용하는 여기에 표시됩니다. 이 기술은 기본 수입 성의 뉴런을 공부뿐만 아니라 motoneurons 및 sensorimotor의 interneurons을 특성화하기 위해뿐만 아니라 사용하실 수 있습니다. 처음에는 하나의 신경 세포의 반응은 신경 세포에 대한 수용 분야의 결정 다음 mandible의 다양한 움직임 동안 electrophysiological 방법을 사용하여 기록됩니다. 의 연결을 추적은 다음 intracellularly 신경 세포에 주입되고 두뇌는 신경 세포가 빛을, 전자 또는 공촛점 현미경 (그림 1)과 시각 수 있도록 처리됩니다. 의 연결 형태가 신경 세포 (Figs. 2,3)의 생리적 반응과 상관 수 있도록 특성화 신경 세포의 자세한 형태는 다음 복원됩니다. 의사 소통이이 기술의 성공적인 구현을위한 중요한 핵심 세부 사항 및 도움말이 제공됩니다. 유용한 추가 정보는 다른 방법과이 방법을 결합하여 연구에서 신경 세포에 대한 결정하실 수 있습니다. 역행의 연결 레이블이 뉴런을 결정하는 데 사용할 수있는 레이블이 붙은 신경 세포의 시냅스와;의 연결 회로의 수 있으므로 자세한 결의. Immunocytochemistry은 표시 신경 세포 내의 신경 전달 물질을 검토하고있는 레이블 신경 세포의 시냅스가 뉴런의 화학 phenotypes을 결정하기 위해이 방법과 함께하실 수 있습니다. 분류 뉴런은 또한 레이블 신경 세포의 ultrastructural 기능과 microcircuitry을 결정하기 위해 전자 현미경을 위해 처리될 수 있습니다. 전체이 기술은 철저하게되므로 sensorimotor 기능에 신경 세포의 역할에 상당한 통찰력을 수 있단 운동의 동안 신경을 특성화하기위한 강력한 방법입니다.
Protocol
1. 동물 준비
- pentobarbital 나트륨 (50mg/kg IP) 및 난방 패드에 장소와 쥐 마취. 동물 가위로 사후 두개골을 overlying 피부를 면도. 발가락이 palpebral 반사의 부재로 모근뿐만 아니라 경우 마취 수준의 수술 수준이 탈퇴 반사와 발성의 부재에 대한 테스트에서 얻은되었음을 보증하기 위해 동물을 확인합니다. 마취 15 분 간격의 수준을 확인하고 나트륨 pentobarbital 15mg/kg의 주사 45 분마다에 의해 anesthetisa의 수술 수준을 유지합니다.
- 무균 기술을 사용하고 복부와 허벅지 안쪽에 의해 형성 포복 절도에 사타구니 지역에서 절개 단지 말초하고 대퇴 정맥에 정맥 (1mm 직경, 클레이 아담스)과 대퇴 동맥에 삽입합니다. 턱밑 지역의 정중선 절개를 만들고, infrahyoid 근육을 반영합니다. 기관의 작은 절개를하고 환기를 허용하도록 정맥 (2mm 직경)를 삽입합니다. 동맥 정맥을 통해 place.Monitor 체계 diastolic 및 수축기 혈압에 확보 cannual trachael 주위에 치료를 타이. 철수와 palpebral 반응을 모니터링하는 것 외에도 지금 마취의 수준을 평가하기 위해 혈압을 모니터링합니다. 정맥 정맥을 통해 필요할 때 추가적인 마취를 관리할 수 있습니다.
- stereotaxic 프레임에 쥐 장소와 소뇌를 폭로 craniotomy을 수행합니다. 쥐 때문에 환기에 tracheal 정맥을 연결합니다. humidified 공기와 100/min의 속도 2cm 3의 부피와 동물을 환기. 1cm H 2 O의 긍정적인 최종 날숨 압력이 폐 붕괴를 방지하기 위해 유지되어야합니다. 매 15 분 무기폐을 방지하기 위해 폐가 hyperinflate. 다음 예열 미네랄 오일 (30 ° C)와 함께 두뇌의 표면을 커버. 직접 두정 골과 interparietal 뼈 사이의 교차점 아래에있는 큰 정맥 구멍을 피하기 위해주의하십시오.
- 전자기 진동에 결합 막대에 cyanoacrylate 접착제를 적용하고 턱뼈의 치극이라고에있는 막대를 부착합니다. 중 A / D 컴퓨터 출력 또는 신호 발생기의 진동에 mandible 사용하는 명령 신호를 이동합니다.
- craniotomy에 인접한 피부 아래 siliver - 실버 염화물 접지 전극을 배치합니다.
2. 전극 준비
- 수평 microelectrode의 풀러를 사용하여 석영 또는 aluminosilicate 유리의 microelectrodes를 조작.
- 0.25M KCl과 0.5M 트리스 버퍼 HCL (산도 7.6) 또는 호수에서 2 % tetramethlyrhodamine (산도 6)에 녹아있는 5-10%의 biotinamide로 microelectrode를 입력합니다. 전극 시험기와 전극 임피던스를 확인합니다. 대구경 axons에서 기록하려면 60 - 80M Ω의 임피던스와 전극을 작은 axons과 interneurons 80 - 150MΩ의 임피던스와 전극을하십시오.
- 전위계의 머리 단계에 microelectrode를 놓습니다. 동물의 머리 뒤에 위치에 고정되는 작은 망원경 (동봉 십자선과 함께 20X)을 통해 전극을 시각화. 이 전극은 stereotaxically 큰 정밀도로 위치를 수 있기 때문에 망원경을 사용하는 것이 중요합니다.
3. Electrophysiological 기록 및 세포 염색법
- 피아 메이터의 작은 오프닝을 만들고 전극은 머리를 닿을 때 피드백 신호가 생산되도록 커패시턴스 피드백을 받으려는. 이것은 두뇌의 표면의 정확한 위치를 수 있습니다.
- 반복 mandibular 변위를 생산 및 스테핑 모터의 두뇌에 전극 사전.
- DC 가능성에 갑자기 방울로의 연결을 impalements을 인식하고 지속적인 시냅스 활동에 의해 intrasomatic의 연결 impalements를 확인합니다. 커패시턴스의 overcompensation으로 전극을 윙윙하거나 거의 성공적인 세포 침투를 생산하지 도청. 때문에 전극의 높은 임피던스의의 연결 반응이 거의 침투하기 전에 관찰되지 않습니다.
- 당신이 신경을 찌르려고하고 침투가 안정 것으로 간주되면 램프 길게 및 사인 턱 운동을 사용하여의 연결 반응을 특징 5.지도 신경 세포의 수용 필드를 비 전도성 프로브로 머리 주위 피부와 내부 구강을 탐색하여 나무 막대기 등. 연구에 관련된 경우, 그러한 근육 수축 및 유해 자극과 같은 다른 기능 관련 자극에 신경 세포의 반응을 조사 6. 프라이 머리 도입 성의 nociceptive의 연결 수용체가 nociceptive 자극에 반응. 같은 pentobarbital 나트륨과 같은 일반적인 anesthesetics은 기본 수입 성의 뉴런에서 axonal 전도를 차단하는 것이 아니라 신경 전송을 우울하게하지 않습니다. 따라서 기본 수입 성의 축삭의 연결에 axonal 전도는 보존됩니다.
- 15 70nA 분 총 주입 시간 (DC, 1 4nA) 전류 주입. 현재 분사하는 동안 전극 침투를 모니터링하고 막 잠재력이 - 30mV보다 긍정 될 경우에는 중단.
4. 조직 처리
- (0.9 % NaCl 38 헹굼 혈관과 pentobarbital의 과다 복용 (140mg/kg IV)와 perfuse하여 동물을 안락사 ° C 헤파린 500 단위 및 1ml 2 % 포함하는 0.1M 인산 버퍼에 4 % paraformaldehyde (산도 7.4) 다음 xylocaine .
- 중 전두엽, 화살이나 수평면에 vibratome를 사용하여 50 100μm의 두뇌와 섹션을 제거합니다. Secions 25 ° C PBS에 부유를 수집하고 있습니다.
- 1-2% 정상 염소 혈청의 잠복기, 1 % 트리톤 0.01M PBS에 X - 100 아비딘 비오틴 단지에 부화 (1시 50분 엘리트 Vectastain) 다음으로 DAB를위한 두뇌를 처리합니다. H 2 O 2와 니켈 - DAB를 사용하여 섹션을 반응. 텍사스 레드, 4 박 PBS에 아비딘 - 비오틴 복합 (1시 50분)에 품어 섹션 ° C 후 4 ° C 하룻밤에 PBST에 4% 텍사스 레드 아비딘 DCS에서 품어.위한 처리 23 ° C.에 형광 Nissl 얼룩 (NeuroTrace) 20 분들과 섹션 Counterstain
- 신경 세포는 rhodamine로 주입 있었다면, 형광 현미경 (예 545nm)로 직접 주입 신경 세포를 시각화.
5. 역행 라벨, immunocytochemistry, 공촛점 이미징, 정량 colocalization 분석 방법을 결합
다른 방법이 기술을 결합의 성공은 좋은 상표 세포에 따라 크게 달라집니다.
- 방법은 쉽게 역행의 연결 라벨과 함께 조합하여 사용할 수 있습니다 여기에 시각. 이렇게하려면 70-10, 동물을 마취 및 무균 기술을 사용하여 이러한 양고추냉이 퍼옥시데이즈 (20 % 양고추냉이 퍼옥시데이즈. 시그마 VI, 시그마)으로의 연결을 추적기 삽입, 1 % 밀가루 - 세균은 턱 근육과 같은 말초 대상 지역으로 양고추냉이 퍼옥시데이즈 (시그마)를 aggultinated. 이것의 연결을 추적은 주변 axons로 최대 촬영 및 motoneuron의 somata에 axonal 수송을 통해 운반됩니다. 턱 근육 들어, 추적의 15μl는 살균 10 microliter의 microsyringe를 사용하여 근육에 주입합니다. 마취에서 회복 후 복구를 위해 자신의 새장에 배치까지 동물은 다음 가열 패드에 위치하고 모니터할 수 있습니다. 24 시간 후, 동물 마취 및 생리학 신경을 특징 및 intracellularly 그들을 얼룩. 다음 코발트와 안정기 및 심화로 chromagen 나트륨 tungstate로 tetramethylbenzidine (TMB)를 사용 HRP의 존재에 대한 이상 및 프로세스 조직 섹션에서 설명하는 것처럼 동물을 perfuse. 1 %의 나트륨에 넣어 섹션은 0.1M PBS (산도 6.5)와 15 절대 에탄올과 아세톤에 용해 0.0007 %의 TMB에 녹아있는 tungstate ° C 20 분. 그렇다면 0.3 % 60 분 부화 솔루션 100ml 당 H 2 O 2 1.0 ML를 추가하여 조직 섹션을 반응. 0.05 %의 diaminobenzidine (산도 7.4), 0.02 %의 코발트와 0.01 % H 2 10 분 0.1M PBS (산도 7.4)에서 O 2 0.1M PBS (산도 6.5)에 조직과 장소를 씻어. 37 ° C. 설명한대로 biotinamide로 주입 신경 세포의 시각화를위한 조직을 처리하고 표시된 감각 뉴런과 motoneurons 다양한 사이의 관계를 시각화.
- 여기에 표시된 기술도 쉽게 immnocytochemistry와 함께하실 수 있습니다. 6 예를 들어, immunocytochemically 정확하게 표시 뉴런 사이 시냅스 (그림 3) 찾을 수 synaptophysin에 대한 두뇌를 처리합니다. 이렇게하려면 4 이일 ° C 그리고 23 1H에 대한 안티 마우스 FITC (1:400)에서 품어 ° C.에 대한 마우스 방지 synaptophysin 항체 (1:10,000)에서 뇌 부분을 품어
- 형광 마커로 표시하거나 형광 이미징을위한 처리 뉴런은 공촛점 이미징에 이상적입니다. 그림 3은 축삭의 부통 통해 공촛점 현미경과 취득 광학 섹션의 예입니다. (그림 3). 라벨 신경 세포 (그림 4)를 통해 여러 광학 부분을 인수하여 분류 뉴런의 애니메이션을 생성할 수 있습니다.
- 이 방법으로 표시 뉴런은 양적 colocalization 분석에 사용할 수 있습니다. 이렇게하려면 (http://phy.ucsf.edu/ ° IDL / colocalization.htm에서 확인) NIH 이미지와 함께 공개 소프트웨어 매크로를 사용합니다. synaptophysin의 immunocytochemistry와 세포내 상표를 결합하여 단일 축삭 터미널 내에서 synaptophysin을 집중하다 6.
6. 대표 결과 :
이 방법을 사용하여 얻을 수있는 대표적인 결과의 개요는 그림 1에서 그림입니다. 이것은 하나의 brainstem 신경이 electrophysiologically 분명히 볼 수 있듯이, mandible 운동 기간 동안 기록되었다,이 신경 세포의 반응 (그림 1 왼쪽, 하늘색 하단)은 운동 중에 변조되었습니다. 이 신경 세포는 electrophysiological 특성 후 biotinamide와 함께 주입하고 이후 시각화에 대한 처리되었습니다. 재건축 신경 세포 (그림 1 중간, 녹색)가 실제 수해부 획기적인 테드,이 경우에는 삼차 모터 핵은 (빨간색 테두리) 지정. 움직임과 재건축 기간 동안의 연결에 따라 응답이 신경 세포는 보조 근육 스핀들 수입 성의 신경 세포로 확인할 수 있습니다. 그림 2 조 변위 동안 신경 세포의 생리적 반응의 대표적인 예를 보여줍니다. 신경 세포의 반응은 즉각적인 발사 주파수로 표현된다. 의 연결 응답이 밀접하게이 특정 신경 세포가 mandibular 위치에 관한 감각 피드백을 제공 나타내는 mandibular 변위를 모방 것을. 그림 3 참고 synaptophysin에 대한 얼룩과 Nissl은 얼룩과 함께 intracellularly 스테인드 축삭의 높은 배율 이미지입니다. 축삭 부통 이내 synaptophysin (노란색)의 colocalization을 확인합니다. 그림 4는 단일 생리학 특징 및 intracellularly 레이블 신경 세포의 애니메이션입니다.
그림 1. 방법의 개요. 왼쪽 상단 : mandibular 변위. 하나의 신경 (노란색)에서 중간 세포 녹화 (녹색). 이 신경 세포의 형태는 세포 기록하고 주사 후 복원되었다. 레드 개요 삼차 모터 핵의 위치를 나타냅니다. 왼쪽 하단 : 턱 운동 중에이 신경 세포의 생리 반응합니다.
그림 2. mandible 운동하는 동안 생체내에 기록된 하나의 근육 감각 신경 세포의 생리 반응 대표. 턱 변위로의 연결 응답의 유사성을 확인합니다.
그림 3. 탐색 근육 동안 응답 intracellularly 묻은 감각 신경 세포의 시냅스 부튼스 (적색 swellings)와 터미널 axonal arborization. synaptophysin에 대한 후속 immunocytochemical 처리 axonal 부통 (노란색) 이내 synaptophysin의 지방화를 보여줍니다. 녹색 형광 Nissl가 얼룩이다.
그림 4. 생리 반응 mandibular 운동 중에 생체내에 기록된 근육 스핀들 주 수입 성의 신경 세포의 축삭의 애니메이션은 축삭은 다음 intracellularly 스테인드 및 가시화를위한 처리되었습니다.
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Discussion
여기에 그림이 메서드는 단일 뉴런의 기능에 중요한 통찰력을 제공하는 방법과 각각의 뉴런의 반응의 연결 회로에 기여하는 강력한 기법입니다. 아홉이 지식은 sensorimotor 기능을 이해하는 데 필수적입니다. 이 기법의 가장 큰 장점은 생리학, 형태학 및 신경 형태학 및 배포를 포함한 신경 세포에 대한 매개 변수의 다수의 결정을 허용된다는 점입니다. 이 방법의 예 등의 연결 회로로 후퇴의 연결 레이블 추가 정보와 같은 다른 기술과 결합되면 것은 특색 수 있습니다. 7,8 또 다른 장점은이 단계에서 배운 수있다는 것입니다. 예를 들어, 세포 녹음 immunocytochemistry 또는 초기 방법의 숙달 후 추가 역행의 연결 라벨과 세포내 얼룩 다음, 처음 실시 수 있습니다. 아마도 기술의 가장 큰 한계는 뉴런의 단지 소수가 한 실험에 표시 될 수있다는 것입니다. 일반적으로 특정 생리적 유형의 2-3 뉴런들은 처음에 표시됩니다. 생리와 형태 사이의 잠재적인 관계가 공식화되면, 추가 실험은 신중하게 단 하나의 뉴런이 표시되는 실험이 관계를 확인하는 데 사용됩니다.
이 방법의 성공을 위해 가장 중요한 단계는 electrophysiological 세포내 기록 안정성을 유지합니다. 레코딩 안정성 연구에서 신경 세포의 두뇌 속에 위치하지만, 조작의 수를 기록 안정성을 향상하는 데 사용할 수에 따라 크게 달라집니다. pneumothorax이 수행과 동물은 인공적으로 호흡 pulsations을 줄이기 위해 환기 수 있습니다. 안정성에 대한 1cm H 2 O.의 긍정적인 끝에 날숨 압력을 적용하여 더욱 증가시킬 수 있습니다 두뇌 속에 관심의 영역에 도달하면 안정성이 호흡 볼륨을 감소하고 호흡 속도를 증가시켜 호흡 동물에 의해 향상된 수 있습니다. 일부 electrophysiological 연구는 두뇌를 통해 따뜻한 한천을 적용하고 방광을 cannulated 가지고, 이러한 절차는 brainstem의 녹화의 연결의 안정성을 증가 효과되지 않았습니다. 주입 시간이 오래 필요가 전혀 없다는 것을 지적하는 것이 중요합니다. 좋은 결과는 약 5 분 분사 시간을 얻을 수 있습니다. microelectrodes의 작은 팁 크기로 인해 뇌 안에 전극의 파손은 일반적으로 추적 많은 자료를 생산하지 않습니다. 따라서 전극 대체할 수 있으며, 뉴런이 성공적으로 기록 전극 파손의 위치의 수백 미크론 이내에 얼룩. 전극이 막혔어요 또는 녹음 솔루션은 적절하게 전극의 끝부분을 기입하지 않는 경우, 노이즈가 크게 증가되고 전극 교체해야합니다. 두뇌에 이전에 삽입하는 전극 임피던스 테스트하면 크게 비생산적인 전극 책자를 줄이고 시간을 절약할 수 있습니다. 당신은 두뇌 stereotaxic의 위치의 작은 지역에서 기록하려는 경우 최우선입니다. 나는 고정 stereotaxic 제로를 유지하는 기록 테이블에 부착된 망원경을 사용합니다. 전극이 기록 테이블에 연결된 후 확대에 따라 많이 전극 홀더에 놓을 수 있기 때문에 망원경은 매우 유용합니다. 이것은 대체 전극의 microelectrode 및 따르면 매우 정확한 위치를 수 있습니다.
최근 연구의 수가 juxtacellular의 연결 레이블을 사용합니다. 전극이의 연결을 기록하고의 연결을 추적의 특성에 따라 신경 세포에 근접 배치됩니다이 방법 11,12가 나옵니다. 추적기는 전극의 주변에있는 다른 뉴런의 dendrites과 axons에 통합될 수 있기 때문에이 방법으로 확실한 잠재적인 문제는 가짜 상표입니다. extracellularly 기록 작업 잠재력이뿐만 아니라 신경 세포에 시냅스 입력하여 있지만, 신경 세포의 본질적인 속성에 의해 생성된 수 있기 때문에뿐만 아니라, 신경 세포의 입력 - 출력 관계는 결정 수 없습니다. 방법은 여기를보고있는 microelectrode가 신경 세포 내에서 실제로하기 때문에 스테인드 신경 세포로의 연결 활동의 속성에 관한 아무런 모호함이없는 반면, 뉴런에만 표시됩니다. axons을 분류 때 특히 중요합니다 가짜 상표 몇 미크론 결과에 의해 microelectrode의 움직임 때문이다. 또한, 시냅스 후보를 포함한 subthreshold 이벤트는 찔려 죽은 신경 세포에서 기록하실 수 있습니다.
미래 연구는 evoked 움직임이 방법을 결합 수 있습니다. 예를 들어 피질 자극이 evoked 움직임 동안 뉴런의 세포 기록과 얼룩을 허용해야 brainstem 내에서 masticatory 움직임 및 기록 안정성을 보여주고 있습니다. 이 기술은 최소한의 수술의 개입과 함께 할 수 있기 때문에, 그것은 또한 포스 수 있습니다생체내의 유전자 발현을 변경 물질을 주입하기 위해이 방법을 사용하는 관계 였는데.
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Disclosures
동물 실험 (1985 개정 NIH 출판 번호 86-23) 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 설명서에 명시된 guidlines 및 규정에 따라와 메릴랜드 애니멀 케어 대학에서 수행하고위원회를 사용했다.
Acknowledgments
나는 생체내 세포 기록하고 세포내 얼룩 기술의 초기 개발에 도움을 브라운과 데이비드 맥스웰의 초기 교육 앤서니 테일러 감사합니다. 나는 collocalization 매크로에 대한 도움말 M. 실버 주셔서 감사합니다. 많은 학자 누구와 나는 R. 동아, M. 모리 타니, P. 루오, R. Ambalavanar를 포함하여이 기술의 개발에 대한 통찰력을 제공하는 협력 있습니다. 이 기술은 NIH 보조금 DE10132, DE15386 및 RR017971에서 상당한 지원 개발되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| electromagnetic vibrator | Ling Dynamic Systems | V101 | |
| signal generator | Feedback Systems | PFG605 | capable of producing trapezoidal output signal |
| electrode glass | Sutter Instrument Co. | AF100-68-10 | with filament |
| electrode puller | Sutter Instrument Co. | Model P-2000 or P-80 | |
| biotinamide | Vector Laboratories | SP-1120 | stored at 4°C |
| Texas Red avidin DCS | Vector Laboratories | A-2016 | |
| tetramethlyrhodamine | Molecular Probes, Life Technologies | D-3308 | 3000 molecular weight, lysine fixable |
| mouse anti-synaptophysin antibody | Chemicon International | MAB5258 | |
| fluorescent Nissl stain | Neurotrace, Life Technologies | N-21480 | |
| electrode tester | Winston Electronics | BL-1000-B | to measure electrode impedance |
| electrometer | Axon Instruments | Axoprobe 1A, Axoclamp 2B |
References
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