Summary
Una técnica es descrita para cuantificar la respuesta in vivo fisiológicas de las neuronas de mamíferos durante el movimiento y correlacionar la fisiología de las neuronas con morfología neuronal, fenotipo neuroquímicos y microcircuitos sináptica.
Abstract
El papel de las neuronas individuales y su función en los circuitos neuronales es fundamental para comprender los mecanismos neuronales de las funciones motoras y sensoriales. La mayoría de las investigaciones de los mecanismos sensoriomotores se basan en el examen de cualquiera de las neuronas, mientras que un animal es de 1,2 estática o grabar la actividad neuronal extracelular durante un movimiento de 3,4. Aunque estos estudios han proporcionado la base fundamental para la función sensorio, o bien no evaluar la información funcional que se produce durante un movimiento o están limitados en su capacidad para caracterizar el fenotipo de la anatomía, la fisiología y la neuroquímica de las neuronas. Una técnica se muestra aquí, que permite una amplia caracterización de las neuronas individuales en un movimiento en vivo. Esta técnica puede ser utilizada no sólo para estudiar las neuronas aferentes primarias, sino también para caracterizar a las motoneuronas y las interneuronas sensorio. Inicialmente la respuesta de una sola neurona se registra utilizando métodos electrofisiológicos en los diversos movimientos de la mandíbula, seguida por la determinación del campo receptivo de la neurona. Un trazador neuronal luego se inyecta en forma intracelular de la neurona y el cerebro se procesa para que la neurona se puede visualizar con microscopía de luz, de electrones o confocal (Fig. 1). La morfología detallada de la neurona se caracteriza se reconstruye de modo que la morfología neuronal se puede correlacionar con la respuesta fisiológica de la neurona (Figs. 2,3). En esta comunicación los detalles importantes claves y consejos para la implementación exitosa de esta técnica se proporcionan. Una valiosa información adicional puede ser determinada por la neurona en estudio mediante la combinación de este método con otras técnicas. Etiquetado neuronal retrógrada puede ser usado para determinar las neuronas con las que la sinapsis de neuronas marcadas, lo que permite la determinación detallada de los circuitos neuronales. Inmunocitoquímica se puede combinar con este método para examinar los neurotransmisores dentro de la neurona y la etiqueta para determinar los fenotipos químicos de las neuronas con las que la etiqueta sinapsis neuronal. La neurona etiqueta también puede ser procesado para microscopía electrónica para determinar las características ultraestructurales y microcircuitos de las neuronas etiquetados. En general, esta técnica es un poderoso método para caracterizar completamente las neuronas durante el movimiento en vivo lo que permite visión precisa del papel de la neurona en funciones sensoriales y motrices.
Protocol
1. Preparación de los animales
- Anestesiar a ratas con pentobarbital sódico (50mg/kg IP) y colocarlo en una manta eléctrica. Afeitarse la piel que recubre el cráneo posterior con máquinas de cortar el animal. Comprobar que el animal para asegurar que un nivel quirúrgico de nivel de anestesia que se haya obtenido mediante la prueba de la ausencia de un reflejo de retirada y vocalización cuando los dedos queden atrapados, así como la ausencia de reflejo palpebral. Comprobar el nivel de anestesia cada 15 minutos y mantener un nivel quirúrgico de anesthetisa por medio de inyecciones de 15mg/kg de pentobarbital de sodio cada 45 minutos.
- Utilice una técnica aséptica y hacer una incisión en la región inguinal, inmediatamente distal al pliegue formado por el abdomen y la cara interna del muslo y la inserción de una cánula (1mm de diámetro, Clay Adams) en la vena femoral y arteria femoral. Hacer una incisión en la región submandibular, reflejan los músculos infrahioideos. Haga una pequeña incisión en la tráquea e insertar una cánula (2 mm de diámetro) para permitir la ventilación. Tye una sutura alrededor del trachael cannual para asegurarlo en place.Monitor la presión arterial sistémica sistólica y diastólica, a través de la cánula arterial. Además de supervisar la retirada y el reflejo palpebral ahora monitor de presión arterial para evaluar el nivel de anestesia. Administrar anestesia adicional cuando sea necesario a través de la cánula venosa.
- Lugar a la rata en un marco estereotáxico y realizar una craneotomía para exponer el cerebelo. Conecte la cánula traqueal a un ventilador de roedores. Ventilar al animal con un volumen de 2 cm 3 a una velocidad de 100/min con aire húmedo. Una presión positiva al final de la espiración de 1 cm H 2 O se debe mantener para evitar el colapso pulmonar. Cada 15 minutos hyperinflate los pulmones para prevenir la atelectasia. Luego, cubra la superficie del cerebro con aceite mineral caliente (30 ° C). Tenga cuidado de evitar el gran seno venoso situado directamente debajo de la unión entre los huesos parietal y interparietal.
- Aplique el pegamento de cianoacrilato a una barra junto a un vibrador electromagnético y adjuntar la barra en el diastema de la mandíbula. Mover la mandíbula con señales de comando para el vibrador, ya sea una salida A / D o equipo generador de señal.
- Coloque un electrodo de cloruro de plata siliver tierra debajo de la piel adyacente a la craneotomía.
2. Preparación de electrodos
- Fabricar microelectrodos de vidrio de cuarzo o aluminosilicato con un extractor de microelectrodos horizontal.
- Rellene el microelectrodo con biotinamide 5-10% disuelto en 0,25 M KCl y 0,5 M tampón Tris-HCl (pH 7,6) o el 2% tetramethlyrhodamine en solución salina (pH 6). Compruebe la impedancia del electrodo con un probador de los electrodos. Para grabar desde los axones de gran diámetro que los electrodos con una impedancia de 60 Ω de 80 millones, de los axones y pequeñas interneuronas hacer los electrodos con una impedancia de 80 150MΩ.
- Coloque el microelectrodo en la etapa de la cabeza del electrómetro. Visualizar el electrodo a través de un telescopio pequeño (20 veces con una retícula cerrada) que se fija en la posición detrás de la cabeza del animal. Usando el telescopio es importante porque permite a los electrodos que se stereotaxically posición con gran precisión.
3. Registro electrofisiológico y tinción intracelular
- Hacer una pequeña abertura en la piamadre y compensar en exceso la capacidad de retroalimentación de manera que cuando el electrodo toca el cerebro una señal de retroalimentación se produce. Esto permite la localización precisa de la superficie del cerebro.
- Producen repetidos desplazamientos mandibulares y avanzar en el electrodo en el cerebro con un motor paso a paso.
- Reconocer impalements neuronal de descensos en el potencial DC e identificar intrasomatic impalements por la actividad sináptica neuronal en curso. Zumbando el electrodo con una compensación excesiva de la capacidad o tocando rara vez producen una penetración celular de éxito. Debido a la alta impedancia de los electrodos, las respuestas neuronales son raramente observadas antes de la penetración.
- Después de atravesar una neurona y la penetración se considera estable, caracterizar la respuesta neuronal utilizando la rampa, tenencia y movimiento de la mandíbula sinusoidal. 5 Mapa del campo receptivo de la neurona mediante el sondeo de la piel alrededor de la cabeza y la cavidad oral dentro de una sonda no conductores como un palo de madera. Si es relevante para el estudio, examinar la respuesta de la neurona a otros estímulos funcionalmente relevantes como la contracción muscular y los estímulos nocivos. 6 aferentes primarias nociceptivas receptores neuronales para responder a los estímulos nociceptivos. Anesthesetics generales, tales como el pentobarbital sódico no bloquean la conducción axonal en las neuronas aferentes primarias, sino que deprime la transmisión sináptica. Por lo tanto la conducción axonal en el axón neuronal aferente primaria se conserva.
- Inyectar corriente continua (CC, 1-4NA) para un tiempo de inyección total de 15 70nA minutos. Monitor de la penetración del electrodo durante la inyección de corriente y suspender si el potencial de membrana se vuelve más positivo que-30mV.
4. Procesamiento de tejidos
- La eutanasia de los animales mediante una sobredosis de pentobarbital (140mg/kg IV) y perfusión vascular con un enjuague (0,9% NaCl 38 ° C que contiene 500 unidades de heparina y 2% 1ml xilocaína seguido de un 4% de paraformaldehído en tampón fosfato 0,1 M (pH 7,4) .
- Quitar el cerebro y en la sección que el 50-100μm con un vibratome, ya sea en el plano frontal, sagital u horizontal. Secions se recogen flotando libre en PBS 25 ° C.
- Proceso en el cerebro para DAB mediante la incubación de suero de cabra normal de 1-2% y 1% de Triton X-100 en PBS 0,01 M seguido de incubación en avidina biotina (1:50 Elite Vectastain). Reaccionar con secciones de níquel-DAB con H 2 O 2. Para el proceso de Texas Red, las secciones se incuban en complejo avidina-biotina (1:50) en PBS durante una noche a 4 ° C y luego se incuban en Texas el 4% DCS Red avidina en PBST a 4 ° C durante la noche. Contratinción secciones con un fluorescente Nissl mancha (NeuroTrace) 20 minutos a 23 ° C.
- Si las neuronas se inyectó con rodamina, visualizar la neurona se inyecta directamente con un microscopio de fluorescencia (Ex 545nm).
5. La combinación de método con el etiquetado retrógrada, la inmunocitoquímica, la imagen confocal, análisis cuantitativo de colocalización
El éxito de combinar esta técnica con otros métodos depende en gran medida el etiquetado intracelular buena.
- El método de visualizar aquí se puede combinar fácilmente con el etiquetado neuronal retrógrada. 7-10 Para ello, anestesiar al animal y utilizando una técnica aséptica, se inyecta un trazador neuronal como la peroxidasa de rábano picante (20% peroxidasa de rábano picante. VI Sigma, Sigma) y el 1% de germen de trigo aggultinated peroxidasa de rábano (Sigma) en las regiones objetivo periféricos como el músculo masetero. Este marcador neuronal se abordará en los axones periféricos y se transporta a través del transporte axonal de la motoneurona cuerpos celulares. Para el músculo masetero, 15μl de trazador se inyecta en el músculo con una microjeringa estéril de 10 microlitros. Los animales se colocan en un cojín de calefacción y control hasta que se recupere de la anestesia y luego se colocan en las jaulas de recuperación. Después de 24 horas, anestesiar a los animales y fisiológicamente caracterizan las neuronas y intracelularmente a las manchas. Luego perfundir el animal como se describió anteriormente y secciones proceso de tejido para detectar la presencia de HRP con tetrametilbenzidina (TMB) como cromógeno y tungstato sódico como el estabilizador y se intensificó con el cobalto. Se colocan en el 1% tungstato sódico disuelto en PBS 0,1 M (pH 6,5) y 0,0007% TMB disuelto en etanol absoluto y acetona a 15 ° C durante 20 min. Entonces reaccionan las secciones de tejido mediante la adición de 1,0 ml de 0,3% de H 2 O 2 por cada 100 ml de solución de incubación durante 60 minutos. Enjuague el tejido en PBS 0,1 M (pH 6,5) y el lugar en el 0,05% diaminobencidina (pH 7,4), el 0,02% de cobalto, y el 0,01% H 2 O 2 en PBS 0,1 M (pH 7,4) durante 10 minutos. a 37 ° C. Proceso de tejido para la visualización de la neurona inyectados con biotinamide como se describe y visualizar las relaciones entre la neurona sensorial y la etiqueta de una variedad de las motoneuronas.
- La técnica se muestra aquí también pueden ser fácilmente combinados con immnocytochemistry. 6 A modo de ejemplo, immunocytochemically proceso del cerebro para sinaptofisina para localizar con precisión las sinapsis en las neuronas marcadas (Fig. 3). Para ello, se incuban las secciones del cerebro de ratón anti-sinaptofisina anticuerpos (1:10.000) por 2 días a 4 ° C y luego se incuban en anti-ratón FITC (1:400) durante 1 hora a 23 ° C.
- Neuronas marcadas con marcadores fluorescentes o tratados con imágenes fluorescentes son ideales para la visualización de imagen confocal. La Figura 3 es un ejemplo de una sección óptica obtenida con microscopía confocal a través de un axón Bouton. (Fig. 3). Generar animaciones de neuronas marcadas por la adquisición de varias secciones ópticas a través de la neurona marcada (Fig. 4).
- Neuronas marcadas con este método se puede utilizar para el análisis cuantitativo de colocalización. Para ello, utilice una macro de software a disposición del público en relación con NIH Image (que se encuentra en http://phy.ucsf.edu/ ° idl / colocalization.htm). Localizar sinaptofisina en terminales de los axones individuales mediante la combinación de etiquetado intracelular con inmunocitoquímica sinaptofisina 6.
6. Los resultados representativos:
Un resumen de los resultados representativos que se pueden obtener con este método se ilustra en la Figura 1. Esta sola neurona cerebral se registró electrofisiológico durante el movimiento de la mandíbula y, como se puede ver claramente, la respuesta de esta neurona (Figura 1 abajo a la izquierda, la luz azul) fue modulada durante el movimiento. Esta neurona se le inyectó después biotinamide caracterización electrofisiológica y posteriormente procesadas para su visualización. La neurona reconstruida (Figura 1 medio, verde) puede ser realted a un punto de referencia anatómica, en este caso el núcleo motor del trigémino designado (línea roja). Sobre la base de la respuesta neuronal durante el movimiento y la reconstrucción esta neurona puede ser identificado como una neurona aferente del huso muscular secundaria. La figura 2 muestra un ejemplo representativo de la respuesta fisiológica de la neurona durante el desplazamiento mandibular. La respuesta de la neurona se representa como frecuencia de disparo instantáneo. Tenga en cuenta que la respuesta neuronal imita el desplazamiento mandibular que indica que esta neurona en particular proporciona retroalimentación sensorial relacionada con la posición mandibular. Figura 3 es una imagen de gran aumento de un axón intracelularmente manchadas combinado con tinción para sinaptofisina y una mancha de Nissl. Tenga en cuenta la colocalización de sinaptofisina (amarillo) en el bouton axón. Figura 4 es una animación de una sola neurona, fisiológicamente caracterizan y etiquetado intracelular.
Figura 1. Descripción del método. Arriba a la izquierda: el desplazamiento mandibular. Grabación de media intracelular (verde) de una sola neurona (amarillo). La morfología de esta neurona se reconstruyó después de la grabación intracelular y la inyección. Contorno de color rojo indica la ubicación del núcleo motor del trigémino. Abajo a la izquierda: la respuesta fisiológica de esta neurona durante el movimiento de la mandíbula.
Figura 2. Respuesta fisiológica Representante de una neurona sensorial solo músculo grabado en vivo durante el movimiento de la mandíbula. Tenga en cuenta la similitud de la respuesta neuronal de los desplazamientos mandíbula.
Figura 3. Arborización terminal axonal con botones sinápticos (hinchazón de color rojo) de una neurona sensorial intracelularmente manchadas de que respondió en los músculos de sondeo. Posterior tratamiento inmuno sinaptofisina muestra la localización de sinaptofisina en el bouton axonal (amarillo). El verde es un Nissl tinción fluorescente.
Figura 4. Animación del huso muscular primaria axón neurona aferente cuya respuesta fisiológica fue grabado en vivo durante los movimientos mandibulares, el axón entonces intracelularmente manchadas y procesados para su visualización.
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Discussion
El método se ilustra aquí es una poderosa técnica que aporta datos importantes en la función de neuronas individuales y cómo la respuesta de las neuronas individuales contribuye a los circuitos neuronales. 9 Este conocimiento es fundamental para entender la función sensorio. La mayor fortaleza de esta técnica es que permite la determinación de un gran número de parámetros de una neurona como la fisiología, la morfología y la morfología sináptica y la distribución. Cuando se combina con otras técnicas como la información neuronal retrógrada etiquetado adicionales, tales como circuitos neuronales puede ser caracterizado. 7,8 Otra ventaja de este método es que puede ser aprendido en los pasos. Por ejemplo, el registro intracelular puede llevarse a cabo inicialmente, seguido por la tinción intracelular con inmunocitoquímica o etiquetado neuronal retrógrada añadió después el dominio del método inicial. Tal vez la mayor limitación de esta técnica es que sólo un pequeño número de neuronas puede ser etiquetado de cualquier experimento. Típicamente de dos a tres neuronas de un tipo fisiológico particular, inicialmente marcados. Una vez que la posible relación entre la fisiología y la morfología se formula, experimentos adicionales se utilizan para verificar cuidadosamente esta relación en experimentos en los que se etiqueta sólo una única neurona.
El paso más importante para el éxito de este método es mantener la estabilidad electrofisiológicos registro intracelular. La estabilidad de grabación variará mucho dependiendo de la ubicación dentro del cerebro de la neurona en estudio, pero una serie de manipulaciones se puede utilizar para aumentar la estabilidad de grabación. Un neumotórax se pueden realizar y el animal un respirador artificial para reducir las pulsaciones respiratorias. La estabilidad se puede aumentar aún más mediante la aplicación de una presión positiva al final de la espiración de aproximadamente 1 cm H 2 O. Cuando la región de interés en el cerebro se alcanza la estabilidad puede ser mejorada por la hiperventilación del animal por la disminución del volumen respiratorio y el aumento de la frecuencia respiratoria. Algunos estudios electrofisiológicos han aplicado agar caliente sobre el cerebro y la cánula de la vejiga, estos procedimientos no han sido eficaces en el aumento de la estabilidad de la grabación de neuronas en el tronco del encéfalo. Es importante señalar que los tiempos de inyección no tiene que ser largo. Los buenos resultados se pueden obtener con los tiempos de inyección de alrededor de 5 minutos. Debido al tamaño pequeño consejo de los microelectrodos, la rotura de los electrodos en el cerebro por lo general no produce una gran liberación de trazadores. Por lo tanto, el electrodo puede ser sustituido y las neuronas registrado con éxito y se tiñen en varios cientos de micrones de la localización de la rotura del electrodo. Si el electrodo está obstruido o la solución de grabación no se llene la punta del electrodo de forma adecuada, el ruido será mucho mayor y el electrodo debe ser reemplazado. Prueba de impedancia del electrodo antes de la inserción en el cerebro reduce extensiones improductivas electrodo y ahorra tiempo. Si usted está tratando de grabar en una pequeña región de la colocación estereotáxica cerebral es fundamental. Puedo usar un telescopio conectado a la mesa de grabación para mantener un cero estereotáxica fijo. El telescopio es muy útil porque el electrodo puede ser colocado en el soporte de electrodos conectados a la mesa de grabación y luego se observan bajo la lupa. Esto permite una colocación muy precisa de los microelectrodos y puesta a cero de los electrodos de reemplazo.
Una serie de estudios recientes han utilizado el etiquetado neuronal juxtacellular 11,12. Con este método se coloca un electrodo en la proximidad de una neurona basándose en las características de la grabación neuronal y un marcador neuronal es expulsado. Un problema obvio potencial de este método es falsa ya que el etiquetado del trazador se pueden incorporar en las dendritas y los axones de otras neuronas en la vecindad del electrodo. Además, relaciones insumo-producto de la neurona no se puede determinar por medio extracelular registró los potenciales de acción se pueden generar no sólo por la entrada sináptica a la neurona, sino por las propiedades intrínsecas de las neuronas. Con el método que aquí, las neuronas son sólo la etiqueta, mientras que el microelectrodo es en realidad dentro de la neurona y por lo tanto no hay ninguna ambigüedad en cuanto a la atribución de la actividad neuronal de la neurona de colores. Esto es particularmente importante cuando el etiquetado axones porque el movimiento de los microelectrodos por resultados unas pocas micras en el etiquetado falsos. Además, los eventos subumbral incluyendo potenciales sinápticos se pueden grabar de la neurona empalado.
Estudios futuros podrían combinar este método con los movimientos evocados. Por ejemplo, la estimulación cortical puede evocar los movimientos masticatorios y la estabilidad de grabación en el tronco del encéfalo debe permitir el registro intracelular y la tinción de las neuronas durante estos movimientos evocados. Dado que esta técnica se puede hacer con un mínimo de intervención quirúrgica, sino que también puede ser possible para utilizar este método para inyectar sustancias que alteran la expresión de genes in vivo.
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Disclosures
Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las guias y la regulación se establece en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (NIH Publicación N º 86-23, revisado en 1985) y la Universidad de Maryland Cuidado de los Animales y el empleo Comisión.
Acknowledgments
Doy las gracias a Anthony Taylor para la formación inicial en la grabación en vivo intracelular y un Maxwell y David Brown para ayudar con el desarrollo inicial de la técnica de tinción intracelular. Doy las gracias a M. de plata en busca de ayuda con el macro collocalization. Muchos estudiosos con los que he colaborado siempre en perspectiva el desarrollo de esta técnica como R. Donga, Moritani M., Luo P., R. Ambalavanar. Esta técnica fue desarrollada con un apoyo considerable de las subvenciones del NIH DE10132, DE15386 y RR017971.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| electromagnetic vibrator | Ling Dynamic Systems | V101 | |
| signal generator | Feedback Systems | PFG605 | capable of producing trapezoidal output signal |
| electrode glass | Sutter Instrument Co. | AF100-68-10 | with filament |
| electrode puller | Sutter Instrument Co. | Model P-2000 or P-80 | |
| biotinamide | Vector Laboratories | SP-1120 | stored at 4°C |
| Texas Red avidin DCS | Vector Laboratories | A-2016 | |
| tetramethlyrhodamine | Molecular Probes, Life Technologies | D-3308 | 3000 molecular weight, lysine fixable |
| mouse anti-synaptophysin antibody | Chemicon International | MAB5258 | |
| fluorescent Nissl stain | Neurotrace, Life Technologies | N-21480 | |
| electrode tester | Winston Electronics | BL-1000-B | to measure electrode impedance |
| electrometer | Axon Instruments | Axoprobe 1A, Axoclamp 2B |
References
- Cuellar, C. A., Tapia, J. A., Juarez, V., Quevedo, J., Linares, P., Marinez, L., Manjarrez, E. Propagation of sinusoidal electrical waves along the spinal cord during a fictive motor task. J. Neurosci. 29, 798-810 (2010).
- Frigon, A., Gossard, J. Evidence for specialized rhythm-generating mechanisms in the adult mammalian spinal cord. J. Neurosci. 30, 7061-7071 (2010).
- Wang, W., Chan, S. S., Heldman, D. A., Moran, D. W. Motor cortical representation of hand translation and rotation during reaching. J. Neurosci. 30, 958-962 (2010).
- Ma, C., He, J. A method for investigating cortical control of stand and squat in conscious behavioral monkeys. J. Neurosci. Meth. 192, 1-6 (2010).
- Dessem, D., Donga, R., Luo, P. Primary- and secondary-like jaw-muscle spindle afferents have characteristic topographic distributions. J. Neurophysiol. 77, 2925-2944 (1997).
- Dessem, D., Moritaini, A., Ambalavanar, R. Nociceptive craniofacial muscle primary afferent neurons synapse in both the rostral and caudal brain stem. J. Neurophysiol. 98, 214-223 (2007).
- Luo, P., Dessem, D. Inputs from identified jaw-muscle spindle afferents to trigeminothalamic neurons in the rat: a double-labeling study using retrograde HRP and intracellular. J. Comp. Neurol. 353, 50-66 (1995).
- Dessem, D., Luo, P. Jaw-muscle spindle afferent feedback to the cervical spinal cord in the rat. J. Comp. Neurol. 128, 451-459 (1999).
- Luo, P., Wong, R., Dessem, D. Projection of jaw-muscle spindle afferents to the caudal brainstem in rats demonstrated using intracellular biotinamide. J. Comp. Neurol. 358, 63-78 (1995).
- Luo, P., Dessem, D. Ultrastructural anatomy of physiologically identified jaw-muscle spindle afferent terminations onto retrogradely labeled jaw-elevator motoneurons in the rat. J. Comp. Neurol. 406, 384-401 (1999).
- Hassani, O. K., Henny, P., Lee, M. G., Jones, B. E. GABAergic neurons intermingled with orexin and MCH neurons in the lateral hypothalamus discharge maximally during sleep. Eur. J. Neurosci. 32, 448-457 (2010).
- Inokawa, H., Yamada, H., Matsumoto, N., Muranishi, M., Kimura, M. Juxtacellular labeling of tonically active neurons and phasically active neurons in the rat striatum. Neuroscience. 168, 395-404 (2010).
