Summary
Una tecnica è descritta per quantificare in vivo la risposta fisiologica dei neuroni dei mammiferi durante il movimento e correlare la fisiologia del neurone con morfologia neuronale, fenotipo neurochimico e microcircuiti sinaptici.
Abstract
Il ruolo dei singoli neuroni e la loro funzione nei circuiti neuronali è fondamentale per capire i meccanismi neuronali delle funzioni sensoriali e motorie. Maggior parte delle indagini di meccanismi sensomotori avvalersi né esame di neuroni, mentre un animale è 1,2 statico o registrare l'attività neuronale extracellulare durante un movimento. 3,4 Anche se questi studi hanno fornito lo sfondo fondamentale per la funzione sensomotoria, che o non valutare le informazioni funzionali che si verifica durante un movimento o sono limitate nella loro capacità di caratterizzare completamente il fenotipo anatomia, fisiologia e neurochimici del neurone. Una tecnica è qui che permette la caratterizzazione completa di singoli neuroni nel corso di un movimento vivo. Questa tecnica può essere utilizzata non solo per studiare i neuroni afferenti primari, ma anche per caratterizzare motoneuroni e interneuroni sensomotorie. Inizialmente la risposta di un singolo neurone viene registrata con metodi elettrofisiologici durante vari movimenti della mandibola seguita dalla determinazione del campo recettivo per il neurone. Un tracciante neuronale viene poi iniettata livello intracellulare nel neurone e il cervello viene elaborata in modo che i neuroni possono essere visualizzati con la microscopia ottica, elettronica e confocale (Fig. 1). La morfologia dettagliata del neurone è caratterizzata poi ricostruita in modo che la morfologia neuronale può essere correlato con la risposta fisiologica del neurone (Fig. 2,3). In questa comunicazione dei dettagli delle chiavi importanti e suggerimenti per il successo di questa tecnica sono forniti. Preziose informazioni aggiuntive possono essere determinate per il neurone in fase di studio, combinando questo metodo con altre tecniche. Retrograda etichettatura neuronale può essere usato per determinare i neuroni con cui le sinapsi dei neuroni etichettati; permettendo così la determinazione dettagliata dei circuiti neuronali. Immunocitochimica può essere combinato con questo metodo per esaminare neurotrasmettitori all'interno del neurone etichettati e per determinare i fenotipi chimica dei neuroni con cui le sinapsi dei neuroni etichettati. Il neurone marcata può essere effettuato anche per la microscopia elettronica per determinare le caratteristiche ultrastrutturali e microcircuiti del neurone etichettati. In generale questa tecnica è un potente metodo per caratterizzare accuratamente i neuroni in movimento durante vivo permettendo quadro chiaro della funzione del neurone in funzione senso-motoria.
Protocol
1. Preparazione degli animali
- Anestetizzare ratto con sodio pentobarbital (IP 50mg/kg) e posto su una piastra elettrica. Radere la pelle sovrastante il cranio posteriore con tagliaunghie animale. Controllare l'animale per assicurare che un livello chirurgico di livello di anestesia è stata ottenuta con test per l'assenza di un riflesso ritiro e vocalizzazione quando le dita sono schiacciati come pure l'assenza di un riflesso palpebrale. Controllare il livello di anestesia ogni 15 minuti e mantenere un livello chirurgico di anesthetisa con iniezioni di 15mg/kg di sodio pentobarbital ogni 45 minuti.
- Utilizzare una tecnica asettica e fare un'incisione nella regione inguinale appena distalmente alla piega formata dal addome e interno coscia e inserire una cannula (1 mm di diametro, Clay Adams) nella vena femorale, e l'arteria femorale. Fai una incisione sulla linea mediana nella regione sottomandibolare, riflettono i muscoli infraioidea. Fai una piccola incisione nella trachea e inserire una cannula (2mm di diametro) per consentire la ventilazione. Tye una sutura intorno alla trachael cannual per fissarlo in place.Monitor pressione arteriosa sistemica sistolica e diastolica mediante la cannula arteriosa. Oltre a monitorare il ritiro e riflesso palpebrale ora monitorare la pressione del sangue per valutare il livello di anestesia. Somministrare l'anestesia aggiuntiva in caso di necessità attraverso la cannula venosa.
- Posizionare il topo in un frame stereotassico ed eseguire una craniotomia per esporre il cervelletto. Fissare la cannula tracheale di un ventilatore roditori. Ventilare l'animale con un volume di 2 cm 3 ad un tasso di 100/min con aria umidificata. Una pressione positiva di fine espirazione di 1 cm H 2 O dovrebbe essere mantenuto per prevenire il collasso del polmone. Ogni 15 minuti hyperinflate i polmoni per prevenire atelettasia. Poi coprire la superficie del cervello con olio minerale riscaldato (30 ° C). Fare attenzione a evitare il seno grande venoso situato direttamente sotto la giunzione tra il parietale e ossa interparietale.
- Applicare la colla al cianoacrilato una canna accoppiato ad un vibratore elettromagnetico e allegare l'asta nel diastema della mandibola. Spostare i segnali mandibola comando utilizzando il vibratore sia da un uscita A / D del computer o di un generatore di segnale.
- Posizionare un siliver-argento elettrodo di messa a terra cloruro sotto la pelle adiacente alla craniotomia.
2. Elettrodo di preparazione
- Fabbricare microelettrodi in vetro di quarzo o di alluminio con un estrattore orizzontale microelettrodo.
- Riempire il microelettrodo con biotinamide 5-10% sciolto in KCl 0.25M e 0.5M Tris HCl (pH 7,6) o del 2% tetramethlyrhodamine in soluzione salina (pH 6). Controllo dell'impedenza dell'elettrodo con un tester elettrodo. Per registrare da assoni di grande diametro fare elettrodi con impedenza di 60-80M Ω, per gli assoni piccoli e interneuroni fanno elettrodi con impedenza di 80-150MΩ.
- Posizionare il microelettrodo nella fase capo della elettrometro. Visualizza l'elettrodo attraverso un piccolo telescopio (20X con un reticolo allegato) che è fissato in posizione dietro la testa dell'animale. Utilizzando il telescopio è importante perché permette di essere stereotaxically elettrodi posizionati con estrema precisione.
3. Registrazione elettrofisiologica e colorazione intracellulare
- Fai una piccola apertura nella pia madre e compensare il feedback capacità in modo che quando l'elettrodo tocca il cervello un segnale di feedback viene prodotto. Questo consente un accurato posizionamento della superficie del cervello.
- Produrre ripetuto spostamento della mandibola e far avanzare l'elettrodo nel cervello con un motore passo-passo.
- Riconoscere impalements neuronale da improvvisi cali di potenziale DC e identificare intrasomatica impalements neuronale in corso di attività sinaptica. Buzzing l'elettrodo con sovracompensazione di capacità o toccando raramente producono una penetrazione di successo cellula. A causa della alta impedenza degli elettrodi, le risposte neuronali sono raramente osservati prima della penetrazione.
- Dopo aver infilzare un neurone e la penetrazione è considerato stabile, caratterizzano la risposta neuronale utilizzando rampa e tenere premuto e il movimento della mascella sinusoidale. 5 Mappa del campo recettivo del neurone sondando la pelle intorno alla testa e all'interno della cavità orale con un non-conduttivo sonda come un bastone di legno. Se rilevanti per lo studio, esaminare la risposta del neurone ad altri stimoli funzionalmente rilevanti quali la contrazione muscolare e stimoli nocivi. 6 afferenti primari nocicettivi recettori neuronali rispondere agli stimoli nocicettivi. Anesthesetics generale come il sodio pentobarbital Non blocco di conduzione assonale nei neuroni afferenti primari ma deprimono la trasmissione sinaptica. Così conduzione assonale nelle primarie assone afferente neuronale è conservato.
- Iniettare corrente (DC, 1-4NA) per un tempo di iniezione totale di 15-70nA minuti. Monitorare la penetrazione degli elettrodi durante l'iniezione di corrente e sospendere se potenziale di membrana diventa più positivo di quello-30mV.
4. Lavorazione dei tessuti
- Eutanasia degli animali per overdose di pentobarbital (140mg/kg IV) e profumato con un risciacquo vascolare (0,9% NaCl 38 ° C che contiene 500 unità di eparina e 1ml 2% xylocaina seguito da paraformaldeide 4% in 0.1M tampone fosfato (pH 7,4) .
- Togliere il cervello e la sezione è a 50-100μm con un vibratome sia nel frontale, piano sagittale o orizzontale. Secions sono raccolti flottante libero in 25 ° C PBS.
- Processo del cervello per DAB incubando in 1-2% di siero normale di capra e 1% Triton X-100 a 0.01M PBS seguita da incubazione nel complesso avidina biotina (1:50 Elite Vectastain). Reagire sezioni utilizzando nichel-DAB con H 2 O 2. Al processo per il Texas Red, sezioni incubare in complesso avidina-biotina (1:50) in PBS notte a 4 ° C e incubare nel 4% Texas Red avidina DCS in PBST a 4 ° C durante la notte. Sezioni di contrasto con una macchia fluorescente Nissl (NeuroTrace) 20 minuti a 23 ° C.
- Se il neurone è stato iniettato con rodamina, visualizzare il neurone iniettato direttamente con un microscopio a fluorescenza (Es 545nm).
5. La combinazione di metodo con marcatura retrograda, immunocitochimica, l'imaging confocale, analisi quantitativa colocalizzazione
Il successo di combinare questa tecnica con altri metodi dipende in gran parte buona etichettatura intracellulare.
- Il metodo qui visualizzati possono essere facilmente combinati con retrograda etichettatura neuronale. 7-10 Per fare questo, anestetizzare l'animale e con tecnica asettica, iniettare un tracciante neuronale come la perossidasi del rafano (20% perossidasi di rafano. Sigma VI, Sigma) e 1% germe di grano aggultinated perossidasi (Sigma) in regioni periferiche come bersaglio il muscolo massetere. Questo tracciante neuronale sarà assunto in assoni periferici e trasportati attraverso il trasporto assonale al somata motoneuroni. Per il muscolo massetere, 15μl di tracciante viene iniettato nel muscolo con una sterile microsiringa da 10 microlitri. Gli animali vengono poi poste su una piastra elettrica e seguito fino alla ripresa dall'anestesia e poi messo nelle loro gabbie per il recupero. Dopo 24 ore, anestetizzare gli animali e fisiologicamente caratterizzano i neuroni e intracellulare loro macchia. Poi l'animale profumato come descritto sopra e sezioni di tessuto di processo per la presenza di HRP utilizzando tetrametilbenzidina (TMB) come cromogeno ed tungstato di sodio come lo stabilizzatore e intensificato con il cobalto. Sezioni posto in 1% di sodio tungstato sciolto in PBS 0,1 M (pH 6,5) e 0,0007% TMB dissolto in etanolo e acetone assoluto a 15 ° C per 20 min. Poi reagire sezioni di tessuto con l'aggiunta di 1,0 ml di 0,3% H 2 O 2 per 100 ml di soluzione di incubazione per 60 min. Lavare il tessuto in PBS 0,1 M (pH 6,5) e il luogo in diaminobenzidina 0,05% (pH 7,4), 0,02% di cobalto, e 0,01% di H 2 O 2 a 0,1 M PBS (pH 7,4) per 10 minuti. a 37 ° C. Processo il tessuto per la visualizzazione del neurone iniettati con biotinamide come descritto e visualizzare le relazioni tra i neuroni sensoriali etichettato e una varietà di motoneuroni.
- La tecnica qui può anche facilmente essere combinato con immnocytochemistry 6. Per fare un esempio, immunocytochemically processo del cervello per sinaptofisina di localizzare con precisione all'interno delle sinapsi dei neuroni etichettati (Fig. 3). Per fare questo, incubare sezioni di cervello di topo anti-sinaptofisina anticorpi (1:10.000) per 2 giorni a 4 ° C e incubare anti-mouse FITC (1:400) per 1h a 23 ° C.
- Neuroni marcati con marcatori fluorescenti o trattati per l'imaging fluorescenti sono l'ideale per l'imaging confocale. Figura 3 è un esempio di una sezione ottica ottenuta con microscopia confocale attraverso un bouton assone. (Fig. 3). Generare animazioni dei neuroni etichettati con l'acquisizione di più sezioni ottiche attraverso il neurone etichettati (Fig. 4).
- I neuroni etichettati con questo metodo può essere utilizzato per l'analisi quantitativa colocalizzazione. Per fare questo, utilizzare una macro di software disponibili al pubblico in collaborazione con NIH immagine (che si trova a http://phy.ucsf.edu/ ° idl / colocalization.htm). Sinaptofisina localizzare all'interno dei terminali singolo assone combinando etichettatura intracellulare con immunocitochimica sinaptofisina 6.
6. Rappresentante dei risultati:
Una panoramica dei risultati rappresentativi che si possono ottenere con questo metodo sono illustrati nella Figura 1. Questo singolo neurone tronco encefalico è stato elettrofisiologico registrato durante il movimento della mandibola e, come si può chiaramente vedere, la risposta del neurone (Figura 1 in basso a sinistra, la luce blu) è stata modulata durante il movimento. Questo neurone è stato iniettato con biotinamide dopo caratterizzazione elettrofisiologica e successivamente trattati per la visualizzazione. Il neurone ricostruito (Figura 1 medio, verde) può essere realeTed ad un punto di riferimento anatomico, in questo caso il nucleo motore del trigemino designato (contorno rosso). Basati sulla risposta neuronale durante il movimento e la ricostruzione questo neurone può essere identificato come un neurone secondario fuso muscolare afferenti. La figura 2 illustra un esempio rappresentativo della risposta fisiologica di un neurone durante lo spostamento della mandibola. La risposta del neurone è rappresentato come frequenza di emissione istantanea. Si noti che la risposta neuronale imita strettamente spostamento mandibolare indicando che questo neurone particolare fornisce un feedback sensoriale legati alla posizione della mandibola. Figura 3 è un'immagine forte ingrandimento di un assone intracellulare macchiato combinato con colorazione di Nissl sinaptofisina e una macchia. Si noti la colocalizzazione di sinaptofisina (giallo) all'interno del bouton assone. Figura 4 è una animazione di un singolo neurone fisiologicamente caratterizzato e intracellulare etichettati.
Figura 1. Panoramica del metodo. In alto a sinistra: lo spostamento della mandibola. Medio registrazione intracellulare (verde) da solo neurone (giallo). La morfologia di questo neurone è stato ricostruito dopo la registrazione intracellulare e iniezione. Contorno rosso indica la posizione del nucleo motore del trigemino. In basso a sinistra: risposta fisiologica di questo neurone durante il movimento della mascella.
Figura 2. Rappresentante risposta fisiologica di un neurone singolo muscolo sensoriali registrate in vivo durante il movimento della mandibola. Si noti la somiglianza della risposta neuronale con spostamento della mandibola.
Figura 3. Arborizzazione terminale assonale con boutons sinaptica (gonfiori rosso) di un livello intracellulare macchiato di neuroni sensoriali che hanno risposto durante muscolare sondaggio. Il conseguente trattamento immunocitochimica per sinaptofisina mostra la localizzazione del sinaptofisina all'interno del bouton assonale (giallo). Green è un colorante fluorescente Nissl.
Figura 4. Animazione di assone fuso muscolare neurone primario afferente la cui risposta fisiologica è stato registrato in vivo durante il movimento mandibolare, L'assone è stato poi intracellulare colorati ed elaborati per la visualizzazione.
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Discussion
Il metodo qui illustrato è una tecnica potente che fornisce informazioni importanti nella funzione di singoli neuroni e di come la risposta dei singoli neuroni contribuisce a circuiti neuronali. 9 Questa conoscenza è fondamentale per comprendere la funzione senso-motoria. La più grande forza di questa tecnica è che consente sia la determinazione di un gran numero di parametri su un neurone tra cui la fisiologia, la morfologia e la morfologia sinaptica e la distribuzione. Quando combinato con altre tecniche come retrograda informazioni etichettatura neuronali aggiuntive quali circuiti neuronali possono essere caratterizzate. 7,8 Un altro vantaggio di questo metodo è che può essere appreso in fasi. Per esempio, la registrazione intracellulare può essere condotto inizialmente, seguita dalla colorazione intracellulare con immunocitochimica o retrograda etichettatura neuronale aggiunti dopo padronanza del metodo iniziale. Forse il limite maggiore di questa tecnica è che solo un piccolo numero di neuroni possono essere etichettate in una qualsiasi esperimento uno. Genere da due a tre neuroni di un particolare tipo fisiologico sono inizialmente etichettati. Una volta che il potenziale relazione tra la fisiologia e la morfologia è formulata, ulteriori esperimenti sono utilizzati per controllare attentamente questa relazione in esperimenti in cui viene etichettato solo un singolo neurone.
Il passo più importante per il successo di questo metodo è il mantenimento della stabilità elettrofisiologiche intracellulari di registrazione. Stabilità di registrazione possono variare notevolmente a seconda della posizione all'interno del cervello del neurone in fase di studio, ma una serie di manipolazioni possono essere usati per aumentare la stabilità di registrazione. Un pneumotorace può essere eseguita e l'animale ventilati artificialmente per ridurre le pulsazioni respiratorie. Stabilità può essere ulteriormente aumentata mediante l'applicazione di una pressione positiva di fine espirazione di circa 1 cm H 2 O. Quando la regione di interesse all'interno del cervello è raggiunto, la stabilità può essere migliorata iperventilazione l'animale, diminuendo il volume respiratorio e l'aumento della frequenza respiratoria. Alcuni studi elettrofisiologici hanno applicato agar calda sopra il cervello e cannulato della vescica, queste procedure non sono state efficaci per aumentare la stabilità neuronale registrazione nel tronco encefalico. E 'importante sottolineare che i tempi di iniezione non hanno bisogno di essere lunghi. Buoni risultati possono essere ottenuti con tempi di iniezione di circa 5 minuti. A causa delle dimensioni piccola punta di microelettrodi, rottura degli elettrodi nel cervello di solito non produce una consistente fuoriuscita di tracciante. Quindi l'elettrodo può essere sostituito e neuroni con successo registrati e macchiato in diverse centinaia di micron della posizione di rottura degli elettrodi. Se l'elettrodo è intasato o la soluzione di registrazione non riempie la punta dell'elettrodo in modo adeguato, il rumore è notevolmente aumentata e l'elettrodo deve essere sostituito. Test dell'impedenza dell'elettrodo prima dell'inserimento nel cervello riduce notevolmente tratti elettrodo improduttivo e fa risparmiare tempo. Se si sta tentando di registrare da una piccola regione del posizionamento stereotassico cervello è fondamentale. Io uso un telescopio collegato al tavolo di registrazione per mantenere uno zero fisso stereotassico. Il telescopio è molto utile perché l'elettrodo può essere inserito nel supporto degli elettrodi attaccati al tavolo di registrazione e quindi visualizzati sotto ingrandimento. Questo consente il posizionamento molto preciso del microelettrodo e azzeramento di elettrodi di ricambio.
Una serie di studi recenti hanno utilizzato juxtacellular etichettatura neuronale. 11,12 Con questo metodo viene applicato un elettrodo in prossimità di un neurone in base alle caratteristiche della registrazione neuronale e un tracciante neuronale viene espulso. Un evidente problema potenziale con questo metodo è etichettatura falsa in quanto tracciante può essere incorporato nel dendriti e degli assoni di altri neuroni nelle vicinanze dell'elettrodo. Inoltre, le relazioni input-output del neurone non può essere determinato, perché i potenziali d'azione extracellulare registrato può essere generato non solo da input sinaptico al neurone, ma dalle proprietà intrinseche del neurone. Con il metodo qui riportati, i neuroni sono etichettati, mentre il microelettrodo è in realtà all'interno del neurone, e quindi non vi è alcuna ambiguità riguardanti l'attribuzione di attività neuronale al neurone macchiato. Ciò è particolarmente importante per l'etichettatura assoni perché il movimento del microelettrodo da alcuni risultati micron di etichettatura spurie. Inoltre, gli eventi sottosoglia tra i potenziali sinaptici possono essere registrati dal neurone impalati.
Studi futuri potrebbero combinare questo metodo con i movimenti evocati. Per esempio la stimolazione corticale può evocare i movimenti di masticazione e la stabilità di registrazione all'interno del tronco encefalico dovrebbe consentire la registrazione intracellulare e colorazione dei neuroni nel corso di questi movimenti evocati. Dal momento che questa tecnica può essere fatto con un minimo intervento chirurgico, può anche essere possbile a utilizzare questo metodo per iniettare sostanze che alterano l'espressione genica in vivo.
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Disclosures
Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti conformemente al guidlines e regolazione di cui la Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio (NIH Publication No. 86-23, riveduta 1985) e l'Università del Maryland e cura degli animali Usa comitato.
Acknowledgments
Ringrazio Anthony Taylor per la formazione iniziale in in vivo registrazione intracellulare e A Maxwell Brown e David per aiutare lo sviluppo iniziale della tecnica di colorazione intracellulare. Ringrazio M. Argento per aiutare con la macro collocalization. Molti studiosi con i quali ho collaborato visione fornito nello sviluppo di questa tecnica tra cui R. Donga, M. Moritani, P. Luo, R. Ambalavanar. Questa tecnica è stata sviluppata con il supporto considerevole dalle sovvenzioni NIH DE10132, DE15386 e RR017971.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| electromagnetic vibrator | Ling Dynamic Systems | V101 | |
| signal generator | Feedback Systems | PFG605 | capable of producing trapezoidal output signal |
| electrode glass | Sutter Instrument Co. | AF100-68-10 | with filament |
| electrode puller | Sutter Instrument Co. | Model P-2000 or P-80 | |
| biotinamide | Vector Laboratories | SP-1120 | stored at 4°C |
| Texas Red avidin DCS | Vector Laboratories | A-2016 | |
| tetramethlyrhodamine | Molecular Probes, Life Technologies | D-3308 | 3000 molecular weight, lysine fixable |
| mouse anti-synaptophysin antibody | Chemicon International | MAB5258 | |
| fluorescent Nissl stain | Neurotrace, Life Technologies | N-21480 | |
| electrode tester | Winston Electronics | BL-1000-B | to measure electrode impedance |
| electrometer | Axon Instruments | Axoprobe 1A, Axoclamp 2B |
References
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