Summary
Методика описана количественно в естественных условиях физиологическую реакцию у млекопитающих нейронов во время движения и соотносить физиологии нейрона с нейронной морфологии, нейрохимические фенотип и синаптических микросхемы.
Abstract
Роль отдельных нейронов и их функции в нейронных цепях фундаментальное значение для понимания нейронных механизмов сенсорных и моторных функций. Большинство исследований механизмов сенсомоторной либо полагаться на экспертизу нейронов в то время как животное является статическим 1,2 или записи внеклеточной активности нейронов во время движения. 3,4 Хотя эти исследования предоставили фундаментальную основу для функции сенсомоторной, они либо не оценивать функциональную информацию которое происходит во время движения или ограничены в своей возможности в полной мере характеризуют анатомии, физиологии и нейрохимические фенотип нейрона. Техника здесь показано, которая позволяет обширная характеристика отдельных нейронов во время движения в естественных условиях. Эта техника может быть использована не только для изучения первичных афферентных нейронов, но и для характеристики мотонейронов и интернейронов сенсомоторной. Первоначально реакция одного нейрона записывается с использованием электрофизиологических методов при различных движениях нижней челюсти с последующим определением рецептивного поля для нейрона. Нейронов трассирующими затем внутриклеточно вводят нейрона и мозга обрабатывается таким образом, чтобы нейрон может быть визуализированы с освещением, электронным или конфокальной микроскопии (рис. 1). Подробное морфология характеризуется нейрон затем реконструирован, так что нейронные морфологии может быть соотнесена с физиологический ответ нейрона (рис. 2,3). В этой связи важные детали ключ и советы для успешной реализации этой техники предоставляются. Ценная дополнительная информация может быть определена для нейрона изучается объединения данного метода с другими методами. Ретроградная нейронов маркировка может быть использована для определения нейронов, с которыми помечены синапсов нейронов, что позволило детальное определение нейронной цепи. Иммуноцитохимическая могут быть объединены с помощью этого метода для изучения нейромедиаторов в меченых нейронов и определить химический фенотип нейронов, с которыми помечены синапсов нейронов. Меченых нейронов также могут быть обработаны для электронной микроскопии для определения ультраструктурные особенности и микросхемотехника меченых нейронов. В целом, это техника мощный метод тщательно охарактеризовать нейронов во время движения в естественных что позволяет существенным понимание роли нейронов в сенсомоторной функции.
Protocol
1. Подготовка животных
- Обезболить крысы натрия фенобарбиталом (50mg/kg IP) и место на грелку. Бритье кожного покрова задней череп животного клиперов. Проверьте животных заверить, что хирургическое уровень уровень анестезии был получен путем проверки на отсутствие рефлексов изъятия и вокализации, когда пальцы ущипнул, а также отсутствие глазной рефлекс. Проверьте уровень анестезии через каждые 15 минут и поддерживать уровень хирургической anesthetisa путем инъекции натрия пентобарбитал 15мг/кг каждые 45 минут.
- Используйте асептики и сделать разрез в паховой области только дистальнее складка образована живота и внутренней поверхности бедер и вставьте канюлю (диаметр 1 мм, Клей Adams) в бедренную вену, и бедренной артерии. Сделать средней линии разрез в подчелюстной области, отражают подъязычный мускулы. Сделайте небольшой надрез в трахее и вставить канюлю (2 мм в диаметре), чтобы вентиляция. Тай шва вокруг trachael cannual, чтобы закрепить его в place.Monitor системных диастолического и систолического артериального давления через артериальную канюлю. В дополнение к мониторингу вывода и глазной рефлекс теперь монитор артериального давления для оценки уровня анестезии. Администрирование дополнительной анестезии при необходимости с помощью венозной канюли.
- Место крысы в стереотаксической рамы и выполнения трепанации черепа, чтобы разоблачить мозжечка. Прикрепить трахеи канюли для грызунов вентилятора. Проветрить животное с объемом 2 см 3 со скоростью 100 в минуту с увлажненным воздухом. Положительное давление в конце выдоха в 1 см H 2 O должны быть сохранены, чтобы предотвратить коллапс легкого. Каждые 15 минут перерастянутой легких для предотвращения ателектаза. Затем покрывают поверхность мозга с подогреваемой минерального масла (30 ° С). Будьте осторожны, чтобы избежать большого венозного синуса расположены прямо под стык между теменной и межтеменной костей.
- Применить цианоакрилат клей стержень соединен с электромагнитным вибратором и приложите стержень в диастемы челюсти. Перемещение нижней челюсти с использованием сигналов команду вибратор с обеих / D выходе компьютера или генератор сигналов.
- Место siliver-хлорида серебра заземляющих электродов под кожу, прилегающих к трепанации черепа.
2. Электрод подготовки
- Изготовление микроэлектродов из кварца или алюмосиликатного стекла с использованием горизонтальных съемник микроэлектрода.
- Заполните микроэлектрода с 5-10 biotinamide% растворенного в 0,25 М KCl и 0,5 М Трис-HCl буфером (рН 7,6) или 2% tetramethlyrhodamine в физиологическом растворе (рН 6). Проверьте сопротивление электрода с электродом тестера. Для записи с большим диаметром аксонов сделать электроды с сопротивлением 60-80M Ω, для малых и аксонов интернейронов сделать электроды с волновым сопротивлением 80-150MΩ.
- Место микроэлектрода в голову этапе электрометра. Визуализируйте электрода через небольшой телескоп (20х с закрытых сеткой), которая фиксируется в положении за голову животного. Использование телескопа важно, потому что она позволяет электроды должны быть расположены stereotaxically с большой точностью.
3. Электрофизиологические записи и внутриклеточного окрашивания
- Сделайте небольшое отверстие в мягкой мозговой оболочки и компенсировать емкость обратной связи, чтобы, когда электрод касается мозг сигнал обратной связи производится. Это позволяет точного местоположения поверхности мозга.
- Продукция повторяется нижней челюсти перемещения и продвижения электродов в мозг с шаговым двигателем.
- Признать нейронов impalements внезапные падения потенциал постоянного тока и определить intrasomatic нейронов impalements продолжающимися синаптической активности. Buzzing электрод с сверхкомпенсации емкости или нажав редко приводят к успешному проникновению клеток. Из-за высокого импеданса электродов, ответы нейронов наблюдаются редко до проникновения.
- После того как вы прокалывать нейрона и проникновения считается стабильным, характеризующих нейронов ответ, используя рампу и удерживать и синусоидальные движения челюсти. 5 Карта рецептивного поля нейрона с помощью зондирования кожу вокруг головы и внутри полости рта с непроводящих зонд такие как деревянные палки. Если отношение к изучить, рассмотреть ответ нейрона на другой функционально соответствующие стимулы, такие как сокращение мышц и вредные раздражители. 6 первичных афферентных ноцицептивных нейронов рецепторы реагируют на ноцицептивных стимулов. Генеральный anesthesetics, таких как натрий пентобарбитал не блокируют аксонального проводимости в первичных афферентных нейронов, а, скорее, подавляют синаптической передачи. Таким образом аксонального проводимости в первичных афферентных нейронов аксоны сохраняется.
- Inject тока (DC, 1-4nA) на общее время инъекции 15-70nA минут. Монитор электрода проникновения во время инжекции тока и прекратить, если мембранный потенциал становится более положительным, чем-30 мВ.
4. Ткань обработки
- Усыпить животное передозировки фенобарбиталом (140mg/kg IV) и заливать с сосудистыми полоскания (0,9% NaCl 38 ° С, содержащий 500 единиц гепарина и 1 мл 2% xylocaine затем 4% параформальдегида в 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,4) .
- Удалить мозга и раздел ее на 50-100 мкм использованием vibratome либо фронтальной, сагиттальной или горизонтальной плоскости. Secions собираются свободное плавание в 25 ° C PBS.
- Процесс мозг для DAB путем инкубации в 1-2% нормальной козьей сывороткой и 1% Тритон Х-100 в 0,01 М PBS с последующей инкубацией в авидин биотин комплекса (1:50 Elite Vectastain). Реагировать разделы, используя никель-DAB с H 2 O 2. Чтобы процесс Texas Red, инкубировать разделы авидин-биотин комплекса (1:50) в PBS в течение ночи при 4 ° С, а затем инкубируют в 4% Texas Red авидин DCS в PBST при 4 ° С в течение ночи. Контрастирующая секций с люминесцентными Нисслю пятна (NeuroTrace) 20 мин при 23 ° C.
- Если нейрон вводили родамином, визуализировать вводится нейрон непосредственно с флуоресцентным микроскопом (Ex 545nm).
5. Сочетание метода с ретроградной маркировки, иммуноцитохимия, конфокальной микроскопии, количественный анализ колокализации
Об успешном сочетании этого метода с другими методами во многом зависит от хорошего внутриклеточных маркировки.
- Метод визуализируется здесь может легко сочетаться с ретроградной нейронной маркировки. 7-10 Для этого анестезию животного и с использованием асептических технику, вводить нейронов трассирующими, таких как пероксидаза хрена (20% пероксидазой хрена. Sigma VI, Sigma) и 1% зародышей пшеницы aggultinated пероксидазой хрена (Sigma) в периферийных регионах, таких как целевой жевательной мышцы. Это нейронов трассирующими будут рассмотрены в периферических аксонов и транспортируется по аксонального транспорта somata мотонейрона. Для жевательные мышцы, 15μl трассирующих вводят в мышцы с использованием стерильных 10 мкл микрошприца. Животных помещали на грелку и контролировать до оправилась от наркоза, а затем помещается в их клетки для восстановления. После 24 часа, анестезию животных и физиологически характеризуют нейронов и внутриклеточно пятно них. Затем обрызгивать животных, как описано выше, и технологические секции тканей на присутствие HRP использованием тетраметилбензидина (ТМБ) в качестве хромоген и вольфрамата натрия в качестве стабилизатора и активизировать с кобальтом. Место разделов в 1% вольфрамата натрия, растворенного в 0,1 М PBS (рН 6,5) и 0,0007% TMB растворяют в абсолютном этаноле и ацетоне при 15 ° С в течение 20 мин. Затем реагировать срезах тканей путем добавления 1,0 мл 0,3% Н 2 О 2 на 100 мл инкубационный раствор в течение 60 мин. Промойте ткань в 0,1 М PBS (рН 6,5) и место в 0,05% диаминобензидина (рН 7,4), 0,02% кобальта, и 0,01% H 2 O 2 в 0,1 М PBS (рН 7,4) в течение 10 мин. при 37 ° C. Процесс тканей для визуализации нейронных вводили biotinamide, как описано и визуализировать отношения между меченым сенсорных нейронов и различных мотонейронов.
- Техника показанные здесь, могут также легко быть объединены с immnocytochemistry 6. В качестве примера, immunocytochemically процесс мозг для synaptophysin чтобы безошибочно находить синапсов в нейронах помечены (рис. 3). Чтобы сделать это, инкубировать мозга разделы мыши анти-synaptophysin антител (1:10000) в течение 2 дней при температуре 4 ° С и затем инкубируют в антимышиным FITC (1:400) в течение 1 ч при 23 ° C.
- Нейроны, меченных флуоресцентными маркерами или обработанные для люминесцентных изображений идеально подходят для конфокальной микроскопии. Рисунок 3 является примером оптической части, полученные с конфокальной микроскопии через Bouton аксона. (Рис. 3). Создание анимации меченых нейронов путем приобретения нескольких оптических срезов через меченых нейронов (рис. 4).
- Нейроны помечены этот метод может быть использован для количественного анализа колокализации. Для этого используется публично доступное программное обеспечение макрос в сочетании с NIH Image (находится на http://phy.ucsf.edu/ ° IDL / colocalization.htm). Локализация synaptophysin в пределах одного терминалы аксонов путем объединения внутриклеточных маркировки с иммуноцитохимии synaptophysin 6.
6. Представитель Результаты:
Обзор репрезентативные результаты, которые можно получить с помощью этого метода показаны на рисунке 1. Этот единственный нейрон мозга электрофизиологически записан во время движения нижней челюсти и, как ясно видно, реакция этого нейрона (рис. 1 внизу слева, светло-голубой) была модулированных во время движения. Этот нейрон вводили biotinamide после электрофизиологических характеристик и затем обрабатываются для визуализации. Реконструированы нейрона (рис. 1 средний, зеленый) могут быть реальнымиТед к анатомическим ориентиром, в этом случае ядро тройничного нерва двигателя назначенным (красный контур). На основе нейронных ответов во время движения и реконструкции этого нейрона может быть идентифицирована как вторичные мышц шпинделя афферентного нейрона. На рисунке 2 показан типичный пример физиологический ответ нейрона в челюсть перемещения. Ответ нейрона представлен как мгновенная частота стрельбы. Обратите внимание, что нейронная реакция точно имитирует перемещение нижней челюсти указывает, что этот конкретный нейрон обеспечивает сенсорной обратной связи, связанные с нижней челюсти позиции. Рисунке 3 изображения в высоком увеличении внутриклеточно окрашенных аксонов в сочетании с окрашиванием для synaptophysin и Нисслю пятно. Обратите внимание, колокализации synaptophysin (желтый) в аксон Bouton. Рисунке 4 анимации одного, физиологически отличаются и внутриклеточно меченых нейронов.
Рисунок 1. Обзор методов. Вверху слева: нижней челюсти перемещения. Ближний Внутриклеточные записи (зеленый) от одного нейрона (желтый). Морфология этого нейрона была реконструирована после внутриклеточной регистрации и инъекции. Красный контур указывает расположение тройничного ядра двигателя. Слева внизу: физиологическая реакция этого нейрона во время движения челюсти.
Рисунок 2. Представителю физиологический ответ один мускул сенсорного нейрона записанных в естественных условиях во время движения нижней челюсти. Обратите внимание на сходство нейронов ответ с челюстью перемещения.
Рисунок 3. Терминал аксонального разветвление с синаптической boutons (красные вздутия) из внутриклеточно окрашенных сенсорных нейронов, которые ответили во время мышечной зондирования. Последующие иммуноцитохимического обработки synaptophysin показывает локализации synaptophysin в аксонального Бутон (желтый). Зеленый флуоресцентный Нисслю пятно.
Рисунок 4. Анимация мышечного веретена первичных афферентных аксона нейрона чья физиологическая реакция была записана в естественных условиях во время движения нижней челюсти, аксон тогда внутриклеточно окрашенных и обрабатываются для визуализации.
Скачать видео высокого разрешения Рисунок 4 здесь
Скачать средний разрешение видео на рисунке 4 здесь
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метод иллюстрируется здесь мощная техника, которая обеспечивает важное понимание функций отдельных нейронов, и как реакция отдельных нейронов вносит свой вклад в нейронных цепях. 9 Это знание является основополагающим для понимания сенсомоторной функции. Самой сильной стороной этого метода является то, что позволяет определять большое число параметров, о нейроне в том числе физиология, морфология и синаптических морфологии и распределения. В сочетании с другими методами, такие как ретроградная нейронов маркировки дополнительной информации, такой как нейронной цепи могут быть охарактеризованы. 7,8 Другим преимуществом этого метода является то, что можно узнать по шагам. Например, внутриклеточной регистрации могут быть проведены на начальном этапе, затем внутриклеточного окрашивания иммуноцитохимии или ретроградной нейронной маркировке добавляется после овладения начальным методом. Возможно, самым большим ограничением метода является то, лишь небольшое число нейронов могут быть помечены в одном эксперименте. Обычно 2:58 нейронов особых физиологических типа изначально маркированы. Как только потенциальная связь между физиологией и морфологией формулируется, дополнительные эксперименты используются тщательно проверить эту взаимосвязь в экспериментах, в которых только один нейрон имеет метку.
Наиболее важным шагом для успеха этого метода состоит в поддержании стабильности внутриклеточных электрофизиологических записи. Запись стабильность будет сильно варьироваться в зависимости от места в мозге нейронов в исследовании, но количество манипуляций могут быть использованы для увеличения стабильность записи. Пневмоторакс может быть выполнена и животных искусственно вентилируемых обязательство уменьшить число респираторных пульсаций. Стабильность может быть увеличен еще, применяя положительное давление в конце выдоха около 1 см H 2 O. Когда область интересов в мозг будет достигнута, стабильность может быть повышена за счет гипервентиляции животных за счет уменьшения дыхательного объема и повышение частоты дыхания. Некоторые электрофизиологические исследования применяется теплый агар над мозгом и канюлированные мочевого пузыря; эти процедуры не были эффективны в повышении нейронной стабильность записи в стволе мозга. Важно отметить, что время впрыска не должны быть длинными. Хорошие результаты можно получить с впрыском время около 5 минут. Из-за небольшого размера кончика микроэлектродов, поломка электродов в мозгу как правило, не производят большого выпуска индикатора. Поэтому электрод может быть заменен и нейроны успешно записан и окрашенных в течение нескольких сотен микрон расположения электродов поломки. Если электрод забиты или записи решение не заполнять кончик электрода адекватно, шум будет значительно увеличился и электрод должен быть заменен. Тестирование электродов сопротивление до введения в мозг значительно снижает непроизводительные путей электрода и экономит время. Если вы пытаетесь записать из небольшой области позиционирования стереотаксической головной мозг имеет первостепенное значение. Я использую телескоп прилагается к записи таблицы для поддержания фиксированного стереотаксической нулю. Телескоп очень полезно, потому что электрод может быть помещен в держатель электрода прилагается к записи таблицы, а затем рассматривать при увеличении. Это позволяет очень точное размещение микроэлектрода и обнуление замены электродов.
Ряд недавних исследований использовали juxtacellular нейронов маркировки. 11,12 С помощью этого метода электрод помещается в непосредственной близости от нейрона основе характеристик нейронов записи и нейронных трассирующими выбрасывается. Очевидной потенциальная проблема с этим методом является ложной маркировки с трассирующими могут быть включены в дендритов и аксонов других нейронов в непосредственной близости от электрода. Кроме того, ввод-вывод отношений нейрон не может быть установлен, так как внеклеточно записал потенциалы действия могут быть созданы не только синаптические вход нейрона, но и внутренние свойства нейрона. С помощью метода сообщили здесь, нейроны помечены только в то время как микроэлектрода на самом деле в нейроне и, следовательно, нет никакой двусмысленности в отношении атрибуции активности нейронов для окрашенных нейронов. Это особенно важно при маркировке аксонов, поскольку движение микроэлектрода на несколько микрон в результатах ложные маркировки. Кроме того, подпороговых событий, включая синаптические потенциалы могут быть записаны с насаженными нейрона.
Будущие исследования могут сочетать этот метод с вызывали движений. Например корковой стимуляции может вызывать жевательных движений и стабильность записи в стволе мозга должно позволить внутриклеточной регистрации и окрашивание нейронов во время этих вызвали движений. Поскольку эта техника может быть сделано с минимальным хирургическим вмешательством, оно также может быть вероятныйible использовать этот метод для введения вещества, которые изменяют экспрессию генов в живом организме.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Эксперименты на животных были проведены в соответствии с добраться до нас и регулирования, изложенных в руководстве по уходу и использованию лабораторных животных (NIH публикации № 86-23, пересмотренная 1985) и университета Мэриленда по Уходу за животными и использование комитета.
Acknowledgments
Я благодарю Энтони Тейлор для первоначального обучения в в естественных условиях внутриклеточной регистрации и Браун и Дэвид Максвелл за помощь в начальное развитие внутриклеточных техники окрашивания. Я благодарю М. Серебряного за помощь в collocalization макроса. Многие ученые, с которыми я сотрудничал при условии понимания развития этой техники в том числе Р. Донга, М. Moritani, П. Ло, Р. Ambalavanar. Эта методика была разработана при значительной поддержки со стороны NIH гранты DE10132, DE15386 и RR017971.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| electromagnetic vibrator | Ling Dynamic Systems | V101 | |
| signal generator | Feedback Systems | PFG605 | capable of producing trapezoidal output signal |
| electrode glass | Sutter Instrument Co. | AF100-68-10 | with filament |
| electrode puller | Sutter Instrument Co. | Model P-2000 or P-80 | |
| biotinamide | Vector Laboratories | SP-1120 | stored at 4°C |
| Texas Red avidin DCS | Vector Laboratories | A-2016 | |
| tetramethlyrhodamine | Molecular Probes, Life Technologies | D-3308 | 3000 molecular weight, lysine fixable |
| mouse anti-synaptophysin antibody | Chemicon International | MAB5258 | |
| fluorescent Nissl stain | Neurotrace, Life Technologies | N-21480 | |
| electrode tester | Winston Electronics | BL-1000-B | to measure electrode impedance |
| electrometer | Axon Instruments | Axoprobe 1A, Axoclamp 2B |
References
- Cuellar, C. A., Tapia, J. A., Juarez, V., Quevedo, J., Linares, P., Marinez, L., Manjarrez, E. Propagation of sinusoidal electrical waves along the spinal cord during a fictive motor task. J. Neurosci. 29, 798-810 (2010).
- Frigon, A., Gossard, J. Evidence for specialized rhythm-generating mechanisms in the adult mammalian spinal cord. J. Neurosci. 30, 7061-7071 (2010).
- Wang, W., Chan, S. S., Heldman, D. A., Moran, D. W. Motor cortical representation of hand translation and rotation during reaching. J. Neurosci. 30, 958-962 (2010).
- Ma, C., He, J. A method for investigating cortical control of stand and squat in conscious behavioral monkeys. J. Neurosci. Meth. 192, 1-6 (2010).
- Dessem, D., Donga, R., Luo, P. Primary- and secondary-like jaw-muscle spindle afferents have characteristic topographic distributions. J. Neurophysiol. 77, 2925-2944 (1997).
- Dessem, D., Moritaini, A., Ambalavanar, R. Nociceptive craniofacial muscle primary afferent neurons synapse in both the rostral and caudal brain stem. J. Neurophysiol. 98, 214-223 (2007).
- Luo, P., Dessem, D. Inputs from identified jaw-muscle spindle afferents to trigeminothalamic neurons in the rat: a double-labeling study using retrograde HRP and intracellular. J. Comp. Neurol. 353, 50-66 (1995).
- Dessem, D., Luo, P. Jaw-muscle spindle afferent feedback to the cervical spinal cord in the rat. J. Comp. Neurol. 128, 451-459 (1999).
- Luo, P., Wong, R., Dessem, D. Projection of jaw-muscle spindle afferents to the caudal brainstem in rats demonstrated using intracellular biotinamide. J. Comp. Neurol. 358, 63-78 (1995).
- Luo, P., Dessem, D. Ultrastructural anatomy of physiologically identified jaw-muscle spindle afferent terminations onto retrogradely labeled jaw-elevator motoneurons in the rat. J. Comp. Neurol. 406, 384-401 (1999).
- Hassani, O. K., Henny, P., Lee, M. G., Jones, B. E. GABAergic neurons intermingled with orexin and MCH neurons in the lateral hypothalamus discharge maximally during sleep. Eur. J. Neurosci. 32, 448-457 (2010).
- Inokawa, H., Yamada, H., Matsumoto, N., Muranishi, M., Kimura, M. Juxtacellular labeling of tonically active neurons and phasically active neurons in the rat striatum. Neuroscience. 168, 395-404 (2010).
