Summary
Eine Technik ist beschrieben, um die in vivo physiologische Reaktion von Säugetieren Neuronen während der Bewegung zu quantifizieren und zu korrelieren die Physiologie des Neurons mit neuronalen Morphologie, neurochemischen Phänotyp und synaptischen Mikrotechnik.
Abstract
Die Rolle der einzelnen Neuronen und ihre Funktion in neuronalen Schaltkreisen ist grundlegend für das Verständnis der neuronalen Mechanismen der sensorischen und motorischen Funktionen. Die meisten Untersuchungen des sensomotorischen Mechanismen beruhen entweder auf Untersuchung von Neuronen während eines Tieres ist statisch 1,2 oder aufzeichnen extrazelluläre neuronale Aktivität während einer Bewegung. 3,4 Während diese Studien der fundamentale Hintergrund für Sensomotorik Verfügung gestellt haben, sie entweder nicht beurteilen funktionelle Informationen die auftritt, während einer Bewegung oder sind in ihrer Fähigkeit zur vollständigen Charakterisierung der Anatomie, Physiologie und neurochemischen Phänotyp des Neurons begrenzt. Eine Technik ist hier die erlaubt umfangreiche Charakterisierung von einzelnen Neuronen während einer in vivo Bewegung gezeigt. Diese Technik kann nicht nur zur primären afferenten Neuronen zu studieren, sondern auch für Motoneuronen und sensomotorischen Interneuronen zu charakterisieren. Zunächst die Antwort eines einzelnen Neurons aufgezeichnet wird mit elektrophysiologischen Methoden bei verschiedenen Bewegungen des Unterkiefers durch die Bestimmung der rezeptiven Feld für das Neuron gefolgt. Eine neuronale Tracer wird dann intrazellulär in das Neuron injiziert und das Gehirn ist so verarbeitet, dass das Neuron kann visualisiert werden mit Licht-, Elektronen-oder konfokalen Mikroskopie (Abb. 1). Die detaillierte Morphologie des Neurons charakterisiert wird dann umgebaut, so dass neuronale Morphologie mit der physiologischen Reaktion des Neurons (Abb. 2,3) korreliert werden können. In dieser Mitteilung wichtiger Schlüssel Details und Tipps für eine erfolgreiche Umsetzung dieser Technik sind vorhanden. Können wertvolle Zusatzinformationen für das Neuron unter Studie durch die Kombination dieser Methode mit anderen Techniken bestimmt werden. Retrograde neuronale Markierung kann verwendet werden, um Neuronen zu bestimmen, mit denen die markierten Neuronen Synapsen; so dass detaillierte Bestimmung der neuronalen Schaltkreise. Immunocytochemistry Mit dieser Methode können kombiniert werden, um Neurotransmitter innerhalb der markierten Neuronen zu untersuchen und die chemische Phänotypen von Neuronen, mit denen die markierten Neuronen Synapsen bestimmen. Die markierten Neuron kann auch für die Elektronenmikroskopie aufbereitet werden, um die ultrastrukturelle Merkmale und Mikrotechnik der markierten Neuronen zu bestimmen. Insgesamt dieser Technik ist eine leistungsfähige Methode, um gründlich zu charakterisieren Neuronen während in vivo Bewegung wodurch erhebliche Einblick in die Rolle des Neurons in Sensomotorik.
Protocol
1. Tierische Vorbereitung
- Anesthetize Ratte mit Natrium-Pentobarbital (50mg/kg IP) und auf ein Heizkissen. Shave die Haut über der hinteren Schädel mit Tierschermaschinen. Überprüfen Sie das Tier zu gewährleisten, dass eine chirurgische Maß an Niveau der Narkose durch die Prüfung wurde für das Fehlen eines Rücktritts Reflex und Vokalisation erhalten, wenn die Zehen geklemmt sowie das Fehlen einer Augenlidreflexe sind. Überprüfen Sie die Höhe der Anästhesie alle 15 Minuten und Aufrechterhaltung einer chirurgischen Niveau anesthetisa durch die Injektion von Natrium-Pentobarbital 15mg/kg alle 45 Minuten.
- Unter aseptischen Bedingungen arbeiten und einen Einschnitt in der Leistengegend direkt distal der Falte durch den Bauch und Innenseite der Oberschenkel gebildet und legen Sie eine Kanüle (1 mm Durchmesser, Clay Adams) in die V. femoralis und A. femoralis. Machen Sie einen Medianschnitt in der Submandibulärregion, spiegeln die infrahyoideus. Machen Sie einen kleinen Schnitt in die Luftröhre und legen Sie eine Kanüle (2 mm Durchmesser), um Belüftung zu ermöglichen. Tye eine Naht um den trachael cannual, um es in place.Monitor systemischen systolischen und diastolischen Blutdrucks über die arterielle Kanüle zu sichern. Neben der Überwachung der Rücknahme-und Augenlidreflexe jetzt den Blutdruck zu beobachten, um das Niveau der Anästhesie zu beurteilen. Verwalten zusätzliche Betäubung, wenn über die venöse Kanüle nötig.
- Legen Sie die Ratte in einen stereotaktischen Rahmen und führen Sie eine Kraniotomie an das Kleinhirn freizulegen. Bringen Sie die Trachealkanüle ein Nagetier Ventilator. Lüften Sie das Tier mit einem Volumen von 2 cm 3 mit einer Geschwindigkeit von 100/min mit feuchter Luft. Eine positive endexspiratorischer Druck von 1 cm H 2 O sollte beibehalten werden, um Lungen-Kollaps zu verhindern. Alle 15 Minuten Hyperinflation der Lunge zu Atelektasen zu verhindern. Dann bedecken die Oberfläche des Gehirns mit warmen Mineralöl (30 ° C). Achten Sie darauf, die großen venösen Sinus direkt unter der Kreuzung zwischen der parietalen und interparietalen Knochen entfernt zu vermeiden.
- Bewerben Sekundenkleber auf einen Stab gekoppelt mit einem elektromagnetischen Vibrator und befestigen Sie die Stange in das Diastema des Kiefers. Bewegen Sie den Unterkiefer mit dem Befehl signalisiert dem Vibrator entweder von einem A / D-Computer-Ausgang oder einen Signalgenerator.
- Legen Sie eine siliver-Silberchlorid Erdungselektrode unter die Haut neben der Kraniotomie.
2. Electrode Vorbereitung
- Fertigen Mikroelektroden aus Quarz oder Aluminosilicatglas mit einer horizontalen Mikroelektroden Abzieher.
- Füllen Sie den Mikroelektroden mit 5-10% biotinamide in 0,25 M KCl und 0,5 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,6) oder 2% tetramethlyrhodamine in Kochsalzlösung (pH 6) aufgelöst. Überprüfen Sie Elektrodenimpedanz mit einer Elektrode Tester. Zur Aufnahme von großem Durchmesser Axone machen Elektroden mit einer Impedanz von 60-80M Ω, für kleine Axone und Interneuronen machen Elektroden mit einer Impedanz von 80-150MΩ.
- Legen Sie die Mikroelektroden in den Kopf der Bühne des Elektrometers. Visualisieren Sie die Elektrode durch ein kleines Teleskop (20X mit einer geschlossenen Absehen), die in der Position hinter den Kopf des Tieres fixiert ist. Mit dem Teleskop ist wichtig, weil sie Elektroden an stereotaxically mit großer Präzision positioniert werden können.
3. Elektrophysiologische Aufzeichnung und intrazelluläre Färbung
- Machen Sie eine kleine Öffnung in der pia mater und überkompensieren die Kapazität Feedback, so dass, wenn die Elektrode im Gehirn berührt ein Feedback-Signal erzeugt wird. Dies ermöglicht die genaue Lage der Oberfläche des Gehirns.
- Produce wiederholt mandibuläre Verlagerung und vor der Elektrode in das Gehirn mit einem Schrittmotor.
- Erkennen neuronalen Pfählungen durch plötzliche DC-Potential und identifizieren intrasomatic neuronalen Pfählungen durch laufende synaptische Aktivität. Buzzing die Elektrode mit einer Überkompensation der Kapazität oder Klopfen selten zu einem erfolgreichen Zellpenetration. Aufgrund der hohen Impedanz der Elektroden sind neuronale Reaktionen selten vor, um das Eindringen beobachtet.
- Nachdem Sie ein Neuron und spießen das Eindringen gilt als stabil, charakterisieren die neuronale Antwort mit Rampe und halten und sinusförmige Kieferbewegungen. 5 Karte der rezeptiven Feld des Neurons durch Untersuchung der Haut rund um die Kopf-und intra Mundhöhle mit einem nicht leitenden Sonde wie einen Holzstab. Wenn die für die Studie untersuchen die Reaktion des Neurons an andere funktionell relevanter Reize wie Muskelkontraktion und Schmerzreize. 6 primären afferenten nozizeptiven neuronalen Rezeptoren reagieren auf nozizeptive Reize. Allgemeine anesthesetics wie Natrium-Pentobarbital nicht blockieren axonalen Leitung in primären afferenten Neuronen, sondern drücken die synaptische Übertragung. So axonalen Leitung in der primären afferenten neuronalen Axon ist erhalten geblieben.
- Inject Gleichstrom (DC, 1-4NA) für insgesamt Einspritzzeit von 15-70nA Minuten. Monitor-Elektrode Penetration während Stromeinspeisung und einzustellen, wenn Membranpotential positiver als-30mV.
4. Tissue Verarbeitung
- Euthanize das Tier durch Überdosis Pentobarbital (140mg/kg IV) und perfuse mit einer vaskulären spülen (0,9% NaCl 38 ° C mit 500 Einheiten Heparin und 1 ml 2% Xylocain gefolgt von 4% Paraformaldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4) .
- Entfernen Sie das Gehirn und § es bei 50-100 um mit einer Vibratom entweder in der Frontal-, Sagittal-oder Horizontalebene. Secions frei schwebend in 25 ° C PBS gesammelt.
- Prozess im Gehirn für DAB durch Inkubation bei 1-2% normalem Ziegenserum und 1% Triton X-100 in 0,01 M PBS gefolgt von einer Inkubation in Avidin Biotin-Komplex (1:50 Elite Vectastain). React Abschnitte mit Nickel-DAB mit H 2 O 2. Zur Bearbeitung für Texas Red, inkubieren Abschnitte in Avidin-Biotin-Komplex (1:50) in PBS über Nacht bei 4 ° C und dann in 4% Texas Red Avidin DCS in PBST bei 4 ° C über Nacht inkubieren. Gegenfärbung Abschnitte mit einem fluoreszierenden Nissl-Färbung (NeuroTrace) 20min bei 23 ° C.
- Wenn Neuron mit Rhodamin injiziert wurde, visualisieren die injizierten Neuron direkt mit einem Fluoreszenz-Mikroskop (Ex 545nm).
5. Die Kombination Methode mit retrograde Markierung, Immunzytochemie, konfokale Bildgebung, quantitative Kolokalisationsanalyse
Den Erfolg dieser Kombination dieser Technik mit anderen Methoden ist weitgehend abhängig von guten intrazellulären Kennzeichnung.
- Die Methode visualisiert hier kann leicht mit retrograde neuronale Markierung kombiniert werden. 7-10 Um dies zu tun, betäuben das Tier und unter aseptischen Bedingungen injizieren eine neuronale Tracer wie Meerrettichperoxidase (20% Meerrettichperoxidase. Sigma VI, Sigma) und 1% Weizenkeimöl aggultinated Meerrettichperoxidase (Sigma) in peripheren Zielregionen wie M. masseter. Diese neuronale Tracer wird bis in die peripheren Axone aufgenommen und transportiert werden via axonalen Transport zu den Motoneuronen Somata. Für die Kaumuskel ist 15μl der Tracer in den Muskel mit einer sterilen 10 Mikroliter Mikrospritze injiziert. Die Tiere werden dann auf einem Heizkissen gelegt und überwacht werden, bis aus der Narkose erholt und dann in ihren Käfigen für die Verwertung gelegt. Nach 24 Stunden, betäuben Tiere und physiologisch charakterisieren Neuronen und intrazellulär anzufärben. Dann versorgen die Tiere, wie oben und Prozess Gewebeschnitten für die Anwesenheit von HRP mit Tetramethylbenzidin (TMB) als Chromagen und Natriumwolframat als Stabilisator und verstärkte mit Kobalt beschrieben. Legen Sie Abschnitte in 1% Natriumwolframat in 0,1 M PBS (pH 6,5) und 0,0007% TMB in absolutem Ethanol und Aceton bei 15, gelöst ° C für 20 min. Dann reagieren Gewebeschnitten durch Zugabe von 1,0 ml von 0,3% H 2 O 2 pro 100ml Inkubation für 60 min. Das Gewebe spülen in 0,1 M PBS (pH 6,5) und in 0,05% Diaminobenzidin (pH 7,4), 0,02% Kobalt und 0,01% H 2 O 2 in 0,1 M PBS (pH 7,4) für 10 min. bei 37 ° C. Prozess des Gewebes für die Visualisierung des Neurons mit biotinamide injiziert, wie beschrieben und visualisiert die Beziehungen zwischen der markierten sensorischen Neuronen und eine Vielzahl von Motoneuronen.
- Die Technik hier gezeigt können auch leicht mit immnocytochemistry kombiniert werden. 6 Als ein Beispiel, immuncytochemisch Prozess des Gehirns für Synaptophysin, um genau zu lokalisieren Synapsen innerhalb markierter Neuronen (Abb. 3). Um dies zu tun, inkubieren Hirnschnitten in Maus-anti-Synaptophysin-Antikörper (1:10.000) für 2 Tage bei 4 ° C und dann in anti-Maus-FITC (1:400) inkubiert 1 h bei 23 ° C.
- Neuronen mit fluoreszierenden Markern versehen oder verarbeitet für Fluoreszenz-Imaging sind ideal für die konfokale Bildgebung. Abbildung 3 ist ein Beispiel für einen optischen Schnitt mit der konfokalen Mikroskopie durch ein Axon bouton erhalten. (Abb. 3). Generieren Sie Animationen der markierten Neuronen durch den Erwerb mehrerer optische Schnitte durch die markierte Neuron (Abb. 4).
- Neuronen mit dieser Methode markiert werden können für quantitative Kolokalisationsanalyse verwendet werden. Um dies zu tun, verwenden Sie einen öffentlich zugänglichen Software Makro in Verbindung mit NIH Image (gefunden bei http://phy.ucsf.edu/ ° idl / colocalization.htm). Localize Synaptophysin innerhalb einzelner Axonterminalen durch die Kombination von intrazellulären Markierung mit Synaptophysin Immunzytochemie. 6
6. Repräsentative Ergebnisse:
Eine Übersicht über die repräsentative Ergebnisse, die unter Verwendung dieser Methode werden können, sind in Abbildung 1 dargestellt. Diese einzelne Neuron Hirnstamms elektrophysiologisch war während der Bewegung des Unterkiefers aufgezeichnet und, wie deutlich zu sehen ist, war die Antwort des Neurons (Abbildung 1 unten links, hellblau) moduliert während der Bewegung. Dieses Neuron wurde mit biotinamide nach elektrophysiologischen Charakterisierung injiziert und anschließend zur Visualisierung verarbeitet. Die rekonstruierten Neuron (Abbildung 1 Mitte, grün) können realeTed einer anatomischen Landmarke, in diesem Fall den Trigeminus Nucleus bezeichnet (rote Umrandung). Basierend auf den neuronalen Reaktion während der Bewegung und des Wiederaufbaus dieses Neuron kann als sekundäre Muskel afferenten Neuron identifiziert werden. Abbildung 2 zeigt ein repräsentatives Beispiel für die physiologische Reaktion eines Neurons im Kiefer Verschiebung. Die Reaktion des Neurons ist als Momentanwerte Schussfrequenz vertreten. Beachten Sie, dass die neuronale Antwort ahmt mandibuläre Verlagerung darauf hinweist, dass diese besondere Neuron sensorisches Feedback in Bezug auf die Lage des Unterkiefers bietet. Abbildung 3 ist ein hoher Vergrößerung Bild eines intrazellulär gefärbt Axon mit Färbung für Synaptophysin und Nissl-Färbung kombiniert. Beachten Sie die Kolokalisation von Synaptophysin (gelb) in das Axon bouton. Abbildung 4 ist eine Animation aus einem einzigen, physiologisch charakterisiert und intrazellulär markierten Neuronen.
Abbildung 1. Übersicht über die Methode. Oben links: mandibuläre Verlagerung. Middle Intrazelluläre Aufnahme (grün) aus einzelnen Neurons (gelb). Die Morphologie dieses Neuron wurde nach intrazellulärer Aufnahme und Injektion rekonstruiert. Rote Umrandung zeigt Lage der Trigeminus-motorischen Kern. Unten links: physiologische Reaktion dieser Neuronen während der Kieferbewegungen.
Abbildung 2. Representative physiologische Reaktion eines einzelnen Muskels sensorischen Neuronen in vivo während der Bewegung des Unterkiefers aufgezeichnet. Man beachte die Ähnlichkeit der neuronalen Antwort mit Kiefer Verschiebung.
Abbildung 3. Terminal-axonale Verzweigung mit synaptischen boutons (rote Schwellungen) eines intrazellulär gefärbt sensorischen Neuronen, die bei Muskel-Probing reagiert. Nachfolgende immunzytochemische Verarbeitung für Synaptophysin zeigt Lokalisierung von Synaptophysin in der axonalen bouton (gelb). Grün ist eine fluoreszierende Nissl-Färbung.
Abbildung 4. Animation der Muskelspindel primären afferenten Neuron Axon, dessen physiologische Reaktion wurde in vivo während der Bewegung des Unterkiefers aufgezeichnet wurde Das Axon dann intrazellulär gefärbt und verarbeitet für die Visualisierung.
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Discussion
Das dargestellte Verfahren hier ist eine leistungsstarke Technik, die wichtige Einblicke in die Funktion der einzelnen Neuronen und wie die Reaktion einzelner Nervenzellen trägt zur neuronalen Schaltkreisen. 9 Dieses Wissen ist grundlegend für das Verständnis Sensomotorik. Die größte Stärke dieser Technik ist, dass es erlaubt die Bestimmung einer Vielzahl von Parametern zu einem Neuron einschließlich Physiologie, Morphologie und synaptische Morphologie und Verteilung. In Verbindung mit anderen Techniken wie retrograde neuronale Markierung zusätzliche Informationen, wie neuronale kombiniert werden können charakterisiert werden. 7,8 Ein weiterer Vorteil dieser Methode ist, dass es in Schritten erlernt werden kann. Zum Beispiel können intrazelluläre Aufnahme zunächst durchgeführt werden, gefolgt von intrazellulären Färbung mit Immunzytochemie oder retrograde neuronale Markierung nach Beherrschung der ersten Methode hinzugefügt. Vielleicht die größte Einschränkung der Technik ist, dass nur eine kleine Anzahl von Neuronen in einem Experiment kann beschriftet werden. In der Regel zwei vor drei Neuronen eines bestimmten physiologischen Typus sind zunächst gekennzeichnet. Sobald die möglichen Zusammenhang zwischen der Physiologie und Morphologie formuliert ist, sind weitere Experimente verwendet werden, um sorgfältig zu prüfen, diese Beziehung in Experimenten, in denen nur ein einzelnes Neuron ist beschriftet.
Der wichtigste Schritt für den Erfolg dieser Methode ist die Aufrechterhaltung elektrophysiologischen intrazelluläre Aufnahme Stabilität. Recording Stabilität variiert stark abhängig von der Lage innerhalb des Gehirns des Neurons unter studieren, sondern eine Reihe von Manipulationen können zur Aufnahme Stabilität zu erhöhen. Ein Pneumothorax durchgeführt werden kann und das Tier künstlich beatmet, um respiratorische Pulsationen zu reduzieren. Stabilität kann durch Anlegen einer positiven endexspiratorischen Druck von etwa 1 cm H 2 O. erhöht werden Wenn die Region von Interesse innerhalb des Gehirns erreicht wird, kann die Stabilität durch Hyperventilieren das Tier durch eine Verringerung der Atemvolumen und die Erhöhung der Atemfrequenz erhöht werden. Einige Studien zur Elektrophysiologie haben warme Agar über das Gehirn aufgetragen und kanülierten der Blase; diese Verfahren sind nicht wirksam bei der Erhöhung neuronalen Aufnahme Stabilität im Hirnstamm. Es ist wichtig, darauf hinzuweisen, dass die Injektion Zeiten brauchen nicht zu lang sein. Gute Ergebnisse lassen sich mit Einspritzzeiten von ca. 5 Minuten erreicht werden. Aufgrund der geringen Größe der Spitze der Mikroelektroden, Bruch der Elektrode im Gehirn in der Regel nicht zu einem großen Release von Tracer. Deshalb kann die Elektrode ersetzt werden und Neuronen erfolgreich aufgenommen und gefärbt in mehreren hundert Mikrometern der Lage der Elektrode Bruch. Wenn die Elektrode verstopft oder das Recording-Lösung füllt nicht die Spitze der Elektrode ausreichend, wird Lärm stark erhöht werden und die Elektrode ersetzt werden sollte. Testen Elektrodenimpedanz vor dem Einsetzen in das Gehirn stark reduziert unproduktive Elektrode Traktate und spart Zeit. Wenn Sie versuchen, aus einer kleinen Region des Gehirns stereotaktische Positionierung Rekord sind von größter Bedeutung. Ich benutze ein Teleskop befestigt, um die Aufnahme-Tabelle in eine feste stereotaktischen Null zu halten. Das Teleskop ist sehr nützlich, da die Elektrode in den Elektrodenhalter befestigt, um die Aufnahme Tisch und dann betrachtet unter Vergrößerung platziert werden können. Dies ermöglicht eine sehr genaue Platzierung der Mikroelektroden-und Nullstellen von Ersatz-Elektroden.
Eine Reihe von neueren Studien haben juxtacellular neuronalen Kennzeichnung verwendet. 11,12 Mit diesem Verfahren wird eine Elektrode in der Nähe eines Neurons auf die Eigenschaften der neuronalen Aufnahme und eine neuronale Tracer Basis gelegt wird ausgeworfen wird. Eine offensichtliche potenzielles Problem bei dieser Methode ist falsch Kennzeichnung, da von Tracer in den Dendriten und Axonen anderer Neuronen in der Nähe der Elektrode eingebracht werden können. Darüber hinaus können Input-Output-Beziehungen des Neurons nicht ermittelt, da extrazellulär aufgenommenen Aktionspotentiale nicht nur durch synaptische Eingang des Neurons, sondern durch intrinsische Eigenschaften des Neurons erzeugt werden kann. Mit der Methode hier berichtet, sind Neurone nur bezeichnet, während die Mikroelektroden ist tatsächlich innerhalb der Nervenzelle und somit gibt es keine Zweideutigkeit, die die Vergabe der neuronalen Aktivität auf den gefärbten Neurons. Dies ist besonders wichtig, wenn die Kennzeichnung Axone, weil die Bewegung der Mikroelektrode von wenigen Mikrometern Ergebnisse in falsche Etikettierung. Darüber hinaus können unterschwellige Veranstaltungen wie synaptische Potenziale aus dem aufgespießt Neuron aufgenommen werden.
Zukünftige Studien könnten diese Methode mit evozierte Bewegungen zu kombinieren. Zum Beispiel kortikale Stimulation hervorrufen kann Kaubewegungen und die Aufzeichnung der Stabilität im Hirnstamm sollte intrazelluläre Aufnahme und Färbung von Neuronen in diesen hervorgerufenen Bewegungen zu ermöglichen. Da diese Technik mit minimalen chirurgischen Eingriff durchgeführt werden kann, kann es auch evtl.ible diese Methode verwenden, um Substanzen, die die Genexpression verändern in vivo zu injizieren.
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Disclosures
Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den guidlines und Regulierung, die in der Anleitung für die Pflege und Verwendung von Labortieren (NIH Publication No 86-23, revised 1985) gesetzt und der University of Maryland Animal Care durchgeführt und Verwenden Committee.
Acknowledgments
Ich danke Anthony Taylor für die Erstausbildung in in vivo intrazelluläre Aufnahme und A Brown und David Maxwell für die Hilfe bei der anfänglichen Entwicklung des intrazellulären Maltechnik. Ich danke M. Silver für die Hilfe bei der collocalization Makro. Viele Wissenschaftler, mit denen ich einen Einblick in die Entwicklung dieser Technik einschließlich R. Donga, M. Moritani, P. Luo, R. Ambalavanar zusammengearbeitet. Diese Technik wurde mit erheblicher Unterstützung von NIH gewährt DE10132, DE15386 und RR017971 entwickelt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| electromagnetic vibrator | Ling Dynamic Systems | V101 | |
| signal generator | Feedback Systems | PFG605 | capable of producing trapezoidal output signal |
| electrode glass | Sutter Instrument Co. | AF100-68-10 | with filament |
| electrode puller | Sutter Instrument Co. | Model P-2000 or P-80 | |
| biotinamide | Vector Laboratories | SP-1120 | stored at 4°C |
| Texas Red avidin DCS | Vector Laboratories | A-2016 | |
| tetramethlyrhodamine | Molecular Probes, Life Technologies | D-3308 | 3000 molecular weight, lysine fixable |
| mouse anti-synaptophysin antibody | Chemicon International | MAB5258 | |
| fluorescent Nissl stain | Neurotrace, Life Technologies | N-21480 | |
| electrode tester | Winston Electronics | BL-1000-B | to measure electrode impedance |
| electrometer | Axon Instruments | Axoprobe 1A, Axoclamp 2B |
References
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